一种粉唑醇人工抗原、单克隆抗体、杂交瘤细胞株及其应用

1.本发明涉及农药残留免疫检测技术领域，尤其是指一种粉唑醇人工抗原、单克隆抗体、杂交瘤细胞株及其应用。


背景技术：

2.粉唑醇的英文通用名为：flutriafol，cas:76674-21-0，化学名称： (rs)-2,4'-二氟-a-(1h-1,2,4-三唑-1-甲基)二苯基甲醇。粉唑醇是一种三唑类杀菌剂，具有广谱的杀菌活性，内吸性强，在植物体内向顶部传导，对病害有保护和治疗作用。可防治禾谷类作物(主要包括小麦、大麦、黑麦、玉米等) 茎叶、穗部病害以及土传病害和种传病害，如白粉病、锈病、云纹病、叶斑病、网斑病、黑穗病等。对谷物白粉病有特效,尤其对麦类白粉病的孢子堆具有铲除作用。主要作用机理为可有效抑制麦角甾醇的生物合成，能引起真菌细胞壁破裂，对担子菌和子囊菌引起的许多病害具有良好的保护和治疗作用，并兼有一定的熏蒸作用。为了提高农作物产量与质量常常需要使用农药，农药的不规范使用使得农作物中农药残留超标，对身体健康造成危害。
3.目前，粉唑醇检测方法主要为仪器检测，常用的有气相色谱法、液相色谱法和气相色谱-质谱法。尽管这些基于色谱的方法具有很高的灵敏度和特异性，存在一些缺点，例如需要彻底的样品净化，高溶剂消耗，昂贵的设备以及熟练的技术人员。因此，需要一种快速，简便的检测粉唑醇残留物的方法。
4.酶联免疫吸附试验(elisa)是一种极为高效、灵敏、快速的检测方法，检测时对样本的前处理简单、纯化步骤少、分析容量大、检测成本低而且操作简便，适用于大量样本的现场快速检测，因此在药物残留分析中得到了广泛应用。而使用酶联免疫法检测粉唑醇的前提是得到对粉唑醇具有高特异性和高灵敏度的单克隆抗体，因此，找到一种制备对粉唑醇具有高特异性和高灵敏度的单克隆抗体的方法十分关键。发明人尝试通过杂交瘤细胞制备粉唑醇单克隆抗体，但在制备能分泌粉唑醇单克隆抗体的杂交瘤细胞株的过程中，如何制备粉唑醇半抗原和完全抗原和如何使小鼠产生强免疫效应，还需进一步的研究；如何使得制备出的杂交瘤细胞株能够成功分泌出粉唑醇单克隆抗体，还需进一步的研究；如何使得分泌出的粉唑醇单克隆抗体特异性强、灵敏度高，也还需进一步的研究。


技术实现要素：

5.为解决上述技术问题，本发明提供了一种粉唑醇人工抗原、单克隆抗体、杂交瘤细胞株及其应用。此杂交瘤细胞株分泌的粉唑醇单克隆抗体对粉唑醇具有较好的检测灵敏度(ic
50
值为1.02ng/ml)，可以用于建立粉唑醇的免疫学检测方法，检测食物中粉唑醇的残留。
6.本发明的第一个目的在于提供一种分泌粉唑醇单克隆抗体的杂交瘤细胞株（单克隆细胞株），所述杂交瘤细胞株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.45107，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路 1号院3号，保藏日期为2022年03月03日。
7.本发明的第二个目的在于提供所述的分泌粉唑醇单克隆抗体的杂交瘤细胞株的制备方法，包括以下步骤：
8.步骤1：利用粉唑醇半抗原制备粉唑醇完全抗原，将获得的粉唑醇完全抗原与弗氏佐剂或不完全弗氏佐剂乳化，制备成免疫原；
9.步骤2：将得到的免疫原通过颈背部皮下多点注射入动物体内，进行多次免疫，首次免疫选用完全弗氏佐剂，加强免疫选用不完全弗氏佐剂；
10.步骤3：将经过上述免疫过程的动物进行采血，通过间接elisa检测动物血清免疫效价和免疫抑制能力，筛选出血清中对粉唑醇灵敏度高的动物；
11.步骤4：将筛选出的动物通过腹腔注射进行冲刺免疫，冲刺免疫采用不含弗氏佐剂的粉唑醇完全抗原；
12.步骤5：将步骤3中冲刺免疫后的动物的脾细胞和骨髓瘤细胞进行融合，得到所述杂交瘤细胞株。
