珍珠美白抗衰组合多肽和单一美白多肽的制备方法和应用与流程

1.本发明属于化妆品、医美功能肽领域，涉及一类珍珠来源高多肽及其组合物的制备方法及应用。


背景技术：

2.多肽是一种较短的氨基酸链。自然存在的人类肽具有细胞通信功能，如蛋白质调节、细胞增殖、细胞迁移、炎症、血管生成和黑色素生成，同时引起多种生理过程，包括防御、免疫、应激等。自2000年以来，多肽在药妆产品中的使用急剧增加，这些多肽分子的商业潜力很高，特别是对于那些具有化妆品活性的肽序列(例如，抗衰老、抗氧化、美白)。近年来。珍珠深加工产品已被报道具有优良的皮肤活性，兼具美白、抗衰及修护几大美容功能。珍珠作为美容原料来源，其中蕴含独特的珍珠蛋白。通过提取、酶解、超滤等手段利用珍珠类蛋白生产独特的高活性活性肽组合物以及从中筛选特定功能多肽，提升产品功效，是淡水产品深加工领域具有重大意义的跨越。


技术实现要素：

3.第一方面，本发明提供一种多肽。该多肽的氨基酸序列为yslg，其结构如式i所示：
[0004][0005]
在一些实施例中，本发明提供的多肽yslg为美白多肽。
[0006]
第二方面，本发明提供前述yslg的制备方法，所述的多肽该制备方法包括根据氨基酸序列yslg，使用多肽合成仪合成目标多肽；在一些优选实施例中，采用多肽固相合成反应器合成目标多肽。
[0007]
第三方面，本发明将前述提供的多肽用于制备具有黑色素抑制活性的化妆品或药品，在一些实施例中，所述多肽用于制备具有美白功效的化妆品或药品中的应用。
[0008]
第四方面，本发明将前述提供的多肽用于制备具有酪氨酸酶抑制活性的化妆品或药品，在一些实施例中，可以将具有酪氨酸酶抑制活性的yslg用作制备美白化妆品或药品。
[0009]
第五方面，本发明提供一种化妆品组合物，该组合物包括前述所述的多肽yslg。
[0010]
本发明涉及美白抗衰化妆品或药品包括但不限于具有美白功效、抗衰功效、具有治疗或预防黑色素沉着疾病的功效的化妆品或药品，所述黑色素过度沉着疾病选自黄褐斑、雀斑、老人斑、斑点、牛奶咖啡斑、贝克痣、斑痣、蒙古斑、太田痣、获得性双侧太田痣样斑、伊藤痣、蓝痣、交界痣、混合痣、皮内痣、晕痣、先天性黑色素细胞痣、斯皮茨痣、发育不良
性痣、晒斑。
[0011]
本发明提供的所述的高活性多肽yslg具有美白、抗衰等活性，并且是酪氨酸酶抑制剂。
[0012]
第六方面，本发明提供一种活性肽组合物，该活性肽组合物包括前述所述的多肽，且该活性肽组合物从珍珠中提取，提取方法包括如下步骤：
[0013]
1)珍珠粉粗蛋白的提取与酶解：珍珠粉粉碎，加入弱酸反应，过滤取沉淀即为珍珠粗蛋白；
[0014]
取灭菌后的珍珠粗蛋白于40～60℃加入纯水和蛋白酶进行酶解反应，过滤取上清液，得到珍珠蛋白酶解液；
[0015]
2)酶解液的分离纯化：将步骤1)获得的上清液采用超滤膜实验设备进行截留分段，采用超滤膜进行分离操作，取透过液纳滤浓缩；随后取回流罐中截留液体，冷冻干燥，得到高活性肽组合物粉末。
[0016]
在一些实施例中，所述提取方法步骤1)中，所述的蛋白酶为木瓜蛋白酶、中性蛋白酶及胰蛋白酶中的一种或多种。
[0017]
在一些实施例中，所述提取方法步骤2)中，采用的超滤膜为1k da的卷式超滤膜；所采用的纳滤膜为200da的卷式纳滤膜；操作压力在15-25bar之间，优选地，操作压力为20bar；
[0018]
在一些实施例中，所含多肽分子量均在200da～1k da之间。
[0019]
在一些实施例中，所述珍珠为淡水珍珠。
[0020]
第七方面，本发明将前述所述的活性肽组合物用于制备具有黑色素抑制活性的化妆品或药品中的应用。
