一种肝器官芯片模型及其用途的制作方法

1.本发明涉及生物医学工程及微流控技术领域，特别是涉及一种肝器官芯片模型及其用途。


背景技术：

2.肝脏是体内药物和各种外源物质的氧化代谢解毒的重要场所，而肝小叶被认为是肝脏最小的功能单位，其形似多边形。多边形肝小叶的中心是一条中央静脉，外围包含肝门静脉、肝动脉和胆管。每个肝小叶实质是由中央静脉放射的肝细胞组成，并由血管内皮细胞分隔，而邻近肝细胞的根尖表面可形成胆管的通道。肝细胞中由胆固醇产生的胆汁酸被分泌到胆管中，胆汁从肝小叶的胆总管流出，进入肝管，然后经胆囊管进入胆囊，最后经胆总管进入肠道。
3.肝器官芯片则是一种基于3d培养同时搭配微流控系统的特殊芯片技术，是通过利用微流控技术控制流体的流动，结合细胞与细胞间相互作用、基质特性以及生物化学和生物力学特性，在芯片上构建三维的人体肝脏器官生理微系统。研究发现，肝器官芯片的微流控系统可以体外模拟体液流动环境和细胞外环境的浓度变化，通过产生剪应力引发肝细胞极性发展，更有利于提高肝细胞cyp活性和白蛋白分泌等功能，使之越来越接近体内的生理环境。
4.尽管目前在药物研究过程中，通常用哺乳动物实验研究药物对肝脏功能的影响，但是研究数据证明有些动物实验结果有待商榷。因为哺乳动物和人之间背景差异难以消除，造成动物实验不能准确反应药物在人体的真实情况。所以，体外建立更加准确可信的肝脏模型，以便于更真实地研究肝脏的生理和病理发生发展过程以及药物对肝脏的作用就变得紧迫和必要。近年来，针对肝器官芯片的基础研究越来越热，在药物毒性筛选和药理学研究中的应用也越来越被重视。肝器官芯片技术可以更准确和快速地检测药物对人类潜在的毒性和有效性，减少动物实验的时间和经济成本，未来将成为药物筛选的重要手段之一。
5.但是，目前的肝器官芯片研究偏向于“肝细胞-肝窦”横切面的模拟，而忽视了胆管液流的作用和肝小叶系统性生理功能。虽然有少量研究提及器官芯片中胆管的设计，但也只是局限于简单的某一小块肝板再造，无法研究肝板间的信号联系。


技术实现要素：

6.鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种肝器官芯片模型及其用途，用于解决现有技术中的问题。
7.为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种肝器官芯片模型，所述肝器官芯片模型包括顶层芯片、中间层芯片和底层芯片，所述中间层芯片设于顶层芯片和底层芯片之间，所述肝器官芯片模型上设有加样孔、收集孔和细胞培养小室，所述细胞培养小室设于中间层芯片上，所述加样孔、收集孔均与细胞培养小室连通。
8.所述中间层芯片上设有培养液外围通道、培养液灌流通道、胆汁液灌流通道。所述
培养液外围通道与各培养液灌流通道连通。所述培养液灌流通道和胆汁液灌流通道均设有多条，所述培养液外围通道与培养液灌流通道连通，所述胆汁液灌流通道与细胞培养小室连通。
9.所述加样孔自所述顶层芯片延伸至中间层芯片。
10.所述加样孔包括细胞注入孔、培养液注入孔、胆汁液注入孔中的任一种或多种，所述细胞注入孔与细胞培养小室直接连通，所述培养液注入孔依次经培养液外围通道、培养液灌流通道与细胞培养小室连通，所述胆汁液注入孔经胆汁液灌流通道与细胞培养小室连通。
11.所述收集孔包括培养液收集孔、胆汁液收集孔，所述培养液收集孔自所述顶层芯片延伸至中间层芯片，所述培养液收集孔经各培养液灌流通道、培养液外围通道与培养液注入孔连通；所述胆汁液收集孔自所述顶层芯片延伸至底层芯片，所述胆汁液收集孔与胆汁液注入孔连通。
12.各细胞培养小室两两相邻，各细胞培养小室两侧分别通过培养液灌流通道和胆汁液灌流通道与相邻细胞培养小室分隔，所述培养液灌流通道和所述胆汁液灌流通道均为渗透膜结构。
13.所述胆汁液灌流通道末端设有胆汁液引流孔，所述胆汁液引流孔自中间层芯片延伸至底层芯片。
14.所述底层芯片上设有胆汁液收集通道，所述胆汁液收集通道一端与胆汁液收集孔连通，另一端与各胆汁液引流孔连通。
15.本发明还提供所述肝器官芯片模型在药物研发、毒理学、营养学等研究中的用途。
16.如上所述，本发明的肝器官芯片模型及其用途，具有以下有益效果：
