PD风险位点检测试剂盒及其使用方法、风险评分方法

pd风险位点检测试剂盒及其使用方法、风险评分方法
技术领域
1.本技术涉及检测试剂领域，具体而言，涉及一种pd风险位点检测试剂盒及其使用方法、风险评分方法。


背景技术：

2.遗传因素是pd发生发展的重要因素，至今国内外已鉴定了多个pd致病基因(如parkin、pink1、pla2g6、daglb等)及易感基因(如gba、nus1、gch1 等)，这些基因的发现为理解pd的发病机制提供了重要的线索。
3.全基因组关联研究(genome-wide association study，gwas)作为探索疾病遗传易感因素的重要方法，至今已发现了超过90个pd风险位点，但gwas 研究目前多基于欧洲血统人群，由于pd风险位点人群异质性的存在，直接套用研究结果用于亚裔人群pd的遗传风险评估，可能导致预测效果不良，从而影响个体的临床决策与疾病预防；亚裔人群可能存在特异的风险位点，已有的方法无法囊括该类位点。
4.针对相关技术中无法囊括亚裔人群可能存在特异的风险位点，也不能用于亚裔人群pd的遗传风险评估造成的影响临床诊断、治疗的问题，目前尚未提出有效的解决方案。


技术实现要素：

5.本技术的主要目的在于提供一种pd风险位点检测试剂盒及其使用方法、风险评分方法，以解决无法囊括亚裔人群可能存在特异的风险位点，也不能用于亚裔人群pd的遗传风险评估造成的影响临床诊断、治疗的问题。
6.为了实现上述目的，根据本技术的一个方面，提供了一种pd风险位点检测试剂盒。
7.根据本技术的pd风险位点检测试剂盒包括：snp所在片段的52对引物组、dntp、dna聚合酶、pcr扩增缓冲液和sequenom massarray基因分型常规组件与试剂。
8.进一步的，snp所在片段的52对引物组包括：用于扩增52个snp位点基因片段的pcr引物对，以及特异性检测这52个位点基因型的52条对应sequenommassarray单碱基延伸引物；其中，所述pcr引物对包括：pcr正向引物和pcr反向引物。
9.进一步的，52个所述snp位点为rs356182、rs34778348、rs11557080、 rs34594498、rs10513789、rs33949390、rs421016、rs4698412、rs2251086、 rs61204179、rs11158026、rs997368、rs12456492、rs2248244、rs10847864、 rs34311866、rs10748818、rs6825004、rs7938782、rs1474055、rs1867598、 rs4140646、rs10756907、rs12528068、rs4653767、rs199351、rs1941685、 rs34025766、rs55818311、rs6500328、rs11150601、rs2904880、rs75859381、 rs11578699、rs2042477、rs11610045、rs620513、rs10797576、rs12147950、 rs1450522、rs2269906、rs3104783、rs12951632、rs6808178、rs62333164、 rs7134559、rs3802920、rs6658353、rs61169879、rs10221156、rs11683001和 rs9638616。
10.为了实现上述目的，根据本技术的另一方面，提供了一种试剂盒的使用方法。
11.根据本技术的试剂盒的使用方法包括：检测dna样品是否满足预设标准，检测为满
足标准的dna样本将用于后续检测；采用sequenom massarray对52个目标snp位点进行基因分型检测。
12.进一步的，检测dna样品是否满足预设标准，检测为满足标准的dna样本将用于后续检测包括：
13.琼脂糖凝胶电泳分析dna降解程度以及是否有污染，od值在1.8～2.0之间则为满足标准，将满足标准的dna样本将用于后续检测。
14.进一步的，检测dna样品是否满足预设标准，检测为满足标准的dna样本将用于后续检测包括：
15.qubit对dna浓度进行精准定量，dna总量大于40ng则为满足标准，将满足标准的dna样本将用于后续检测。
16.进一步的，采用sequenom massarray对52个目标snp位点进行基因分型检测包括：
17.用各引物扩增目的片段按指定体积比混合并进行pcr反应；
18.将pcr产物用sap处理，去除体系中游离的dntp；
19.用对应的单碱基延伸引物进行单碱基延伸；
20.将clean resin树脂平铺到树脂板中，加水到延伸产物的对应孔内，将干燥后的树脂倒入延伸产物板中，封膜、旋转；
21.采用massarray点样仪将树脂纯化后的延伸产物移至384孔spectrochip芯片上；
22.将点样后的spectrochip使用maldi-tof分析，检测结果使用typer软件分型并输出结果。
23.为了实现上述目的，根据本技术的另一方面，提供了一种基于pd风险位点的风险评分方法。