[0021]
在一些实施例中，将本发明获得高活性多肽组合物以不同的浓度作用于生长于dmem培养基、处于对数生长期的b16细胞。结果表明本发明获得的高活性肽组合物具有显著抑制黑色素的活性，且获得高活性肽在黑色素抑制活性方面显著高于现有使用较广的熊果苷。且本发明获得的高活性肽在质量比为100ppm与1000ppm的抑制活性大致相当。在一些具体的实施例中，本发明获得高活性多肽组合物在1000ppm浓度下其黑色素生成抑制率高达41.9％。
[0022]
市场上现有的多肽在抑制黑色素活性试验中均进行了b16细胞促黑预处理，将其利用本实施例方式进行试验后，几乎没有黑色素抑制活性；在本发明的实施例中，提供的b16细胞为处于自然状态未进行促黑试验的细胞，其更能体现活性肽组合物真实的黑色素抑制活性，更加真实反映高活性多肽组合物的黑色素抑制活性。
[0023]
在一些实施例中，所述活性肽组合物用于制备具有美白功效的化妆品或药品。
[0024]
第八方面，本发明将前述所述的活性肽组合物用于制备具有酪氨酸酶抑制活性的化妆品或药品中的应用；在一些实施例中，将酪氨酸酶抑制剂肽组合物用于皮肤美白。
[0025]
第九方面，本发明将前述所述的活性肽组合物用于制备具有抑制胶原蛋白降解作用的化妆品或药品中的应用。
[0026]
第十方面，本发明将前述所述的活性肽组合物用于制备具有促进胶原蛋白生成作用的化妆品或药品中的应用。
[0027]
在一些实施例中，所述活性肽组合物用于制备具有抗衰老功效的化妆品或药品；
在一些具体地实施例中，将本发明获得的活性肽组合物进行col-i与mmp-1基因表达量测定，结果表明本发明提供的高活性肽组合物具有显著抗衰老活性，且在质量浓度为10ppm达到最好抗衰活性，能抑制基质金属蛋白酶mmp-1基因的表达量至空白组的59.58％，同时促进i型胶原蛋白col-i基因的表达量至空白组的221％。说明本发明提供活性肽组合物在抑制胶原蛋白降解的同时可促进胶原蛋白生成，具有较好的抗衰老效果。本发明通过对珍珠粉的酶解、超滤、冻干等工艺，制备出一类高活性肽组合物，所述的高活性肽组合物具有美白、抗衰等活性，并且是酪氨酸酶抑制剂。筛选出1个美白多肽，其氨基酸序列为yslg。
[0028]
以所述的美白多肽及其组合物为核心，任何对其进行相应的调整或修饰都属于本发明的保护范围。
[0029]
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
[0030]
1、本发明选用淡水珍珠为原料进行粗蛋白提取酶解，经酶解、超滤、纳滤以及冻干后得到具有美白、抗衰活性的活性肽组合物，其黑色素抑制率较高，且活性肽组合物所含的均为小分子肽。
[0031]
2、本发明以黑色素抑制活性为导向，提取珍珠粗蛋白，经酶解、超滤、纳滤及冻干等步骤得到一个具有强力美白以及抗衰老活性的活性肽组合物；采用esi-ls-ms/ms对其分析，经软件模拟与细胞实验验证，得到一个具有美白活性多肽yslg；该多肽yslg在化妆品、医美领域，具有极大的应用价值。
[0032]
3、本发明实现了化妆品功能肽的高效制备与筛选。该方法实施简单，拓展了化妆品功能肽的来源途径。
[0033]
4、本发明实现了珍珠产品的高值化利用，为低值珍珠产品深加工提供可靠依据。
附图说明
[0034]
图1为实施例1获得的高活性肽组合物、熊果苷的黑色素生成抑制活性柱状图；
[0035]
图2为美白多肽(10ppm)黑色素生成抑制活性柱状图。
具体实施方式
[0036]
