引物探针组合、试剂盒及其检测人ALK、ROS1基因融合的方法与流程

引物探针组合、试剂盒及其检测人alk、ros1基因融合的方法
技术领域
1.本发明涉及c12q1/6851领域，更具体地，本发明涉及引物探针组合、试剂盒及其检测人alk、ros1基因融合的方法。


背景技术：

2.eml4-alk融合基因是肺癌的一个重要的驱动基因，ros1基因与其他基因发生融合后，可激活ros1酪氨酸激酶活性，致使细胞发生恶性转化。通过特异性检测alk基因和ros1基因融合突变，对患者的用药有积极地指导意义。中国专利cn 113373233 a提供了一种包括引物探针混合物的检测eml4-alk融合基因的反应体系，中国专利cn 105506140 b提供了一种用于检测ros1融合基因的引物和荧光探针，然而，目前尚未发现可以同时检测人alk基因和ros1基因融合突变检测试剂盒以及检测体系。


技术实现要素：

3.针对现有技术中存在的一些问题，本发明第一个方面提供了一种引物探针组合，至少包括引物探针组合a，其特异性检测至少一种eml4-alk融合基因；引物探针组合b，其特异性检测至少一种ros1融合基因；引物探针组合c，其特异性检测内参基因。
4.在一种实施方式中，所述引物探针组合物a包括(a)正向引物av1f1、av1f2、av1f3、av2f1、av2f2、av2f3、av2f4、av3f1、av3f2、av3f3、av3f4、av3f5、av3f6、av4f1、av4f2、av5f1、av5f2、av5f3、av5f4、av6f1、av6f2、av6f3、av6f4、av7f1、av7f2、av7f3中一种或多种；(b)反向引物ar1、ar2、ar3、ar4、ar5、ar6中一种或多种；以及(c)探针palkt1、palkt2、palkt3中一种或多种。
5.优选的，本技术中(a)正向引物的核苷酸序列如下表1。
6.表1
7.[0008][0009]
优选的，本技术中(b)反向引物的核苷酸序列如下表2。
[0010]
表2
[0011]
名称核苷酸序列ar1cagcttgtactcagggctcar2gctcagcttgtactcagggar3ttgtactcagggctctgcaar4tagttggggttgtagtcggtar5gcttgctcagcttgtactcar6gctccatctgcatggct
[0012]
优选的，本技术中(c)探针的核苷酸序列如下表3。
[0013]
表3
[0014]
名称核苷酸序列palkt15
‘
荧光标记-ttgctcagcttgtactcagggc-3
‘
猝灭基团palkt25
‘
荧光标记-taccgccggaagcaccag-3
‘
猝灭基团palkt35
‘
荧光标记-gagccctgagtacaagctga-3
‘
猝灭基团
[0015]
在一种实施方式中，所述引物探针组合物b包括(d)正向引物cd74-c6f1、cd74-c6f2、slc34a2-e4f1、slc34a2-e4f2、slc34a2-e4f3、slc34a2-e13f1、slc34a2-e13f2、sdc4-e2f1、sdc4-e2f2、sdc4-e4f1、sdc4-e4f2、sdc4-e4f3、ezr-e10f1、ezr-e10f2、ezr-e10f3、tmp3-e8f1、tmp3-e8f2中一种或多种；(e)反向引物r32r1、r34r1、r35r1中一种或多种；以及
(f)探针pr32t1、pr32t2、pr32t3、pr32t4、pr32t5、pr34t1、pr34t2、pr34t3、pr35t1、pr35t2、pr35t3中一种或多种。
[0016]
优选的，(d)正向引物的核苷酸序列如下表4。
[0017]
表4
[0018]
名称核苷酸序列cd74-c6f1gagcaaaagcccactgaccd74-c6f2gcaaaagcccactgacgctslc34a2-e4f1tcttagtagcgccttccagslc34a2-e4f2tgctccctggatattcttaslc34a2-e4f3tactttttcgtgtgctccctslc34a2-e13f1cataaccattagcagagaggcslc34a2-e13f2taacataaccattagcagagaggcsdc4-e2f1atctgatgactttgagctgtcsdc4-e2f2ctgatgactttgagctgtctggsdc4-e4f1gagaacggaggtcctggcagsdc4-e4f2ctttgagagaacggaggtcsdc4-e4f3cagggcagcaacatctttgaezr-e10f1ggagaagacaaagaaggcaezr-e10f2agacaaagaaggcagagagaezr-e10f3gagttgatgctgcggctgtmp3-e8f1caagctggaaaagacaattgattmp3-e8f2gacccgtgctgagtttg
