一种油菜长链非编码RNA基因及其在提高油菜种子粒重中的应用

一种油菜长链非编码rna基因及其在提高油菜种子粒重中的应用
技术领域
1.本发明属于分子育种领域，具体涉及一种油菜长链非编码rna基因mstrg.22563，本发明还涉及该基因在调控油菜种子粒重中的应用。


背景技术：

2.长链非编码rna(lncrnas)最初被认为是没有任何功能的转录垃圾，自从20世纪80年代末发现h19在哺乳动物中具有rna的功能后，lncrnas在生物体内的作用受到更多的关注。在过去的几十年里，越来越多的lncrnas被发现在维持动物细胞的正常功能中发挥关键作用。最近，许多植物中也发现了大量的lncrnas，如在拟南芥、水稻、棉花、花生、玉米和油菜中分别预测出6480、2224、14749、50873、20163和3181个lncrnas。植物中的一些lncrnas的功能特征与植物的生长、发育以及对非生物和生物压力的反应有关。
3.油菜籽是世界上第三大油料作物，约占全球油料产量的13％。油菜产量构成的三个因素是指单位面积上的角果数、每角果粒数和粒重。所以提高油菜粒重直接影响油菜产量。粒重是受多基因控制的数量性状，同时受到环境和基因型的调控。
4.本发明从油菜中克隆了长链非编码rna基因mstrg.22563，研究表明，将mstrg.22563基因在油菜中过表达可以显著提高油菜的种子粒重，可为油菜高产育种提供理论依据。


技术实现要素：

5.本发明的第一个目的在于提供一种油菜长链非编码rna基因，申请人将其命名为mstrg.22563基因，该基因的核苷酸序列如seq id no:1所示，序列长度为246bp。申请人通过对油菜lncrnas进行大量筛选和鉴定最终得到该基因，可采用pcr技术从油菜基因组、mrna和cdna中扩增以获得。
6.本发明进一步提供一种克隆该基因的方法，包括以下步骤：
7.(1)从油菜种子中提取总rna；
8.(2)反转录成cdna；
9.(3)设计正、反向引物，从cdna中扩增目的基因。
10.其中，正向引物：5
’‑
gcgactagt cgtcgagctcggtagcgtg-3’(seq id no:2)
11.反向引物：5
’‑
gcgttcgaa ccccgttatccttccaccgt-3’(seq id no:3)
12.本发明还提供了含有所述油菜长链非编码rna基因的重组质粒和重组菌。
13.利用本发明提供的油菜长链非编码rna基因、重组质粒或重组菌，可以对油菜进行分子育种并提高油菜种子粒重。
14.本发明进一步提供一种提高油菜种子粒重的方法：使用农杆菌介导的遗传转化方法将含有油菜长链非编码rna基因的过表达重组质粒转化到油菜的基因组中，获得油菜长链非编码rna基因超表达的油菜品种，其中，所述油菜长链非编码rna基因的核苷酸序列如
seq id no:1所示。
15.本发明所使用的载体质粒是指现有技术中已知的、能够在植物中进行表达的任何载体，例如适用于构建本发明过表达重组质粒的载体包括但不限于pmdc83等。
16.本发明的一个特点在于通过获得过表达材料，分析了转化材料的千粒重，发现mstrg.22563正调控油菜种子千粒重。
17.本发明获得的高粒重过表达油菜植株，该植株在油菜高产育种中具有潜在的应用价值。
附图说明
18.图1：mstrg.22563基因扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果。
19.图2：构建的植物表达载体pmdc83-mstrg.22563的质粒图谱。
20.图3：油菜转化单株的qrt-pcr检测。oe4、oe5、oe6、oe7和oe8是基因mstrg.22563的超表达株系。每个株系有3个不同单株，**表示在student’s t test中p《0.01，*表示p《0.05。
21.图4：mstrg.22563在油菜的表型鉴定。利用千粒重仪分析油菜种子的千粒重，oe4、oe5和oe7是基因mstrg.22563的超表达株系。每个株系有8-12个不同单株，*表示在student’s t test中p《0.05。