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
[0037]
实施例1
[0038]
如图1所述，一类珍珠来源高活性肽及其组合物的制备方法，包括以下几个步骤：
[0039]
s1、珍珠粉粗蛋白提取与酶解
[0040]
取淡水珍珠，将珍珠粉粉碎至40目，按料液比1：5加入体积比为25％醋酸，60℃，100rpm 搅拌两小时后纱布过滤，取沉淀即为珍珠粗蛋白；取上述灭菌后的粗蛋白，加入10倍重量于粗蛋白的纯水，加入木瓜蛋白酶于50℃酶解反应并搅拌5h，过滤取上清，得到珍珠蛋白酶解液。
[0041]
s2、酶解液的分离制备
[0042]
(1)取s1获得的珍珠蛋白酶解液，投入超滤膜实验设备原料罐，膜壳中装入1k da卷式超滤膜，关闭浓水出口及其他膜壳阀门，打开超滤通路阀门、浓水回流阀门及清液流出阀门，启动高压泵，待高压泵运行稳定后，旋动压力控制阀门调节压力至20bar，于清液流出阀收集流出清液；
[0043]
(2)超滤膜设备膜壳中装入200da卷式纳滤膜并打开相应阀门、关闭其它膜壳阀门、关闭浓水出后阀门、打开浓水回流阀门及清液流出阀门；将(1)所得流出清液投入设备原料罐，启动高压泵，待高压泵运行稳定后，旋动压力控制阀门调节压力至20bar；待运行至原料罐中液体约1l左右，关闭高压泵并打开浓水流出阀门，于浓水流出阀收集浓缩液随后真空冷冻干燥，得到淡黄色粉末，即为珍珠高活性肽组合物，所含多肽分子量均在200da～1k da之间。
[0044]
实施例2黑色素抑制活性测定
[0045]
样品配制：准备3组pbs缓冲液，使用pbs缓冲液作为空白组；在pbs缓冲液中添加熊果苷作为对照组(熊果苷的质量比为1％)；在一组pbs缓冲液中分别添加不同质量的实施例1样品以作为实验组(活性肽组合物的质量比为1/10000，1/1000，1/100)；
[0046]
将生长于dmem培养基、处于对数生长期的b16细胞，以(10-15)
×
104个/孔细胞数接种于100mm细胞培养皿中，每孔加入10ml培养液，置于37℃、5％ co2浓度的二氧化碳培养箱中孵育。24h后每孔加入1ml上述样品，由于稀释效应，熊果苷在培养液中的浓度为 1000ppm；活性肽组合物在培养液中的浓度分别为10ppm、100ppm、1000ppm。每一浓度设3 个复孔，继续孵育。培养24h后，用胰酶消化收集细胞，弃去上清液，用pbs洗涤2次，每管加300μl含有10％dmso的1n naoh裂解细胞，于80℃水浴30min。吸取100μl细胞裂解液加入96孔板中，用酶标仪在405nm处测定吸光度；具体的实验结果请参阅附图1，结果表明实施例1获得的高活性肽组合物具有显著抑制黑色素的活性，且实施例1获得高活性肽在黑色素抑制活性方面显著高于现有使用较广的熊果苷；同时，实施例1获得的高活性肽在质量比为100ppm与1000ppm的抑制活性大致相当。在1000ppm浓度下其黑色素生成抑制率高达41.9％。
[0047]
此外，本实施例提供的b16细胞为处于自然状态未进行促黑试验的细胞，其更能体现活性肽组合物真实的黑色素抑制活性。市场上现有的多肽在抑制黑色素活性试验中均进行了促黑预处理，将其利用本实施例方式进行试验后，几乎没有黑色素抑制活性。
[0048]
实施例3 col-i与mmp-1基因表达量测定
[0049]
样品配制：准备pbs缓冲液作为空白组。准备活性肽组合物pbs溶液，其质量/体积浓度为1/1000；1μl活性肽组合物pbs溶液，其质量/体积浓度为1/100；1μl活性肽组合物 pbs溶液，其质量/体积浓度为1/10；以上3组溶液作为实验组。vc的pbs溶液，其质量/ 体积浓度为1/10，作为阳性组。