[0019]
优选的，(e)反向引物的核苷酸序列如下表5。
[0020]
表5
[0021]
名称核苷酸序列r32r1agctttctcccactgtattgr34r1cttctatgccagacaaaggtr35r1tgtcttcgtttataagcactgt
[0022]
优选的，(f)探针的核苷酸序列如下表6。
[0023]
表6
[0024]
[0025][0026]
在一种实施方式中，所述内参基因为管家基因gapdh和/或mrps-18c。
[0027]
优选的，所述引物探针组合c包括gapdh检测引物探针和/或mrps-18c检测引物探针。
[0028]
本技术中所述gapdh检测引物探针信息如下表7。
[0029]
表7
[0030][0031]
本技术mrps-18c检测引物探针信息如下表8。
[0032]
表8
[0033][0034]
本技术中荧光标记不做特别限定，本领域技术人员可做常规选择，在一种优选的实施方式中，荧光标记选自fam、hex、vic、rox、cy5中的任一种。
[0035]
本技术中淬灭基团不做特别限定，本领域技术人员可做常规选择，在一种实施方式中，淬灭基团选自bhq1、bhq2、bhq3、mgb中的任一种。
[0036]
本发明第二个方面提供了一种基于pcr平台检测人alk、ros1基因融合的方法，包括：使用所述引物探针组合进行检测。其中，特异性检测eml4-alk融合的具体基因型为：eml(e13)-alk(e20)，eml(e6)-alk(e20)，eml(e20)-alk(e20)，eml(e15)-alk(e20)，eml(e14)-alk(e20)，eml(e2)-alk(e20)；特异性检测ros1融合的具体基因型为：cd74(e6)-ros1(e32)，cd74(e6)-ros1(e34)；slc34a2(e4)-ros1(e32)，slc34a2(e4)-ros1(e34)，slc34a2(e13)-ros1(e34)；sdc4(e2)-ros1(e32)，sdc4(e2)-ros1(e34)，sdc4(e4)-ros1(e32)，sdc4(e4)-ros1(e34)；ezr(e10)-ros1(e34)；tpm3(e8)-ros1(e35)。
[0037]
在一种实施方式中，所述引物探针组合与rt-dpcr反应体系和数字pcr系统组合使用进行一步法逆转录数字pcr反应和数字pcr分析。
[0038]
在一种实施方式中，所述rt-dpcr反应体系包括逆转录酶、rnase抑制剂、热启动dna聚合酶、dntps、mgcl2、缓冲液组分以及表面活性剂组分。所述rt-dpcr反应体系具体为上海小海龟科技有限公司研发的成品试剂盒，产品名称为逆转录数字pcr通用试剂盒(a010)。
[0039]
在一种实施方式中，所述数字pcr系统包括数字pcr液滴制备仪、数字pcr芯片、数字pcr扩增仪、数字pcr分析仪。
[0040]
在一种实施方式中，所述基于pcr平台检测人alk、ros1基因融合的方法，包括如下步骤：
[0041]
a.将待检测的核酸样本、引物探针组合和rt-dpcr反应体系充分混合；
[0042]
b.在数字pcr液滴制备仪上，将步骤a中配制的混合物制备成微液滴，并存储于数
字pcr芯片中；
[0043]
c.在数字pcr扩增仪上，将步骤b中存储有微液滴的数字pcr芯片进行pcr扩增；
[0044]
d.在数字pcr分析仪上，对步骤c中pcr扩增完成的数字pcr芯片进行分析；
[0045]
e.对步骤d中分析结果中有与步骤a中的引物探针组合通道相符合的通道为阳性，即可判定待检的核酸样本为与该通道相对应的eml4-alk基因融合或ros1基因融合阳性。
[0046]
本发明第三个方面提供了一种试剂盒，包括5
×
rt-dpcr buffer、rt-dpcr酶、包含权利要求1-7任一项的引物探针组合的eml4-alk和ros1基因融合检测体系、阳性对照品、阴性对照品、数字pcr芯片、数字pcr用油相a和油相b、油槽板、八联排管、八联排管盖、吸头、废料盒。
[0047]
本技术中试剂盒最低检出限为(lod)为20copies/ml。
[0048]
需要指出的是本技术中待检测的核酸样本为rna。
[0049]
本技术中引物探针组合用于检测肺癌患者或疑似患者的血浆游离dna中eml4-alk基因和ros1基因融合突变。
[0050]
本发明与现有技术相比具有以下有益效果：
[0051]
(1)本技术引物探针组合以及检测方法，特异性和灵敏性高，提高了信噪比，分辨性好，准确性好，同时具有优异的线性关系，容易进行结果判断。
[0052]
