一种红外光驱动碳量子点基光酶催化剂催化合成R-3,5-BTPE的方法

一种红外光驱动碳量子点基光酶催化剂催化合成r-3,5-btpe的方法
技术领域
1.本发明属于nadph再生技术领域以及抗肿瘤中的镇吐药物合成技术领域，具体地说是涉及一种红外光驱动碳量子点基光酶催化剂催化合成r-3,5-btpe的方法。


背景技术：

2.阿瑞吡坦(结构式如a所示)是第一个神经激肽-1(nk-1)受体阻滞剂,主要用于治疗化疗后引起的恶心、呕吐。美国fda于2003年批准上市,阿瑞匹坦现已在北美,欧洲,韩国和中国香港等多个国家和地区上市,销售额逐年快速增长。(r)-1-[3,5-二(三氟甲基)]苯乙醇((r)-3,5-btpe)(结构式如b所示)，是阿瑞匹坦合成的关键前体的重要手性中间体，可以通过3,5-双(三氟甲基)苯乙酮(3,5-btap)直接还原所得。其中，光学活性仲醇是制药工业中许多生物活性化合物的重要组成部分。而在工业生产中，前手性酮的不对称氢化(ah,asymmetric hydrogenation)是获得对映体纯的仲醇的实用且简单的方法。尽管通过ah制备光学醇的方法引起了学术和工业研究的广泛兴趣，但是由于催化剂复杂或条件恶劣，而且化学催化法不对称合成手性醇通常具有条件苛刻，催化剂昂贵，手性醇的对映体过剩量低的问题，多数研究仍处于小规模生产或难以大规模生产的情况。
[0003][0004]
近年来，酶催化的异军突起也使得生物催化逐渐成为不可忽视的一部分。酶催化反应简单、容易控制、催化效率高，反应条件温和，适合工业化应用。而且产物容易分离纯化，立体和化学选择性高，在最近几十年间已产生了指数式的增长。前期研究发现，醛酮还原酶(akr，aldehyde ketone reductase)因其可靠的化学选择性和立体选择性，可以用于还原3,5-btap合成(r)-3,5-btpe。
[0005]
然而，在使用醛酮还原酶进行催化反应的过程中需要nad(p)h作为辅助因子才能得以进行。nad(p)h作为辅因子不仅昂贵而且不可或缺，并且用量往往较大，用量基本上等同于底物酮，这表明了该生物催化过程的经济缺陷。酶催化的nadh的再生(如醇脱氢酶和甲酸脱氢酶(fdh))在工业生物催化中已经建立，但是，此过程通常需要酶和相应底物的再生，这会受限于酶有限的稳定性以及高昂的分离费用。另外，目前关于 nadph再生的研究基本上都必须要用诸如[cp*rh(bpy)(h2o)]
2+
之类的贵金属配体作为氢转移和电子转移媒介，才可以达到nadph再生的目的，但这必然会增加高昂的成本，极大地限制了其工业化应用。
[0006]
因此，开发一种简单高效和低成本的nad(p)h再生以及(r)-3,5-btpe合成的方案，
已成为业内前沿学者亟待开拓的问题。