[0050]
将生长于fm完全培养基、处于对数生长期的成纤维细胞，以5
×
104个/孔细胞数接种于6 孔细胞培养板中，每孔培养液100μl，置于37℃、5％ co2浓度的二氧化碳培养箱中孵育。24h 后分别加入以上样品1μl，形成空白组(pbs缓冲液)、阳性组(vc的pbs溶液，在培养液中的最终浓度为1000ppm)、实验组(不同浓度活性肽组合物的pbs溶液，其在培养液中的最终浓度分别为10ppm、100ppm及1000ppm)，继续孵育。次日，对实验组进行30mj的 uv能量照射，继续培养。培养24h后，进行各组rna提取，反转录成cdna进行rt-pcr。
[0051]
具体的实验结果请参阅表2与表3，结果表明实施例1获得的高活性肽组合物具有显著抗衰老活性，且在质量浓度为10ppm达到最好效果，能抑制基质金属蛋白酶mmp-1基因的表达量至空白组的59.58％，同时促进i型胶原蛋白col-i基因的表达量至空白组的221％。说明活性肽组合物在抑制胶原蛋白降解的同时可促进胶原蛋白生成，具有较好的抗衰老效果。
[0052]
实施例4珍珠来源高活性肽的鉴定
[0053]
(1)样品还原烷基化：将粉末样品溶解于ddh2o，于适量样品中加入dtt溶液使其终浓度为10mmol/l，于56℃水浴中还原1h。入iaa溶液使其终浓度为50mmol/l，避光反应40min。使用脱盐柱脱盐，于45℃真空离心浓缩仪中挥干溶剂。
[0054]
(2)液质联用分析：色谱参数为：300μm i.d.
×
5mm,packed with acclaim pepmap rplcc18；5μm,预柱、2)150μm i.d.
×
150mm,packed with acclaim pepmap rplc c18,1.9μm, 分析柱；流动相分别为0.1％甲酸(a相)、0.1％甲酸+80％ acn(b相)；600nl/min 流速；分析总时间66min。4％-8％b(0-2min)、8-28％b(2-45min)、28％-40％b(45-55min)、 40％-95％b(55-56min)、95％b(56-66min)。一级质谱参数为resolution：70,000、agctarget： 3e6、maximumit：100ms、scanrange：100to1500m/z；二级质谱参数为resolution：17,500、 agctarget：5e4、maximumit：50ms、topn：20、nce/steppednce：28。质谱采集的raw 文件，经过软件peaks studio8.5 de novo检索，得到肽段列表，且所含多肽分子量均在 200da～1k da之间。
[0055]
实施例5多肽与蘑菇酪氨酸酶(2y9x)分子对接模拟
[0056]
使用分子对接软件discovery studio 2019对所得到的低分子肽序列进行美白活性筛选。受体蛋白2y9x下载自pdb数据库，使用上述软件打开后对蛋白进行预处理，处理过程分别为去除水分子、给蛋白加氢、清理蛋白和准备蛋白。使用chemdraw 20.0绘制多肽结构并保存为sdf格式，于discovery studio 2019中打开并准备配体，进行对接筛选，默认参数下选择“libdock”对接方式。对接成功则认为该多肽为具有酪氨酸酶抑制活性；
[0057]
发现氨基酸序列为yslg的多肽具有显著的酪氨酸酶抑制活性。
[0058]
实施例6多肽yslg的合成
[0059]
在多肽固相合成反应器中加入100mg trityl树脂，用dcm浸泡5min溶胀；fmoc-l