13.在本发明的一个实施例中，所述粉唑醇半抗原分子结构如下：
14.在本发明的一个实施例中，所述粉唑醇完全抗原的分子结构如下：
15.在本发明的一个实施例中，利用粉唑醇半抗原制备粉唑醇完全抗原的方法如下：将粉唑醇半抗原、n-羟基琥珀酰亚胺及1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)溶解于有机溶剂中，混合反应，得到活化的粉唑醇半抗原溶液，即a液；将偶联用蛋白用碳酸盐缓冲溶液稀释，得到b液；将 a液加入到b液中进行反应，得到所述粉唑醇完全抗原。
16.在本发明的一个实施例中，所述偶联用蛋白选自牛血清白蛋白、鸡卵清白蛋白、人血清白蛋白、钥孔血蓝蛋白或人工合成的多聚赖氨酸。
17.在本发明的一个实施例中，所述粉唑醇半抗原、n-羟基琥珀酰亚胺及 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的摩尔比为1:1-5:1-5。
18.在本发明的一个实施例中，所述动物选自balb/c小鼠。
19.在本发明的一个实施例中，所述步骤2、4中的首次免疫与加强免疫之间间隔一个
月，加强免疫之间间隔21天，加强免疫与冲刺免疫之间间隔 18～21天。
20.在本发明的一个实施例中，所述步骤2、4中的首次免疫剂量为100μg/ 只，加强免疫剂量为50μg/只，冲刺免疫剂量为25μg/只。
21.在本发明的一个实施例中，所述步骤2、4中的免疫过程，包含1次首次免疫、至少4次加强免疫、1次冲刺免疫；
22.在本发明的一个实施例中，所述步骤3中的采血为第3次免疫过程结束后第7天进行采血。
23.在本发明的一个实施例中，所述步骤5中的细胞融合是在冲刺免疫结束 3～5天后进行。
24.在本发明的一个实施例中，所述步骤5中的细胞融合是通过聚乙二醇 (peg4000)法进行的。
25.在本发明的一个实施例中，所述步骤5中的培养基为rpmi-1640培养基。
26.在本发明的一个实施例中，所述步骤5中的亚克隆次数为4次。
27.本发明的第三个目的在于提供所述杂交瘤细胞株在制备粉唑醇单克隆抗体中的应用。
28.本发明的第四个目的在于提供一种粉唑醇单克隆抗体，所述粉唑醇单克隆抗体是由所述的保藏编号为cgmcc no.45107的杂交瘤细胞株分泌所得。
29.本发明的第五个目的在于提供一种粉唑醇单克隆抗体的制备方法，步骤如下：取balb/c小鼠，腹腔注射石蜡油，再腹腔注射保藏编号为cgmccno.45107的杂交瘤细胞株，注射后收集腹水，将腹水纯化，将获得的单克隆抗体低温保存。
30.在本发明的一个实施例中，粉唑醇单克隆抗体的制备方法的具体操作：所述方法为取8-10周龄balb/c小鼠，每只小鼠腹腔注射石蜡油1ml，7 天后每只小鼠腹腔注射1
×
106个细胞/ml保藏编号为cgmcc no.45107的杂交瘤细胞株，从第7天开始收集腹水，将腹水通过辛酸-硫酸铵法纯化，获得的单克隆抗体置于-20℃保存。
31.本发明的第六个目的在于提供一种组合物，包括所述的粉唑醇单克隆抗体。
32.本发明的第七个目的在于提供一种试剂盒，包括所述的粉唑醇单克隆抗体或所述组合物。
33.本发明的第八个目的在于提供所述的粉唑醇单克隆抗体、中所述的组合物或所述的试剂盒在识别粉唑醇中的应用。
34.本发明所述杂交瘤细胞株分类命名单克隆细胞株。
35.本发明的上述技术方案相比现有技术具有以下优点：
36.(1)本发明获得的粉唑醇单克隆抗体，对粉唑醇有较好的检测灵敏度 (ic
50
值为1.02ng/ml)；
37.(2)本发明获得的粉唑醇单克隆抗体细胞株可以用于免疫分析检测。
附图说明
38.为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中