17.1)增加了培养液灌流模拟肝窦液流和胆汁液流系统，真实再现肝小叶的生理架构；能再现肝脏器官系统性功能，更加真实地模拟药物或其他物质与肝脏的相互作用；
18.2)可实现肝窦内皮细胞、胆管内皮细胞、纤维细胞和其他免疫细胞等肝脏非实质细胞的共培养，更接近肝小叶的真实生理环境；
19.3)连通氧气监测设备可实现肝小叶的氧分压的分区培养；
20.4)可以提供多个细胞培养小室和液流通道，多细胞共培养的同时还保证培养液和胆汁液的液流环境互不影响，并且实现细胞培养液和胆汁液的回收检测。
附图说明
21.图1为本发明肝器官芯片模型的爆炸视图；
22.图2为本发明肝器官芯片模型顶层芯片的俯视图；
23.图3为本发明肝器官芯片模型中间层芯片的俯视图；
24.图4为本发明肝器官芯片模型中间层芯片的仰视图；
25.图5为本发明肝器官芯片模型底层芯片的俯视图；
26.图6为本发明肝器官芯片模型中间层芯片的培养液灌流通道立体图；
27.图7为本发明肝器官芯片模型中间层芯片胆汁液灌流通道立体图；
28.图8为本发明肝器官芯片模型的胆汁液的液流途径示意图，箭头所指方向即为胆汁液的液流方向；
29.图9为本发明肝器官芯片模型的培养液的液流途径示意图，箭头所指方向即为培养液的液流方向。
30.元件标号说明
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顶层芯片
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中间层芯片
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底层芯片
[0034]
11
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加样孔
[0035]
111
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细胞注入孔
[0036]
112
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培养液注入孔
[0037]
113
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胆汁液注入孔
[0038]
12
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收集孔
[0039]
121
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培养液收集孔
[0040]
122
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胆汁液收集孔
[0041]
21
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细胞培养小室
[0042]
22
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培养液外围通道
[0043]
23
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培养液灌流通道
[0044]
24
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胆汁液灌流通道
[0045]
25
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胆汁液引流孔
[0046]
26
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胆汁液收集通道
具体实施方式
[0047]
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。
[0048]