具体实施方式
22.以下结合具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明。应理解，这些实施例仅用于解释本发明而不是用于限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如工具书《分子克隆：实验室指南》(new york：cold spring harbor laboratory,1989)中所述的条件，或者按照生产商提供的操作手册中建议的方法予以实施。
23.实施例1mstrg.22563基因的克隆
24.(1)rna的提取
25.总rna的提取采用全式金公司的transzol(目录号et101)，提取方案遵从试剂盒使用说明书。需要提前准备的试剂有rnase-free水、氯仿、异丙醇和75％乙醇(由depc处理的水配制)，所用试剂和实验用品均经过depc灭活rna酶处理。具体步骤如下：
26.a.取甘蓝型油菜的发育中种子于液氮中充分研磨直至粉末状，取100mg研磨好的样品转移到1.5ml离心管中，加入1ml transzol，之后上下剧烈震荡使之充分混匀，进行匀浆处理，之后室温静置5分钟；
27.b.向离心管中加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15秒，室温孵育3分钟；
28.c.10，000
×
g 4℃离心15分钟；
29.d.将上层无色的水相转移至新的离心管中(体积大约为0.6ml)，加入0.5ml经过预冷的异丙醇并颠倒混匀，室温孵育10分钟；
30.e.10，000
×
g 4℃离心10分钟，倒去上清，离心管侧壁和底部形成沉淀；向离心管中加入1ml 75％乙醇(depc水配制)，剧烈涡旋；
31.f.7，500
×
g 4℃离心5分钟，去上清，室温晾干沉淀15分钟左右；
32.g.将沉淀溶于50-100μl rna溶解液中，55-60℃孵育10分钟，保存于-80℃冰箱中备用。
33.h.取1μl抽提的总rna在nanodrop下测定rna浓度和质量，依据1.8《od260/od280《2.0鉴定rna纯度。同时取1μl进行1％的琼脂糖凝胶电泳，检测完整性和质量。
34.(2)rna反转录
35.本实验所用的反转录试剂盒是全式金one-step gdnaremoval and cdnasynthesis supermix(目录号ae311-03)。具体实验操作遵从使用说明书：
36.以5μg总rna为模板，依次加入1μl的anchored oligo(dt)18primer，10μl的2
×
es reaction mix，1μl的rt/ri enzyme mix，1μl的gdnaremover，最后用rnase-free water补充至20μl。将以上反应体系轻轻混匀后置于42℃孵育30min，进行合成第一链cdna和去除gdna；之后，85℃加热5秒钟失活rt/ri和gdnaremover。最后，加入180μl rnase-free water溶解合成的cdna。
37.(3)mstrg.22563基因的扩增
38.以上述cdna为模板，用正向引物5
’‑
gcgactagtcgtcgagctcggtagcgtg-3’和反向引物5
’‑
gcgttcgaaccccgttatccttccaccgt-3’扩增得到含有mstrg.22563全长片段。采用i-5
tm 2
×
high-fidelity master mix(tsingke biologica technology)进行pcr扩增。
39.pcr扩增反应体系为:
[0040][0041]
按照上述反应体系配置好反应液于pcr管中，在bio-rad pcr仪上进行扩增，pcr扩增程序为：
[0042][0043]