39.图1是本发明粉唑醇单克隆抗体对粉唑醇的抑制标准曲线。
具体实施方式
40.下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
41.下述实施例中涉及的培养基如下：
42.rpmi-1640培养基(mg/l)：l-精氨酸290、l-门冬酰胺50、l-门冬氨酸 20、l-胱氨酸二盐酸盐65.15、l-谷氨酸20、甘氨酸10、l-组氨酸15、l-羟脯氨酸20、l-异亮氨酸50、l-亮氨酸50、l-赖氨酸盐酸盐40、l-甲硫氨酸 15、l-苯丙氨酸15、l-脯氨酸20、l-丝氨酸30、l-苏氨酸20、l-色氨酸5、 l-酪氨酸23.19、l-缬氨酸20、对氨基苯甲酸1、硝酸钙100、无水硫酸镁48.84、无水磷酸二氢钠676.13、氯化钾400、氯化钠6000、葡萄糖2000、还原谷胱甘肽1、酚红5、l-谷氨酰胺300、生物素0.2、d-泛酸钙0.25、叶酸1、i-肌醇35、烟酰胺1、氯化胆碱3、盐酸吡哆醇1、核黄素0.2、盐酸硫胺素1、维生素b120.005、碳酸氢钠2000。
43.下述实施例中涉及的试剂如下：
44.碳酸盐缓冲液：称取na2co31.59 g，nahco32.93 g，分别溶于少量双蒸水后混合，加双蒸水至约800ml混匀，调ph值至9.6，加双蒸水定容至1000 ml，4℃贮存备用。
45.磷酸盐缓冲液：8.00g nacl，0.2g kcl，0.2g kh2po4，2.9gna2hpo4·
12 h2o，溶于800ml纯水中，用naoh或hcl调ph到7.2～7.4，定容至1000ml；
46.磷酸缓冲液t：含0.05％吐温20的磷酸缓冲液；
47.抗体稀释液：含0.1％明胶的磷酸缓冲液；
48.tmb显色液：a液：na2hpo
4.
12h2o 18.43g，柠檬酸9.33g，纯水定容至 1000ml；b液：60mg tmb溶于100ml乙二醇中。a、b液按5：1混合即为tmb显色液，使用时再进行混合。
49.下述实施例中涉及的检测方法如下：
50.粉唑醇抑制率检测方法：通过棋盘试验选择ic-elisa中最合适的抗原和抗体浓度。用碳酸盐缓冲液将抗原稀释至0.01，0.03，0.1和0.3μg/ml，并用抗体稀释液将抗体稀释至0.03，0.1，0.3和1μg/ml。选择最佳工作点后，将粉唑醇标准品稀释为8个浓度(0，0.037，0.111，0.333，1，3，9和27ng/ml)，按照ic-elisa操作步骤，最后用originpro 8.5做图(结果如图1所示)，获得粉唑醇标准抑制曲线，计算ic
50
。
51.粉唑醇交叉反应测定方法：用碳酸盐缓冲液将抗原稀释至0.01，0.03，0.1 和0.3μg/ml，并用抗体稀释液将抗体稀释至0.03，0.1，0.3和1μg/ml，采用 ic-elisa进行测定，加入不同结构类似物的标准溶液，测定所制备的粉唑醇单克隆抗体对结构类似物的交叉率(结果如表1所示)。
52.实施例1：粉唑醇半抗原的合成
53.由于粉唑醇小分子不具有免疫原性，不能刺激小鼠产生免疫应答，进而产生抗体，因此需通过蛋白连接技术将粉唑醇偶联到蛋白上，使其获得免疫原性；蛋白偶联技术中常用的活泼基团有氨基，羧基，羟基，巯基等，鉴于粉唑醇分子结构式中不含有这些活泼基团，因此对粉唑醇进行衍生。
54.将200mg粉唑醇溶解在5ml无水吡啶中，加入80mg丁二酸酐，溶解搅拌，再加入10mg 4-二甲氨基吡啶。密封后，100℃搅拌72h，反应物氮气吹干。加入5ml水，以6mol/l hcl溶液调节ph值为3。再加入5ml二氯甲烷萃取3次，收集有机相。提取液经无水硫酸钠干燥后，减压浓缩，得少量黄色粘稠蜡状固体，吹干后即得到粉唑醇半抗原。