技术实现要素：

[0007]
本发明的目的在于针对现有技术存在的问题，提供光驱动碳量子点基光酶催化合成 r-3,5-btpe的方法。
[0008]
本发明一种光驱动碳量子点基光酶催化合成r-3,5-btpe的方法，是利用(近)红外光作为驱动光源，利用人工光合作用驱动光酶催化剂(r-gqds/akr-cles)用于催化合成(r)-1-[3,5-二(三氟甲基)]苯乙醇。具体是：
[0009]
步骤(1)、光酶催化剂r-gqds/akr-cles(cles，cross-linked enzymes)的制备：
[0010]
将石墨烯量子点和醛酮还原酶聚集体按照一定比例，通过机械搅拌法制得复合杂化体；
[0011]
步骤(2)、在反应器中加入反应溶剂、nadp
+
、光酶催化剂r-gqds/akr-cles、 3,5-双(三氟甲基)苯乙酮，在氙灯光照下反应；
[0012]
步骤(3)、取步骤(1)反应液上清，使用无水正己烷对上清液进行萃取，之后加热减压旋干，得到纯的(r)-1-[3,5-二(三氟甲基)]苯乙醇。
[0013]
作为优选，步骤(1)中反应体系中石墨烯量子点和醛酮还原酶聚集体的质量比为 (10-40)：(2.5-4)。
[0014]
作为优选，步骤(2)中所述的反应溶剂为甲醇、正己烷、pbs缓冲液、氢氧化钠溶液、盐酸溶液中的一种；光照反应时间为12-24h；氙灯波长λ》800nm，但不限于此波长范围；反应体系中所加nadp
+
的浓度为0.5-1.5mmol
·
l-1
，光酶催化剂r-gqds/akr-cles的浓度为0.5-2mg
·
ml-1
，3,5-双(三氟甲基)苯乙酮的浓度为 30-60mmol
·
l-1
。
[0015]
作为优选，所述的醛酮还原酶(akr-114-189)聚集体，通过下述方法制备得到：
[0016]
s1：将醛酮还原酶突变体细胞接种到含有氯霉素、卡那霉素和氨苄青霉素的lb培养基中，并在振荡培养箱中培养至od
600
＝0.6～0.8，通过添加l-(+)-阿拉伯糖、atc和对叠氮-l-苯丙氨酸诱导蛋白质表达一段时间，离心得到沉淀，获得非天然氨基酸修饰后的醛酮还原酶的细菌；
[0017]
所述醛酮还原酶突变体细胞为akr-114-189突变体，对远离源自海马栖热球菌 msb8的醛酮还原酶(akr)活性位点的两个位点(114y-189q)进行突变后得到。
[0018]
s2：上述非天然氨基酸修饰后的醛酮还原酶的细菌沉淀使用pbs缓冲液重悬，并使用超声波处理使细菌裂解，通过离心分离浓缩得到可溶性部分；通过微波辅助下，加入双叠氮交联剂和cui，参与叠氮化物-炔烃环加成点击反应使酶固定化；通过离心分离固定化后的酶。
[0019]
作为优选，双叠氮交联剂与可溶性部分的摩尔比为0.5-1.5：1；cui与可溶性部分的摩尔比为0.2-0.6：1。
[0020]
本发明提供了提供一种红外光驱动碳量子点基光酶催化剂催化合成r-3,5-btpe的方法，可以利用人工光合作用驱动光酶催化剂(r-gqds/akr-cles)催化合成 (r)-1-[3,5-二(三氟甲基)]苯乙醇。
[0021]
采用本发明方法的有益效果主要体现在：
[0022]
(1)利用人工光合作用驱动nadph再生，不额外借用其他材料作为氢转移和电子转
2mg
·
ml-1
，3,5-双(三氟甲基)苯乙酮的浓度为 30-60mmol
·
l-1
。
[0039]
作为优选，所述的醛酮还原酶(akr-114-189)聚集体，通过下述方法制备得到：
[0040]
将醛酮还原酶(akr-114-189)突变体细胞接种到含有30-40μg
·
ml-1
氯霉素，80-120 μg
·
ml-1
卡那霉素和40-60μg
·
ml-1
氨苄青霉素的lb培养基中，并在振荡培养箱中 30-35℃培养；至od
600
＝0.6～0.8，通过添加0.1-0.3％(w/v)l-(+)-阿拉伯糖，50-70ng
·
ml-1 atc和对叠氮-l-苯丙氨酸至终浓度1-1.5mmol
·
l-1
诱导蛋白质表达一段时间，离心得到沉淀，来获得非天然氨基酸修饰后的醛酮还原酶的细菌；所述醛酮还原酶突变体细胞为对远离源自海马栖热球菌msb8的醛酮还原酶(akr)活性位点的两个位点(114y
‑ꢀ
189q)进行突变后得到。
[0041]
在振荡培养箱中于20-25℃诱导表达15-20h后，以8000-10000rpm离心5-10min 沉淀，来获得非天然氨基酸修饰后的醛酮还原酶的细菌，将所得细菌沉淀使用pbs缓冲液重悬，并使用超声波处理使细菌裂解，通过8000-10000rpm离心10-15min分离得到可溶性部分，将可溶性部分离心浓缩；通过微波辅助下，加入0.5-1.5个当量的双叠氮交联剂和0.2-0.6个当量的cui，参与叠氮化物-炔烃环加成点击反应使酶固定化；通过离心分离固定化后的酶。
[0042]
编码醛酮还原酶的基因序列见seq id no.1所示。
[0043]
作为优选，双叠氮交联剂与可溶性部分的摩尔比为0.5-1.5：1；cui与可溶性部分的摩尔比为0.2-0.6：1。
[0044]
此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为了进一步说明本发明的特征和优点，而不是对发明权利要求的限制。