扩增后产物通过1％琼脂糖凝胶电泳检测(图1)，扩增获得246bp的mstrg.22563全长，pcr扩增产物的挖胶回收使用天根琼脂凝胶dna回收试剂盒。
[0044]
实施例2mstrg.22563基因过表达转化载体的构建
[0045]
(1)对上述获得的mstrg.22563片段用快速限制性内切酶spei和bstbi进行双酶切，本实验所用的限制性内切酶为上海赛默飞世尔科技(中国)有限公司产品。双酶切体系如下:
[0046][0047]
酶切反应在37℃水浴1.5小时。酶切产物利用北京天根生物工程有限公司的通用型dna纯化回收试剂盒(dp130227)进行回收。
[0048]
(2)酶切产物连接到载体质粒pmdc83，连接反应体系如下：
[0049][0050]
连接反应条件：22℃ 3小时。
[0051]
(3)转化大肠杆菌dh5α，筛选阳性克隆后提质粒酶切鉴定，选取3个阳性克隆送样测序，分析结果显示，mstrg.22563基因的序列成功连接上载体，即成功构建了用于转化植株的重组质粒pmdc83-mstrg.22563，质粒信息如图2所示。
[0052]
(4)将构建正确的重组质粒载体导入农杆菌菌株gv3101，挑选阳性单克隆于-80℃冰箱保存。使用电击法转化农杆菌gv3101感受态，具体实验步骤如下：
[0053]
a.用纯水、超纯水、无水乙醇分别清洗电转杯，置于超净台晾干；
[0054]
b.将重组质粒和农杆菌gv3101感受态置于冰上解冻；
[0055]
c.取构建正确的重组质粒1μl，加入到25μl农杆菌gv3101感受态中，轻轻吸打混匀，避免产生气泡；
[0056]
d.将上述混合液沿着杯壁迅速转入已经预冷的电转杯中；
[0057]
e.将电转仪调至1800v，之后用吸水纸擦干电转杯外壁，在1800v电压条件下电击；
[0058]
f.电击成功后，向电转杯中加入200μl无抗lb液体培养基，轻轻吸打几下，之后将溶液转移至1.5ml无菌离心管中，28℃150r/min活化2小时左右；
[0059]
g.将复苏的菌株涂到含有抗生素的lb固体培养基上，于28℃培养箱中倒置培养48小时；
[0060]
h.在平板上挑取单菌落，用载体前引物和目的基因后引物对其进行pcr扩增，1％琼脂糖凝胶电泳检测阳性克隆。
[0061]
i.取阳性菌液加入抗性的lb液体培养基，于28℃，150r/min摇床中扩大培养至od
值达到0.8，加入等体积的50％(v/v)的甘油混匀，将其保存于-80℃冰箱。
[0062]
实施例3遗传转化实验
[0063]
(1)油菜的遗传转化
[0064]
对构建好的过表达载体采用下胚轴暗光培养进行油菜的遗传转化，本发明中用于油菜转化的受体为甘蓝型油菜westar，具体方法如下：
[0065]
a.种子的灭菌：
[0066]
将经过挑选的成熟饱满的甘蓝型油菜
‘
westar’种子倒入培养盒中，用75％的酒精浸泡种子1min左右，时间不能超过5分钟；使用无菌水清洗浸泡后的种子1-2次；加入能够淹没种子的0.15-0.2％升汞溶液(保存于实验室的棕色瓶中，可用实验室5％的母液稀释)，消毒15min；用无菌水清洗种子5-6次。
[0067]
b.播种：
[0068]
用灭过菌的镊子将种子播种于m0培养基，每个培养皿均匀播种36-40粒种子；播完种后将培养皿放在暗光条件下培养7天左右，温度25℃。
[0069]
c.农杆菌的培养：
[0070]
播种五天后，在抗性平板上接种细菌，用经过消毒的接种环蘸取含有目的基因的农杆菌菌液在抗性lb平板上划线；2天后在抗性平板上用牙签或枪头吸取阳性单菌落，置于抗性lb液体培养基中吹打，于28℃，150r/min摇菌。
[0071]
d.外植体的制备和侵染：
[0072]