(2)本技术引物探针组合包括引物探针组合c，用于监控样本核酸提取过程和反应质控，防止由核酸提取失败和反应试剂扩增失败导致的假阴性结果。
附图说明
[0053]
图1为实施例1中eml4-alk基因融合的线性图；
[0054]
图2为实施例1中eml4-alk基因线性检测数字pcr检测结果图；
[0055]
图3为实施例1中ros1基因融合的线性图；
[0056]
图4为实施例1中ros1基因融合线性检测数字pcr检测结果图；
[0057]
图5为实施例2中eml4-alk基因融合的线性图；
[0058]
图6为实施例2中ros1基因融合的线性图；
[0059]
图7为实施例3中eml4-alk基因融合的线性图；
[0060]
图8为实施例3中ros1基因融合的线性图；
[0061]
图9为实施例4中eml4-alk基因融合的线性图；
[0062]
图10为实施例4中ros1基因融合的线性图；
具体实施方式
[0063]
以下通过具体实施方式说明本发明，但不局限于以下给出的具体实施例。
[0064]
实施例
[0065]
基于pcr平台检测人alk、ros1基因融合的方法，具体如下：
[0066]
a.使用2000μl血浆样本进行核酸提取；
[0067]
b.将待检测的rna核酸样本、引物探针组合和rt-dpcr反应体系(逆转录数字pcr通用试剂盒(a010))充分混合；具体如下：
[0068]
(1)将5
×
rt-dpcr buffer、rt-dpcr酶、alk基因和ros1基因融合检测体系，室温下
融化后振荡混匀，瞬时离心将反应液收集于管底，按照15μl每管分装至八联排管的n+2个pcr管中。其中该步骤反应液成分如下表9；
[0069]
表9
[0070][0071]
*n为待检测的样本数量；3为一个阳性对照、一个阴性对照、多取一份为避免加样误差带来的体积损失。
[0072]
(2)分别取步骤a中提取的核酸样本各15μl，加入到分装好的pcr管中；
[0073]
取出alk基因和ros1基因融合阳性对照品和经过提取的阴性对照品，在室温下融化并振荡混匀后，瞬时离心，分别取15μl加入到剩余的2个分装好预混液的pcr管中；
[0074]
将加样好的八联排管加盖密封；然后混匀、离心、排除反应液中的气泡后，备用。
[0075]
c.在数字pcr液滴制备仪上，将步骤b中配制的混合物制备成微液滴，并存储于数字pcr芯片中；
[0076]
d.在数字pcr扩增仪上，将步骤c中存储有微液滴的数字pcr芯片进行pcr扩增；
[0077]
其中，扩增反应步骤如下表10；
[0078]
表10
[0079][0080]
e.在数字pcr分析仪上，对步骤d中pcr扩增完成的数字pcr芯片进行分析；
[0081]
f.对步骤e中分析结果中有与步骤b中的引物探针组合通道相符合的通道为阳性，即可判定待检的核酸样本为与该通道相对应的eml4-alk基因融合或ros1基因融合阳性。
[0082]
其中，引物探针组合包括引物探针组合物a、引物探针组合b以及引物探针组合c，引物探针组合c包括gapdh检测引物探针和mrps-18c检测引物探针，引物探针组合物a、引物探针组合b以及引物探针组合c序列详见表11-14。
[0083]
实施例1:
[0084]
引物探针组合：
[0085]
表11.
[0086]
[0087]
[0088][0089]
对该组合的试剂盒进行性能评估得到的eml4-alk基因融合的线性图，eml4-alk基因线性检测数字pcr检测结果图，ros1基因融合的线性图以及ros1基因融合线性检测数字pcr检测结果图分别见图1-4。图1中测试结果显示，r2＝0.9995；图3中测试结果显示，r2＝0.99983。
[0090]
实施例2:
[0091]
引物探针组合：
[0092]
表12.
[0093]
[0094][0095]
对该组合的试剂盒进行性能评估得到的eml4-alk基因融合的线性图，和ros1基因融合的线性图分别见图5和6。图5中测试结果显示，r2＝0.99981；图6中测试结果显示，r2＝0.99989。
[0096]
实施例3:
[0097]
引物探针组合：
[0098]
表13.
[0099]
[0100]
[0101][0102]
对该组合的试剂盒进行性能评估得到的eml4-alk基因融合的线性图，和ros1基因融合的线性图分别见图7和8。图7中测试结果显示，r2＝0.99976；图8中测试结果显示，r2＝0.99993。
[0103]
实施例4:
[0104]
引物探针组合：
[0105]
表14.
[0106]
[0107][0108]
对该组合的试剂盒进行性能评估得到的eml4-alk基因融合的线性图，和ros1基因融合的线性图分别见图9和10。图9中测试结果显示，r2＝0.99987；图10中测试结果显示，r2＝0.99984。