请参阅图1至图9。须知，本说明书所附图式所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容能涵盖的范围内。同时，本说明书中所引用的如“上”、“下”、“左”、“右”、“中间”及“一”等的用语，亦仅为便于叙述的明了，而非用以限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容下，当亦视为本发明可实施的范畴。
[0049]
如图1所示，本发明提供一种肝器官芯片模型，所述肝器官芯片模型包括顶层芯片1、中间层芯片2和底层芯片3，所述中间层芯片2设于顶层芯片1和底层芯片3之间，所述肝器官芯片模型上设有加样孔11、收集孔12和细胞培养小室21，所述细胞培养小室21设于中间层芯片2上，所述加样孔11、收集孔12均与细胞培养小室21连通。
[0050]
所述顶层芯片1、中间层芯片2和底层芯片3呈三明治结构。
[0051]
所述顶层芯片1为加样和收集层，所述中间层芯片2为灌流培养层，所述底层芯片3为胆汁液收集层。
[0052]
如图3所示，所述中间层芯片2上设有培养液外围通道22、培养液灌流通道23、胆汁液灌流通道24。所述培养液灌流通道23和胆汁液灌流通道24均设有多条，所述培养液外围
通道22与培养液灌流通道23连通，所述胆汁液灌流通道24与细胞培养小室21连通。
[0053]
如图1所示，所述加样孔11自所述顶层芯片1延伸至中间层芯片2。
[0054]
如图2所示，所述加样孔11包括细胞注入孔111、培养液注入孔112、胆汁液注入孔113中的任一种或多种，如图3所示，所述细胞注入孔111与细胞培养小室21直接连通，所述培养液注入孔112依次经培养液外围通道22、培养液灌流通道23与细胞培养小室21连通，所述胆汁液注入孔113经胆汁液灌流通道24与细胞培养小室21连通。
[0055]
所述细胞注入孔111设有一个或多个。在如图2所示的实施例中，所述细胞注入孔111设有多个。优选的，所述细胞注入孔111的个数与细胞培养小室21相等。不同的细胞注入孔111可以添加不同的细胞类型，例如正常肝细胞或肝癌细胞或细胞混样等，多个孔加样过程互不影响，不存在交叉污染。所述细胞注入孔111的个数为6～16个，例如6～8个、8～10个、10～12个、12～14个或14～16个。
[0056]
所述细胞注入孔111的排列方式与细胞培养小室21相匹配。如图2和3所示，细胞注入孔111的位置对应于细胞培养小室21截面积较大的位置，即对应于小培养小室21的外围部分。
[0057]
所述培养液注入孔112设有一个或多个。在如图2所示的实施例中，所述培养液注入孔112设有多个。所述培养液注入孔112设有两个。一个所述培养液注入孔112可与三条培养液灌流通道22连通。
[0058]
所述胆汁液注入孔113设有一个或多个。在如图2所示的实施例中，所述胆汁液注入孔113设有多个。所述胆汁液注入孔113的个数与细胞培养小室21的个数相匹配。优选的，每相邻的两个细胞培养小室21设置一个胆汁液注入孔113。在如图3所示的实施方式中，所述胆汁液注入孔113设有6个。在一较佳实施方式中，多个所述胆汁液注入孔113呈圆形分布。圆形分布的多个所述胆汁液注入孔113便于连接环形胆汁液注入部件，使多个胆汁液注入孔113同时注入胆汁液，这样每个孔内的胆汁液量比较均一。
[0059]
如图1和2所示，所述收集孔12包括培养液收集孔121、胆汁液收集孔122，所述培养液收集孔121自所述顶层芯片1延伸至中间层芯片2，所述培养液收集孔121经各培养液灌流通道23、培养液外围通道22与培养液注入孔112连通；所述胆汁液收集孔122自所述顶层芯片1延伸至底层芯片3，所述胆汁液收集孔122与胆汁液注入孔113连通。
[0060]
如图1-3所示，所述培养液收集孔121设有一个或多个。在如图2所示的实施方式中，所述培养液收集孔121设有一个。一个培养液收集孔121与所有的培养液灌流通道23连通。
[0061]
向所述培养液注入孔112中注入的培养液经培养液外围通道22流入各培养液灌流通道23与相应的细胞培养小室21进行物质交换后，再汇聚至培养液收集孔121。由于培养液收集孔121自所述顶层芯片1延伸至中间层芯片2，所以可在顶层芯片1上收集灌流末端的培养液。
