一种透明质酸钠双相凝胶及其应用

1.本发明属于胚胎培养技术领域，具体涉及一种透明质酸钠双相凝胶及其应用。


背景技术：

2.卵细胞的发育在滤泡中进行，当第一层滤泡细胞层完全包被住卵细胞后，在卵细胞的外方开始形成非细胞的膜，称为透明带。受精卵在不断的卵裂过程中，其发育潜能的维持需要确保卵裂球之间保持相互的联系以及一定的空间结构。而透明带在维持卵裂间相互联系和空间结构中起着非常关键的作用。在辅助生殖技术实施过程中，会存在透明带缺失或异常的现象；另外在体外操作过程中，透明带结构也存在脱落的现象。缺乏透明带的受精卵利用常规的胚胎培养方法，会导致细胞分裂后卵裂球平铺生长，从而影响胚胎的后期发育潜能。
3.针对无透明带胚胎，目前也有文献报道使用悬滴法和琼脂糖凝胶等方法进行培养获得成功的案例。但在使用中均存在一定的缺陷：悬滴法操作比较复杂，而且培养液的量非常少，很难保证胚胎培养环境的稳定，故其最终所获得的可用胚胎效率仍然较低；使用琼脂糖或其他凝胶状物质虽然可以在一定程度上起到维持胚胎发育空间结构的作用，但由于其本身不透气性，并且强度很难控制，导致胚胎发育效果的稳定性较差，而且琼脂糖等凝胶成分对胚胎发育以及后期着床方面的负面影响也很难评估。
4.因此，急需开发一种能有效维持无透明带受精卵或胚胎发育潜能和稳定性的产品和培养方法。


技术实现要素：

5.基于此，本发明的目的在于提供一种透明质酸钠双相凝胶，其能有效维持无透明带受精卵或胚胎发育潜能和稳定性，使无透明带受精卵或胚胎在培养过程中能正常发育。
6.具体技术方案如下。
7.一种透明质酸钠双相凝胶，所述透明质酸钠双相凝胶由交联透明质酸钠和游离透明质酸钠构成。
8.在一些实施例中，所述透明质酸钠双相凝胶中交联透明质酸钠和游离透明质酸钠的重量比为1：(1.2～6)。
9.在一些实施例中，所述透明质酸钠双相凝胶中交联透明质酸钠和游离透明质酸钠的重量比为1：(1.2～4)。
10.在优选的实施例中，所述透明质酸钠双相凝胶中交联透明质酸钠和游离透明质酸钠的重量比为1：(1.5～3.5)。
11.在更优选的实施例中，所述透明质酸钠双相凝胶中交联透明质酸钠和游离透明质酸钠的重量比为1：(2～3.5)。
12.在一些实施例中，所述交联透明质酸钠由选自丁二醇缩水甘油醚、二乙烯基砜、双磺基琥珀酰亚胺辛二酸酯、3,3
′‑
二硫双磺基琥珀酰亚胺丙酸酯、4,4
′
二硫双磺基琥珀酰亚
胺丁酸酯中的至少一种的交联剂制备而成。
13.在优选的实施例中，所述交联剂选自丁二醇缩水甘油醚。
14.本发明还提供了上述透明质酸钠双相凝胶在无透明带受精卵或胚胎的培养中的应用。
15.本发明还提供了一种哺乳动物无透明带受精卵或胚胎培养方法，包括以下步骤：(1)向培养皿中加入上述透明质酸钠双相凝胶，然后依次在所述透明质酸钠双相凝胶上面覆盖培养液以及矿物油；(2)将所述培养皿置于培养箱中，使所述透明质酸钠双相凝胶的ph值与所述培养液的ph值相同；(3)取出所述培养皿，用拉细的胚胎转移管将哺乳动物无透明带受精卵或胚胎嵌入所述透明质酸钠双相凝胶中，然后将培养皿放入培养箱中继续培养。
16.在一些实施例中，所述培养液选自胚胎培养液、受精液培养液、卵裂胚培养液、囊胚培养液、体外操作培养液中的至少一种。
17.在优选的实施例中，所述培养液选自胚胎培养液。
18.在一些实施例中，所述哺乳动物为小鼠、大鼠、兔、猪、猴、牛、羊、狗或马。