24.根据本技术的基于pd风险位点的风险评分方法包括：利用52个snp位点的效应值构建多基因风险模型并计算各检测样本的多基因风险评分；多基因风险评分计算公式为：
[0025][0026]
本技术的有益效果如下：
[0027]
本技术的pd风险位点检测试剂盒的检测位点为针对亚裔pd人群开发的pd 风险相关位点，可准确反应亚裔人群的pd遗传特征，可用于评估正常人患pd 的风险，辅助pd的临床诊断，实现早期诊断早期治疗。
[0028]
本技术的试剂盒的使用方法可准确、快捷、经济的检测大量样本的数百个特定位点的基因型信息，相较已有的高通量的二代测序数据具有成本低廉的优点，相较较为传统的sanger测序法、kasp技术、massarray技术、taqman技术方法，具有通量高、检测迅速的优势。
[0029]
本技术的基于pd风险位点的风险评分方法构建了多基因风险评分模型，能够全面评估检测人的患病风险。
具体实施方式
[0030]
为了使本技术领域的人员更好地理解本技术方案，下面对本技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本技术一部分的实施例，而不是
全部的实施例。基于本技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本技术保护的范围。
[0031]
需要说明的是，本技术的说明书和权利要求书中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本技术的实施例。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。
[0032]
需要说明的是，在不冲突的情况下，本技术中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本技术。
[0033]
本技术涉及一种pd风险位点检测试剂盒，该试剂盒包括：snp所在片段的52 对引物组、dntp、dna聚合酶、pcr扩增缓冲液和sequenom massarray基因分型常规组件与试剂。
[0034]
具体的，在前期的研究中，我们利用中国pd人群和健康对照进行了gwas研究，发现了8个位点达到全基因组显著，其中1个为新发现位点，7个为既往报道相关位点；此外对70余个其他人群gwas已报道pd相关位点进行验证研究，发现 44个位点在中国人群也发挥重要作用。
[0035]
本实施例中，优选的，snp所在片段的52对引物组包括：用于扩增52个snp 位点基因片段的pcr引物对，以及特异性检测这52个位点基因型的52条对应sequenom massarray单碱基延伸引物；其中，所述pcr引物对包括：pcr正向引物和pcr反向引物。
[0036]
优选的，52个所述snp位点为rs356182、rs34778348、rs11557080、rs34594498、 rs10513789、rs33949390、rs421016、rs4698412、rs2251086、rs61204179、 rs11158026、rs997368、rs12456492、rs2248244、rs10847864、rs34311866、 rs10748818、rs6825004、rs7938782、rs1474055、rs1867598、rs4140646、 rs10756907、rs12528068、rs4653767、rs199351、rs1941685、rs34025766、 rs55818311、rs6500328、rs11150601、rs2904880、rs75859381、rs11578699、 rs2042477、rs11610045、rs620513、rs10797576、rs12147950、rs1450522、rs2269906、rs3104783、rs12951632、rs6808178、rs62333164、rs7134559、 rs3802920、rs6658353、rs61169879、rs10221156、rs11683001和rs9638616。
[0037]
pcr正向引物、pcr反向引物和单碱基延伸引物的对应关系具体如下表1所示：
[0038]
[0039]
[0040]
[0041]
[0042][0043]
由上可知，本技术的pd风险位点检测试剂盒的检测位点为针对亚裔pd人群开发的pd风险相关位点，可准确反应亚裔人群的pd遗传特征，可用于评估正常人患pd的风险，辅助pd的临床诊断，实现早期诊断早期治疗。
[0044]
本技术还涉及一种试剂盒的使用方法，包括：
[0045]
步骤s1：检测dna样品是否满足预设标准，检测为满足标准的dna样本将用于后续检测；
[0046]
优选的，检测dna样品是否满足预设标准，检测为满足标准的dna样本将用于后续检测包括：琼脂糖凝胶电泳分析dna降解程度以及是否有污染，od值在 1.8～2.0之间则为满足标准，将满足标准的dna样本将用于后续检测。