55.实施例2：粉唑醇免疫原的合成
56.称取9.2mg粉唑醇半抗原，4.4mg n-羟基琥珀酰亚胺，溶解于200μl n,n
‑ꢀ
二甲基甲酰胺中，室温搅拌反应10min；再称取8.4mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3
‑ꢀ
乙基碳二亚胺盐酸盐，加入到粉唑醇半抗原溶液中，室温搅拌反应6-8h，进行活化。取6mg钥孔血蓝蛋白，加入到3ml 0.01m碳酸盐缓冲液，充分溶解，将活化的半抗原缓慢加入到溶解了klh的稀释液中，室温搅拌过夜。然后用0.01m磷酸缓冲液溶液透析，除去未反应的小分子物质，得到较为纯净的完全抗原，并通过紫外吸收扫描方法进行鉴定。
57.实施例3：粉唑醇包被原的合成
58.将4.5mg粉唑醇半抗原和3.1mg n-羟基琥珀酰亚胺溶解于200μl n,n
‑ꢀ
二甲基甲酰胺中，室温搅拌反应10min；将4.3mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶解于上述溶液中，室温搅拌进行反应6-8h，得到半抗原活化液；将6mg牛血清白蛋白溶解于碳酸盐缓冲液中；将半抗原活化液缓慢加入到蛋白稀释液中，室温搅拌过夜。然后，用0.01m磷酸缓冲液溶液透析反应液，除去未反应的小分子物质，得到包被原。
59.实施例4：分泌粉唑醇单克隆抗体的杂交瘤细胞株的制备
60.1、动物免疫的获得
61.将粉唑醇完全抗原与等量弗氏佐剂混合乳化后，对balb/c小鼠进行颈背部皮下多点注射免疫(冲刺免疫除外)；首次免疫用完全弗氏佐剂，剂量为100 μg/只；多次加强免疫用不完全弗氏佐剂且剂量减半即为50μg/只；冲刺免疫不用佐剂，直接用生理盐水稀释后腹腔注射，剂量再减半即为25μg/只；首次免疫与第二次加强免疫之间间隔一个月，多次加强免疫之间间隔21天，冲刺免疫与最后一次加强免疫之间间隔18-21天；通过间接竞争酶联免疫法 (ic-elisa)观测小鼠免疫效果即检测小鼠血清的效价和抑制；
62.2、细胞融合
63.在冲刺免疫三天后，按照常规peg(聚乙二醇，分子量为4000)方法进行细胞融合，具体步骤如下：
64.a、颈椎脱臼法处死小鼠后，立即放入75％酒精中消毒，浸泡5min左右，无菌操作取出小鼠的脾脏，用注射器的胶头适度研磨并通过200目细胞筛网得到脾细胞悬液，收集，离心(1200rpm，8min)，用rpmi-1640培养基洗涤脾细胞三次，最后一次离心后，将脾细胞稀释到一定体积，计数，备用；
65.b、收集sp2/0细胞：融合前7-10天，将sp2/0瘤细胞用含10％胎牛血清 rpmi-1640培养基在5％co2培养箱中进行扩增，融合前要求sp2/0瘤细胞数量达到1～4
×
107，保证融合前sp2/0瘤细胞处于对数生长期，融合时，收集瘤细胞，悬浮于rpmi-1640基础培养液中，进行细胞计数；
66.c、融合过程7min：第1min，将1ml的peg 4000由慢到快滴加到细胞中；第2min，静置；第3min和第4min，在1min内滴加1ml rpmi-1640 培养基；第5min和第6min，在1min内滴加2ml rpmi-1640培养基；第7 min，每10s滴加1ml的rpmi-1640培养基。除第2min，其他时间不断晃动溶液。然后37℃温浴5min；离心(800rpm，8min)，弃上清，重悬入含 20％胎牛血清，2％的50
×
hat的rpmi-1640筛选培养液中，按照200μl/孔加到96孔细胞板，置于37℃，5％co2培养箱中培养。
67.3、细胞筛选与细胞株建立
68.在细胞融合后的第3天对融合细胞进行rpmi-1640筛选培养液半换液，第5天进行用含20％胎牛血清，1％的100