19.本发明提供了一种可以有效维持无透明带受精卵或胚胎发育潜能和稳定性的透明质酸钠双相凝胶，所述透明质酸钠双相凝胶可作为无透明带受精卵或胚胎发育的“支架”，替代透明带对受精卵或胚胎形成约束作用，使其分裂过程能以正常的细胞排列方式进行，有效解决了无透明带受精卵或胚胎在发育过程中由于无法维持空间结构而导致胚胎发育潜能差的难题，从而使无透明带受精卵或胚胎能正常发育。进一步地，发明人还发现，所述透明质酸钠双相凝胶中交联透明质酸钠和游离透明质酸钠的比例会对培养效果产生明显的影响，并优化获得了两者合适的比例，使得所述透明质酸钠双相凝胶既能满足对无透明带受精卵或胚胎的束缚作用，又能满足营养物质交换的需要，从而取得好的培养效果。
20.本发明还提供了利用所述透明质酸钠双相凝胶对哺乳动物无透明带受精卵或胚胎进行培养的方法，所述方法具有操作上更加简单、有效和便利的优点。
附图说明
21.图1为对比例4培养的正常小鼠受精卵的发育状态。
22.图2为本发明实施例1所述透明质酸钠双相凝胶培养的小鼠无透明带受精卵的发育状态。
23.图3为对比例3中常规方法培养的小鼠无透明带受精卵的发育状态。
24.图4为本发明实施例4所述透明质酸钠双相凝胶培养的小鼠无透明带受精卵的发育状态。
25.图5为本发明实施例5所述透明质酸钠双相凝胶培养的小鼠无透明带受精卵的发育状态。
26.图6为对比例1中培养的小鼠无透明带受精卵的发育状态。
27.图7为对比例2中培养的小鼠无透明带受精卵的发育状态。
具体实施方式
28.本发明下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
29.除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。
30.本发明的术语“包括”和“具有”以及它们任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。例如包含了一系列步骤的过程、方法、装置、产品或设备没有限定于已列出的步骤或模块，而是可选地还包括没有列出的步骤，或可选地还包括对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤。
31.本发明提供了一种透明质酸钠双相凝胶，所述透明质酸钠双相凝胶由交联透明质酸钠和游离透明质酸钠构成。
32.透明质酸钠状态包括包括液相和固相。未交联的透明质酸钠是液态的，用交联剂将游离的透明质酸钠连接起来形成网状结构，使透明质酸钠的物理性质发生变化，变成果冻状的固态，即为交联透明质酸钠。既含有交联透明质酸钠又含有游离状态透明质酸钠的凝胶称为透明质酸钠双相凝胶。交联透明质酸钠具有一定的硬度和结构，并且透明质酸钠本身是细胞外基质的主要成分组成，因此其对胚胎发育本身是没有负面作用的。制备交联透明质酸钠使用的交联剂可选自但不限于以下交联剂：丁二醇缩水甘油醚(bdde)、二乙烯基砜(dvs)、双磺基琥珀酰亚胺辛二酸酯(bs3)、3,3
′‑
二硫双磺基琥珀酰亚胺丙酸酯(dtssp)、4,4
′
二硫双磺基琥珀酰亚胺丁酸酯(dtssb)。所述交联透明质酸钠可直接从市面上购买成品，也可根据本领域常规技术手段制备获得。
33.在优选的是实施例中，所述交联剂为丁二醇缩水甘油醚(bdde)。
34.在一些实施例中，所述透明质酸钠双相凝胶中交联透明质酸钠和游离透明质酸钠的重量比为1：(1.2～6)。
35.在一些实施例中，所述透明质酸钠双相凝胶中交联透明质酸钠和游离透明质酸钠的重量比为1：(1.2～4)。
36.进一步地，所述透明质酸钠双相凝胶中交联透明质酸钠和游离透明质酸钠的重量比为1：(1.5～3.5)。
37.在优选的实施例中，所述透明质酸钠双相凝胶中交联透明质酸钠和游离透明质酸钠的重量比为1：(2～3.5)。
38.在更优选的实施例中，所述透明质酸钠双相凝胶中交联透明质酸钠和游离透明质酸钠的重量比为1：3。