‑ꢀ
甘氨酸-oh溶解于5ml dcm，再加入n,n-二异丙基乙胺(diea)，充分溶解后，加入到装有树脂的容器中，鼓氮气充分搅拌反应60min；用10ml n,n-二甲基甲酰胺(dmf)洗涤树脂，去掉滤液，保留树脂，一共洗5次；加入5ml 20％哌啶(piperidine)的dmf溶液至树脂中，鼓氮气充分搅拌，反应20min脱去fmoc保护基；将fmoc-l-异亮氨酸-oh， o-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐(hbtu)，diea加入5ml dmf中充分溶解，将上述溶液加入树脂中，鼓氮气充分搅拌反应60min；用10ml n,n-二甲基甲酰胺(dmf)洗涤树脂，去掉滤液，保留树脂，一共洗5次；加入5ml 20％哌啶(piperidine)的dmf溶液至树脂中，鼓氮气充分搅拌，反应20min脱去fmoc保护基；将fmoc-l-丝氨酸-oh，hbtu， diea加入5ml dmf中充分溶解，将上述溶液加入树脂中，鼓氮气充分搅拌反应60min；用10ml n,n-二甲基甲酰胺(dmf)洗涤树脂，去掉滤液，保留树脂，一共洗5次；加入 5ml 20％哌啶(piperidine)的dmf溶液至树脂中，鼓氮气充分搅拌，反应20min脱去fmoc 保护基；将fmoc-l-酪氨酸-oh，hbtu，diea加入5ml dmf中充分溶解，将上述溶液加入树脂中，鼓氮气充分搅拌反应60min；期间用茚三酮溶液显色反应检测氨基酸偶联反应是否完全；如检测显蓝色，则继续反应；如反应不显色，则反应完成。用10ml dmf洗涤树脂，去掉滤液，保留树脂，一共洗5次；洗涤完的树脂，用5ml dcm再洗涤5次，鼓氮气，抽干dcm；加入5ml切割试剂至树脂中，鼓氮气充分搅拌切割反应50min；过滤处理，收集液体；将液体滴加至40ml冰乙醚中，析出白色固体；离心收集白色固体，弃掉上清液；白色固体溶于水/乙腈(10/90，添加0.1％三氟乙酸)中，液体样品用0.22um滤膜过滤后，进样至hplc中
分离纯化；纯化样品经质谱，hplc检测后，符合纯度要求的样品收集，用冻干机冻干，得到冻干多肽粉末。按上述方法合成得到yslg。
[0060]
实施例7黑色素抑制活性测定(单一多肽)
[0061]
将生长于dmem培养基、处于对数生长期的b16细胞，以(10-15)
×
104个/孔细胞数接种于100mm细胞培养皿中，每孔加入10ml培养液，置于37℃、5％ co2浓度的二氧化碳培养箱中孵育。24h后加入yslg的pbs溶液至其浓度为10ppm，多肽设3个复孔，继续孵育。培养24h后，用胰酶消化收集细胞，弃去上清液，用pbs洗涤2次，每管加300μl 含有10％dmso的1n naoh裂解细胞，于80℃水浴30min。吸取100μl细胞裂解液加入 96孔板中，用酶标仪在405nm处测定吸光度。
[0062]
具体的实验结果请参阅表1，实验结果表明，在10ppm浓度下yslg具有显著的黑色素生成抑制率18.6％。
[0063]
表1活性肽组合物及三种美白多肽黑色素生成抑制率
[0064][0065]
表2活性肽组合物对mmp-1的表达抑制活性
[0066][0067]
表3活性肽组合物对col-i的表达促进活性
[0068][0069]
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的
普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。