[0062]
所述胆汁液收集孔122设有一个或多个。在如图2所示的实施方式中，所述胆汁液收集孔122设有两个。一个胆汁液收集孔122可与多个胆汁液引流孔25连通。
[0063]
所述细胞培养小室21设有一个或多个。在如图3所示的实施方式中，所述细胞培养小室21设有多个。优选的，所述细胞培养小室21设有12个。在如图3所示的实施方式中，12个细胞培养小室21相邻形成正六棱柱形状。
[0064]
如图3所示，各细胞培养小室21两两相邻，各细胞培养小室21两侧分别通过培养液灌流通道23和胆汁液灌流通道24与相邻细胞培养小室21分隔，所述培养液灌流通道23和所述胆汁液灌流通道24均为渗透膜结构。
[0065]
渗透膜结构的培养液灌流通道23可以使培养液灌流通道23内的培养液渗透至各细胞培养小室21，而且各细胞培养小室21之间也可以进行物质信息交流。
[0066]
在一种实施方式中，渗透膜结构的培养液灌流通道23由pc膜和pdms膜构成。所述pc膜和pdms膜孔径的选择依据共培养细胞类型和大小以及培养液成分选择即可。例如pc膜孔径为0.2-20μm，pdms膜孔径为0.2-20μm。
[0067]
所述细胞培养小室21适用于基质胶或者水凝胶等胶状细胞混合液或者细胞微球或者普通小悬液的细胞的2d和3d培养。
[0068]
在一种实施方式中，所述培养液灌流通道23的宽度不均一。在如图3所示的实施方式中，所述培养液灌流通道23近培养液收集孔段较宽，远培养液收集孔段较窄。宽度不均一的培养液灌流通道23更接近肝小叶肝窦血管的真实形状，从而更真实的模拟肝小叶的肝窦血管。
[0069]
培养液灌流能够模拟肝窦液流。
[0070]
渗透膜结构的胆汁液灌流通道24可使细胞培养小室21内培养物的胆汁酸等代谢物能够渗透至胆汁液灌流通道24，并通过灌流系统排出。在一种实施方式中，渗透膜结构的胆汁液灌流通道24由pdms膜构成。胆汁液灌流通道24的渗透膜膜孔径例如为0.2-20μm。
[0071]
所述胆汁液灌流通道24的宽度不均一。在如图3所示的实施方式中，所述胆汁液灌流通道24近胆汁液注入孔段较窄，远胆汁液注入孔段较宽。宽度不均一的胆汁液灌流通道24更接近胆管的真实形状，从而更真实的模拟肝小叶。
[0072]
所述胆汁液灌流通道24的最宽处细于培养液灌流通道23最窄处。这样设计的主要原因是生理上肝窦血管比胆管宽一些。
[0073]
向胆汁液注入孔113注入的胆汁液经胆汁液灌流通道24与细胞培养小室21进行物质交换后，再经流向底层芯片3。
[0074]
如图3-5所示，所述胆汁液灌流通道24末端设有胆汁液引流孔25，所述胆汁液引流孔25自中间层芯片2延伸至底层芯片3。
[0075]
如图6所示，所述底层芯片3上设有胆汁液收集通道26，所述胆汁液收集通道26一端与胆汁液收集孔122连通，另一端与各胆汁液引流孔25连通。亦即，所述胆汁液注入孔113依次经胆汁液灌流通道24、胆汁液引流孔25、胆汁液收集通道26与胆汁液收集孔122连通。所述胆汁液引流孔25的个数与胆汁液注入孔113的个数以及胆汁液灌流通道24的个数相等，即每个胆汁液注入孔113均具有与其相连通的胆汁液灌流通道24，每个胆汁液灌流通道24末端均设有胆汁液引流孔25。一个胆汁液收集孔122与三个胆汁液引流孔25连通。
[0076]
向各胆汁液注入孔113注入的胆汁液分别经相应的胆汁液灌流通道24与各细胞培养小室21进行物质交换后，流向胆汁液引流孔25，再经胆汁液收集通道26汇聚于胆汁液收集孔122。由于胆汁液收集孔122自顶层芯片1延伸至底层芯片3，因此可在顶层芯片1处收集胆汁液。
[0077]
所述顶层芯片1、中间层芯片2、底层芯片3的长度相等，所述顶层芯片1、中间层芯片2、底层芯片3的宽度相等。长度和宽度相等便于组装后形成规则的形状。所述顶层芯片1