39.本发明所述透明质酸钠双相凝胶制备方法如下：将所述交联透明质酸钠打碎后与所述游离透明质酸钠按比例混合，即得所述透明质酸钠双相凝胶。
40.本发明所述透明质酸钠双相凝胶可用于培养无透明带受精卵或胚胎。其可作为无透明带受精卵或胚胎发育的“支架”，替代透明带对受精卵或胚胎形成约束作用。
41.利用本发明所述透明质酸钠双相凝胶对哺乳动物无透明带受精卵或胚胎进行培养，既能为无透明带受精卵或胚胎的发育提供“支架”，又能满足营养物质的交换需求，从而有效维持无透明带受精卵或胚胎的发育潜能和稳定性。
42.在一些实施例中，所述哺乳动物无透明带受精卵或胚胎的培养方法，包括以下步骤：(1)向培养皿中加入上述透明质酸钠双相凝胶，然后依次在所述透明质酸钠双相凝胶上面覆盖培养液以及矿物油；(2)将所述培养皿置于培养箱中，使所述透明质酸钠双相凝胶的
ph值与所述培养液的ph值相同；(3)取出所述培养皿，用拉细的胚胎转移管将哺乳动物无透明带受精卵或胚胎嵌入所述透明质酸钠双相凝胶中，然后将培养皿放入培养箱中继续培养。
43.在一些实施例中，所述步骤(2)中将所述培养皿置于培养箱中至少6h。
44.在一些实施例中，所述培养液选自胚胎培养液、受精液培养液、卵裂胚培养液、囊胚培养液、体外操作培养液中的至少一种。
45.在优选的实施例中，所述培养液选自胚胎培养液。
46.在一些实施例中，所述哺乳动物为卵生哺乳动物，包括但不限于小鼠、大鼠、兔、猪、猴、牛、羊、狗或马。
47.在一些实施例中，所述培养皿可以为普通细胞培养皿、96孔板、48孔板、24孔板、12孔板、4孔皿，以及其他含有固定孔槽的培养皿。
48.在一些实施例中，所述培养箱为二氧化碳培养箱或三气培养箱。
49.下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明。
50.以下实施例使用的交联透明质酸钠购于中国华熙生物；胚胎培养液包括卵裂期培养液和囊胚期培养液，购于瑞典vitrolife公司，卵裂期培养液货号为10128，囊胚期培养液货号为10132。
51.实施例1
52.本实施例提供一种透明质酸钠双相凝胶，所述透明质酸钠双相凝胶由丁二醇缩水甘油醚交联的透明质酸钠(交联透明质酸钠)和游离透明质酸钠构成，且交联透明质酸钠和游离透明质酸钠的重量比为1：3。
53.实施例2
54.本实施例提供一种透明质酸钠双相凝胶，所述透明质酸钠双相凝胶由丁二醇缩水甘油醚交联的透明质酸钠(交联透明质酸钠)和游离透明质酸钠构成，且交联透明质酸钠和游离透明质酸钠的重量比为1：1.5。
55.实施例3
56.本实施例提供一种透明质酸钠双相凝胶，所述透明质酸钠双相凝胶由丁二醇缩水甘油醚交联的透明质酸钠(交联透明质酸钠)和游离透明质酸钠构成，且交联透明质酸钠和游离透明质酸钠的重量比为1：5。
57.实施例4
58.本实施例提供一种透明质酸钠双相凝胶，所述透明质酸钠双相凝胶由丁二醇缩水甘油醚交联的透明质酸钠(交联透明质酸钠)和游离透明质酸钠构成，且交联透明质酸钠和游离透明质酸钠的重量比为1：1。
59.实施例5
60.本实施例提供一种透明质酸钠双相凝胶，所述透明质酸钠双相凝胶由丁二醇缩水甘油醚交联的透明质酸钠(交联透明质酸钠)和游离透明质酸钠构成，且交联透明质酸钠和游离透明质酸钠的重量比为1：6.5。
61.利用上述实施例1～5所述的透明质酸钠双相凝胶对小鼠无透明带受精卵进行培养，测试培养效果。
62.同时，实验过程中设置以下对比例：
63.对比例1：使用丁二醇缩水甘油醚交联的透明质酸钠(交联透明质酸钠)对小鼠无透明带受精卵进行培养；
64.对比例2：使用游离透明质酸钠对小鼠无透明带受精卵进行培养；