[0047]
可选的，检测dna样品是否满足预设标准，检测为满足标准的dna样本将用于后续检测包括：qubit对dna浓度进行精准定量，dna总量大于40ng则为满足标准，将满足标准的dna样本将用于后续检测。
[0048]
具体的，测定方法用于测定来源于人的基因组dna，临床取材来源广泛，如外周血、组织细胞等均可，通过提取和纯化制备基因组dna；dna样品的检测主要包括2种方法：1)琼脂糖凝胶电泳分析dna降解程度以及是否有rna或蛋白等污染。2)qubit对dna浓度进行精准定量。一般od值在1.8～2.0之间，dna总量大于40ng，满足标准的dna样本将用于后续检测。
[0049]
步骤s2：采用sequenom massarray对52个目标snp位点进行基因分型检测。
[0050]
优选的，采用sequenom massarray对52个目标snp位点进行基因分型检测包括：
[0051]
步骤s21：用各引物扩增目的片段按指定体积比混合并进行pcr反应；
[0052]
用表1的各引物扩增目的片段，每个反应体积为5ul，包括10xpcr缓冲液0.5ul， mgcl2(25mm)0.4ul，dntp混合液(25mm)0.1ul，taq酶(5u/ul)0.1ul，无酶水1.9ul，pcr上游和下游引物0.5ul，dna模板1ul；pcr反应条件：94℃4min、 94℃20s、56℃30s、72℃1min共45个循环，72℃5min，4℃保持。
[0053]
步骤s22：将pcr产物用sap处理，去除体系中游离的dntp；
[0054]
pcr完成后将pcr产物用虾碱性磷酸酶(sap)处理，去除体系中游离的dntp，反应体系为2ul，包括1.53ul无酶水，0.17ulsap缓冲液，0.3ulsap；反应条件：37℃40min、85℃5min、4℃保持。
[0055]
步骤s23：用对应的单碱基延伸引物进行单碱基延伸；
[0056]
用表1对应的单碱基延伸引物进行单碱基延伸，将2ul单碱基延伸反应液加入上述每个反应体系中，按照以下的pcr反应条件进行反应：94℃30s、94℃ 5s、52℃5s、80℃5s、52℃5s四次、94℃5s三十九次、72℃3min、4℃保持。
[0057]
步骤s24：将clean resin树脂平铺到树脂板中，加水到延伸产物的对应孔内，将干燥后的树脂倒入延伸产物板中，封膜、旋转；
[0058]
将clean resin树脂平铺到6mg的树脂板中，加16ul水到延伸产物的对应孔内，将干燥后的树脂倒入延伸产物板中，封膜，低速垂直旋转30min，使树脂与反应物充分接触，离心使树脂沉入孔底。
[0059]
步骤s25：采用massarray点样仪将树脂纯化后的延伸产物移至384孔spectrochip芯片上；
[0060]
启动massarray点样仪，将树脂纯化后的延伸产物移至384孔spectrochip (sequenom)芯片上。
[0061]
步骤s26：将点样后的spectrochip使用maldi-tof分析，检测结果使用typer 软件分型并输出结果。
[0062]
点样后的spectrochip使用基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱 (maldi-tof)分析，检测结果使用typer软件(sequenom)分型并输出结果。
[0063]
由上可知，本技术的试剂盒的使用方法可准确、快捷、经济的检测大量样本的数百个特定位点的基因型信息，相较已有的高通量的二代测序数据具有成本低廉的优点，相较较为传统的sanger测序法、kasp技术、massarray技术、taqman技术方法，具有通量高、检测迅速的优势。
[0064]
本技术还涉及一种基于pd风险位点的风险评分方法，包括：
[0065]
步骤s101：利用52个snp位点的效应值构建多基因风险模型并计算各检测样本的多基因风险评分；多基因风险评分计算公式为：
[0066][0067]
基于中国10181例pd患者与11932例正常对照中进行了全基因组关联研究和验证研究得到的52个pd相关snp位点，利用研究中各位点的效应值构建多基因风险模型并计算各检测样本的多基因风险评分。snp位点对应效应值如下表2 所示：
[0068]
[0069]
[0070]
[0071]
[0072][0073]
将上述的基于pd风险位点的风险评分方法配置计算机的可读存储介质中，计算机的处理器可以通过该方法执行相应的程序，结合上表和公式通过计算出多基因风险分数，用于评估检测人的患病风险。
[0074]
由上可知，本技术的基于pd风险位点的风险评分方法构建了多基因风险评分模型，能够全面评估检测人的患病风险。
[0075]
以上所述仅为本技术的优选实施例而已，并不用于限制本技术，对于本领域的技术人员来说，本技术可以有各种更改和变化。凡在本技术的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本技术的保护范围之内。