×
ht的rpmi-1640过渡培养液进行全换液，在第7天取细胞上清进行筛选。
69.筛选分两步：第一步先用ic-elisa法筛选出阳性细胞孔，第二步选用粉唑醇为标准品，用ic-elisa法对阳性细胞进行抑制效果测定。
70.选择对粉唑醇标准品有较好抑制的细胞孔，采用有限稀释法进行亚克隆，七天后用同样的方法进行检测。
71.按上述方法进行至少三次亚克隆，最终获得粉唑醇单克隆抗体细胞株。
72.实施例5：粉唑醇单克隆抗体的制备与鉴定
73.取8-10周龄balb/c小鼠，每只小鼠腹腔注射无菌石蜡油1ml；7天后每只小鼠腹腔注射1
×
106粉唑醇杂交瘤细胞，从第七天开始收集腹水，将腹水通过辛酸-饱和硫酸铵法进行抗体纯化。
74.在偏酸条件下，正辛酸可以沉淀腹水中除igg免疫球蛋白外的其他杂蛋白，然后离心，弃沉淀；再用等量饱和度的硫酸铵溶液沉淀igg型的单克隆抗体，离心，弃上清，用0.01m的磷酸缓冲溶液(ph 7.4)溶解后，透析脱盐，最终得到纯化后的单克隆抗体置于-20℃保存。
75.使用间接竞争elisa，测得粉唑醇单克隆抗体的ic
50
值为1.02ng/ml，说明对粉唑醇有很好的灵敏度，可用于粉唑醇免疫分析检测。
76.实施例6：粉唑醇单克隆抗体的应用
77.将杂交瘤细胞株通过体内腹水制备的单克隆抗体应用于粉唑醇的elisa 添加回收试验，具体步骤如下：
78.(1)将用碳酸盐缓冲液稀释好的浓度为0.1μg/ml的包被原包被96孔酶标板，每孔100μl，37℃烘2h后，用磷酸缓冲液t洗液洗板三次，每次每孔200μl，每次3min，拍干；
79.(2)用含0.2％明胶的碳酸盐缓冲液进行封闭，每孔200μl，37℃烘2h，用磷酸缓冲液t洗液洗板三次，每次每孔200μl，每次3min，拍干；
80.(3)用磷酸盐缓冲液(磷酸缓冲液)分别配置0，0.037，0.111，0.333， 1，3，9和27ng/ml的粉唑醇标准溶液，将标准溶液以及待检测样品提取液，分别加入到已经封闭好的酶标板中，每孔50μl，每个样品重复3个孔，再每孔加入50μl稀释至0.1μg/ml的粉唑醇单克隆抗体，37℃反应30min后，洗板拍干；
81.(4)每孔加入100μl用含0.1％明胶的磷酸缓冲液以1:3000稀释的hrp 标记的羊抗鼠igg二抗，37℃反应30min后，洗板拍干；
82.(5)每孔加入100μl的tmb显色液，37℃显色15min后，每孔加入 50μl 2m的h2so4终止液，450nm测吸光值；
83.(6)添加回收及样品前处理：
84.选择小麦为检测样品。
85.待测样品经粉碎后过60目的标准筛网，分别称取三份样品，每份1g，向样品中分别添加5ppb、10ppb、50ppb的粉唑醇标准品(根据抗体线性范围及ic
50
设定添加浓度)，加2.5ml水涡旋混匀，静置30min，抽滤。试样中再加入2.5ml丙酮，于电动振荡器上震荡30min，用快速定性滤纸过滤于烧杯中，残渣再用2.5ml丙酮按上法提取一次，用2.5ml丙酮分两次洗涤
残渣，洗液并入烧杯，于50℃水浴上浓缩近干，用5ml的10％丙酮磷酸缓冲液溶液复溶(即稀释了五倍以减少样品基质的影响)。
86.采用间接竞争elisa进行添加回收试验，其回收率分别为97.4％， 92.7％，105.7％。
87.实施例7粉唑醇交叉反应测定方法
88.表1粉唑醇单克隆抗体对结构类似物的交叉反应
[0089][0090]
由表1可知，本发明所得单克隆抗体只对粉唑醇有抑制，ic
50
值为1.02 ng/ml，对类似物的交叉率都小于5％，说明该单克隆抗体具有很高的灵敏度和特异性。
[0091]
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。