65.对比例3：使用常规培养方法对小鼠无透明带受精卵进行对照培养；
66.对比例4：使用常规培养方法对正常小鼠受精卵进行培养。
67.本发明培养方法如下：(1)向培养皿中分别加入实施例1～5所述透明质酸钠双相凝胶作为“支架”，然后依次在所述透明质酸钠双相凝胶上面覆盖适量的卵裂期培养液以及矿物油；(2)将所述培养皿放入6％co2细胞培养箱中平衡8h，使所述透明质酸钠双相凝胶和卵裂期培养液达到相同ph值；(3)取出所述培养皿，用拉细的胚胎转移管吸取哺乳动物无透明带受精卵并嵌入步骤(2)获得的培养皿的透明质酸钠双相凝胶支架，使无透明受精卵将被固定在凝胶支架中；然后将培养皿放入细胞培养箱中继续培养。继续培养过程同常规胚胎培养一致，等胚胎发育到融合胚期或桑葚胚期再更换囊胚期培养液。
68.对比例1～2的培养方法：除了步骤(1)中向培养皿中加入的分别是交联透明质酸钠和游离透明质酸钠外，其他均与本发明培养方法一致。
69.对比例3～4中的常规培养方法如下：(1)向培养皿中加入适量的卵裂期培养液，培养液上方覆盖矿物油；(2)将所述培养皿放入6％co2细胞培养箱中平衡8h；(3)用拉细的胚胎转移管吸取小鼠无透明带受精卵放入培养液中；然后将培养皿放入培养箱中继续培养，等胚胎发育到融合胚期或桑葚胚期再更换囊胚期培养液。
70.本发明实施例1～3所述透明质酸钠双相凝胶培养的无透明带受精卵发育状态良好，可正常扩张成囊胚。其中，以实施例1培养效果最好，可获得优质囊胚(图2)。常规方法培养的正常小鼠受精卵(对比例4)发育状态如图1所示，可培养出优质囊胚。常规方法培养的无透明带小鼠受精卵发育状态(对比例3)如图3所示。由此可知，采用本实施例1所培养的无透明带受精卵培养效果与正常受精卵差异不大，均可获得优质囊胚，而常规方法培养的则无法培养出优质囊胚。
71.利用实施例4～5所述透明质酸钠双相凝胶对哺乳动物无透明带受精卵的培养效果如图4～5所示，囊胚能生成，但囊胚发育后无法依靠自身的力量扩张，难以形成优质胚胎。由实施例1～5所述透明质酸钠双相凝胶对无透明带受精卵的培养结果可知，透明质酸钠双相凝胶中交联透明质酸钠和游离透明质酸钠的重量比会影响培养效果，当两者重量比为1：(1.2～6)时，既能满足对无透明带受精卵的束缚作用，又能满足营养物质交换的需要；尤其是两者重量比为1：3(实施例1)时，培养效果更好(图2)。当两者重量比过高时(例如实施例4为1：1)，此时束缚力过强，又会影响营养物质的交换，难以形成优质胚胎(图4)。而当两者重量比过低时(例如实施例5为1：6.5时)，无法有效满足对无透明带受精卵的束缚作用，各卵裂球之间的细胞连接较为松散，也无法形成优质的囊胚(图5)。
72.当仅使用交联透明质酸钠进行培养时(对比例1)，高浓度的交联透明质酸无法有效的交换培养液，导致卵裂球在发育过程中逐渐凋亡，无法发育到囊胚阶段(图6)；当仅使用游离透明质酸钠进行培养时(对比例2)，游离透明质酸与培养液混合后几乎无束缚效果，导致卵裂球之间无法达成紧密的细胞连接，分布比较分散，最终也无法发育到囊胚阶段(图7)。
73.综上所述，本发明所述透明质酸钠双相凝胶和培养方法能有效维持无透明带受精
卵或胚胎发育潜能和稳定性，使无透明带受精卵或胚胎能正常发育。
74.以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对以上实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
75.以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。