的高度最小，底层芯片3的高度次之，中间层芯片2的高度最高。中间层芯片2最高是便于细胞培养。本发明中对顶层芯片1、中间层芯片2、底层芯片3的长度、宽度、高度的数值，以及各加样孔11、收集孔12、细胞培养小室21、各种液流通道的尺寸不做具体限定，本领域技术人员可根据实际需求定制。在本发明的某些实施方式中，所述顶层芯片1、中间层芯片2、底层芯片3的长度为4-8cm；所述顶层芯片1、中间层芯片2、底层芯片3的宽度为2-3.5cm；所述顶层芯片1的高度为0.2-1cm；底层芯片3的高度为0.2-1cm；中间层芯片2的高度为0.4-1.5cm；所述细胞注入孔111的直径为0.3-0.5cm；培养液注入孔112的注入孔的直径为0.5-0.7cm；胆汁液注入孔113的直径为0.2-0.3cm；所述培养液收集孔121的直径为0.5-1.0cm；所述胆汁液收集孔122的直径为0.5-0.7cm；所述培养液灌流通道23的长度为0.5-1cm、宽度为0.2-1mm；所述胆汁液灌流通道24的长度为0.3-0.8cm、宽度为0.2-1mm；所述细胞培养小室21的高度与中间层芯片2的高度相等。以上数值仅为举例说明肝器官芯片模型的数量级，并不能对肝器官芯片模型的尺寸进行限制。
[0078]
所述肝器官芯片模型采用适合细胞培养的材质制成。在一优选的实施方式中，采用适合细胞培养的透明材质制成。透明材质可以保证肉眼可通过透明材质观察到肝器官芯片模型内的液面以及细胞。
[0079]
所述顶层芯片1、中间层芯片2和底层芯片3通过可逆性恢复材质密封固定连接。可逆性恢复材质便于芯片的组装和拆卸，也便于回收细胞培养小室内的细胞培养物。所述可逆性恢复材料例如为聚羟基甲基丙烯酸乙酯(phema)的聚合物制成的水凝胶、热可逆性明胶、光控可逆粘合剂例如偶氮苯衍生物等。
[0080]
所述肝器官芯片模型的各加样孔和收集孔可接入导管，搭配微流控等动力系统使用。本发明对液流动力来源和流速不做具体限定。
[0081]
本发明还提供所述肝器官芯片模型在药物研发、毒理学、营养学等研究中的用途。
[0082]
具体的，所述用途为在研究药物或其他物质与肝脏的相互作用中的用途。所述药物或其他物质与肝脏的相互作用例如为肝内药物代谢、肝脏对药物代谢的影响或药物对肝脏生理功能的影响、药物的毒理学以及营养学等研究。
[0083]
本发明的肝器官芯片模型的一种使用方法如下：
[0084]
总流程为：先反向灌流排出空气，再正向注入各种液体。
[0085]
具体的，先从培养液收集孔121注入培养液即反向灌流，排出培养液外围通道22内的空气，再缓慢注入血管内皮细胞的细胞悬液至培养液灌流通道23以模拟血管内的生理环境，待血管内皮细胞培养贴壁后再从培养液注入孔112正向灌流培养血管内皮细胞；
[0086]
先从胆汁液收集孔122注入胆汁液即反向灌流，排出胆汁液收集通道26内的空气，再从胆汁液注入孔113正向缓慢注入胆管内皮细胞的细胞悬液，直至细胞悬液填满胆汁液灌流通道24以模拟胆管的生理环境，待细胞培养贴壁后再从胆汁液注入孔113注入胆汁液正向灌流培养胆管内皮细胞。
[0087]
将基质胶或者水凝胶等胶状细胞混合液或者细胞微球通过细胞注入孔111注入细胞培养小室21，待凝固后补充适当体积的培养液，培养液的液面稍低于培养液灌流通道23的液面高度。
[0088]
培养液灌流通道23和胆汁液灌流通道24不限于只注入内皮细胞，根据实验实际需求还可注入其他免疫细胞，如kupffer细胞、pbmc等。
[0089]
本发明的肝器官芯片模型的培养液可以通过外接现有技术中的导管和动力泵实现灌流。具体的，培养液注入孔112连接导管和动力泵，将新鲜培养液从培养液注入孔112导入，新鲜培养液经培养液外围通道22分别经各培养液灌流通道23，汇集至培养液收集孔121，培养液收集孔121同样连接导管或动力泵收集培养液。
[0090]
本发明的肝器官芯片模型的胆汁液可以通过外接现有技术中的导管和动力泵实现灌流。胆汁液注入孔113连接导管和动力泵，新鲜胆汁液从胆汁液注入孔113导入，经相应的胆汁液灌流通道24流至胆汁液引流孔25，再经胆汁液收集通道26流至胆汁液收集孔122，胆汁液收集孔122同样连接导管或动力泵收集胆汁液。
[0091]
综上所述，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。
[0092]
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。