检测菌液在600nm吸收光条件下的浓度(分光光度计)，测出菌液的od值，od值在0.6-0.8之间为最佳，此时将菌液6000rpm离心10min，弃上清；用与菌液等体积的dm(dilution medium)液体重悬，6000rpm离心10min，弃上清；用与菌液相同体积的dm溶液悬浮。之后取2ml菌液于灭菌的培养皿中，20ml dm溶液对其进行稀释(1：10)；用无菌解剖刀和镊子将暗光培养7天后的幼苗下胚轴切下，切取长度为0.8-1.0cm，切取外植体时尽量一刀切下，保持其切口整齐；将切取下来的外植体放到已配好浓度的菌液中，侵染30min(时间不能过长)，用移液器隔段时间吸打一次，使得切口充分接触菌液。
[0073]
e.愈伤组织的培养：
[0074]
用已灭菌的吸水纸吸干外植体上的菌液，再将外植体转移到m1培养基中，每皿50-60个外植体，暗光条件下培养2天左右，温度25℃；两天后，将外植体转移到诱导愈伤的m2培养基中，光照条件下进行培养(白天16h/夜晚8h)，温度22℃，之后都在光照条件下进行培养；三周后，将生长正常，两端膨大的外植体转到分化培养基m3中，每2-3周继代一次，长出绿芽为止；切下已经有明显基节的绿芽并将其转入培养基m4中进行生根，需要2-4周，待生根后将其移栽至室外大田里，观察植株田间生长表型。所使用的培养基配方见表1。
[0075]
表1下胚轴暗光培养的培养基配方
[0076][0077][0078]
(2)过表达转化单株的鉴定
[0079]
提取获得的油菜过表达转化单株的基因组dna，通过pcr检测外源基因片段的插入，本发明中过表达的骨架载体为pmdc83，在骨架载体上设计引物pmdc83-r(5
’‑
ccagcagctgttacaaactcaag-3’)，通过载体骨架引物与外源片段引物搭配来进行pcr反应(mstrg.22563-f和pmdc83-r)，外源片段引物mstrg.22563-f(5
’‑
gcgactagtcgtcgagctcggtagcgtg-3’)和mstrg.22563-r(5
’‑
gcgttcgaaccccgttatccttccaccgt-3’)，在pcr水平检测转基因苗。
[0080]
pcr反应体系为：
[0081][0082]
pcr反应程序为：
[0083][0084]
对pcr获得的油菜转基因阳性苗进行qrt-pcr，以检测基因表达量。利用transzol试剂盒提取转化单株种子的rna并进行反转录合成cdna(方法同实施例1)，最后用全氏金的perfectstart
tm green qpcr supermix试剂对样品进行荧光定量pcr分析。
[0085]
定量引物利用primer 5软件设计得到，产物大小在100bp-200bp之间，设计好后用参考序列进行blast比对，确保引物mstrg.22563qpcr-f(5
’‑
cgttccaggttaggagttgag-3’)、mstrg.22563qpcr-r(5
’‑
ggtgtacgctgctctgtaaa-3’)的特异性。bnaactin-f(5
’‑
tgttccctggaattgctgaccgta-3’)和bnaactin-r(5
’‑
tgcgaccaccttgatcttcatgct-3’)作为油菜qrt-pcr的内参引物。qrt-pcr反应体系为:
[0086][0087]
qrt-pcr反应程序为：
[0088][0089]
qrt-pcr反应在bio-rad cfx96 real-time system中进行。
[0090]
根据内参引物进行标准化，不同重复间定量变异用delta-deltathreshold cyclerelative quantification(2-δδct)的方法计算。转化植株的表达量分析见图3。
[0091]
(3)遗传转化所得转基因植株的千粒重分析
[0092]
使用千粒重仪，选取500粒以上形态饱满的油菜种子进行计数称量。
[0093]
千粒重结果分析显示，与wt(3.35
±
0.31)相比，mstrg.22563基因的过表达材料千粒重分别为oe4(3.82
±
0.21)、oe5(3.53
±
0.20)和oe7(3.66
±
0.44)，oe材料的千粒重显著上升0.18-0.47g(图4)。这些结果表明，mstrg.22563基因在调控油菜千粒重中确实发挥着重要作用。