[0045]
本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的，实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。(10-40)：(2.5-4)
[0046]
实施例1
[0047]
室温下，将0.2g
·
ml-1
的r-gqds(石墨烯量子点)，32mg
·
ml-1
醛酮还原酶 (akr-114-189)聚集体通过械搅拌5h制得光酶催化剂(r-gqds/akr-cles)。
[0048]
将100mm的pbs缓冲液(ph＝7.0)，1mm的nadp
+
，以及10mg光酶催化剂(r-gqds/akr-cles)，50mm底物3,5-双(三氟甲基)苯乙酮，总体积为10ml，并用氙灯(波长λ》800nm)距反应器15厘米处光照反应18h；反应结束后，用高效液相色谱仪检测体系中(r)-1-[3,5-二(三氟甲基)]苯乙醇的含量；高效液相色谱条件：c18柱，柱温为20℃，检测器为210nm，流动相为：甲醇：水＝75:25(v/v)，流速为0.5ml/min。
[0049]
以从tci(东京化成工业株式会社)采购的(r)-1-[3,5-二(三氟甲基)]苯乙醇作为标准品，与本发明方法制备的产品，进行hplc分析，两者保留时间一致，确定产物结构。转化率通过标准样品((r)-1-[3,5-二(三氟甲基)]苯乙醇的hplc峰面积)的标准曲线计算，标样的标准曲线为y＝27610x+2349.5，其中x表示反应液中的产物浓度，单位为mg/ml，y表示产物的hplc峰面积。hplc检测得到(r)-1-[3,5-二(三氟甲基)]苯乙醇的转化率为51.42％，从图3可以看出，光催化再生nadph促进的手性醇合成与人工添加nadph取得一样的效果，即完全可用此法以水为氢供体再生nadph，且醛酮还原酶保持稳定的催化性能。
[0050]
实施例2
[0051]
室温下，将0.2g
·
ml-1
的r-gqds(石墨烯量子点)，32mg
·
ml-1
醛酮还原酶 (akr-114-189)聚集体通过械搅拌一段时间制得光酶催化剂(r-gqds/akr-cles)。
[0052]
将100mm的pbs缓冲液(ph＝7.0)，1mm的nadp
+
，以及10mg光酶催化剂 (r-gqds/akr-cles)，50mm底物3,5-双(三氟甲基)苯乙酮，总体积为10ml，并用氙灯(波长λ》800nm)距反应器15厘米处光照反应18h；反应结束后，用高效液相色谱仪检测体系中(r)-1-[3,5-二(三氟甲基)]苯乙醇的含量；高效液相色谱条件：c18柱，柱温为20℃，检测器为210nm，流动相为：甲醇：水＝75:25(v/v)，流速为0.5ml/min。
[0053]
反应结束后过滤获取光酶催化剂(r-gqds/akr-cles)，用去离子水洗涤干燥，以备循环使用，循环一次12h，循环5次后，hplc检测(r)-1-[3,5-二(三氟甲基)]苯乙醇的转化率基本不变。
[0054]
图1为本发明实制得的光酶催化剂的扫描电镜微观形貌图。图2为本发明实制得的光酶催化剂的eds元素分析图像。
[0055]
对比例1
[0056]
与实施例1的区别在于，在实施例1的实验基础上，原料中额外加入1mm的 [cp*rh(bpy)(h2o)]
2+
作为氢转移和电子转移媒介。
[0057]
hplc检测得到(r)-1-[3,5-二(三氟甲基)]苯乙醇的转化率为57.87％，可以看出，加入贵金属配体[cp*rh(bpy)(h2o)]
2+
作为氢转移和电子转移媒介并没有大幅提高催化效率，因此，与贵金属配体的高昂成本相比，本发明不加贵金属配体作为氢转移和电子转移媒介更适合工业化生产应用。
[0058]
实施例3
[0059]
室温下，将0.1g
·
ml-1
的r-gqds(石墨烯量子点)，25mg
·
ml-1
醛酮还原酶 (akr-114-189)聚集体通过械搅拌3h制得光酶催化剂(r-gqds/akr-cles)。
[0060]
将100mm的pbs缓冲液(ph＝7.0)，0.5mm的nadp
+
，以及5mg光酶催化剂 (r-gqds/akr-cles)，50mm底物3,5-双(三氟甲基)苯乙酮，总体积为10ml，并用氙灯(波长λ》800nm)距反应器15厘米处光照反应12h；反应结束后，用高效液相色谱仪检测体系中(r)-1-[3,5-二(三氟甲基)]苯乙醇的含量；高效液相色谱条件：c18柱，柱温为20℃，检测器为210nm，流动相为：甲醇：水＝75:25(v/v)，流速为0.5ml/min。
[0061]
实施例4
[0062]
室温下，将0.4g
·
ml-1
的r-gqds(石墨烯量子点)，40mg
·
ml-1
醛酮还原酶 (akr-114-189)聚集体通过械搅拌6h制得光酶催化剂(r-gqds/akr-cles)。
[0063]
将100mm的pbs缓冲液(ph＝7.0)，1.5mm的nadp
+
，以及15mg光酶催化剂 (r-gqds/akr-cles)，50mm底物3,5-双(三氟甲基)苯乙酮，总体积为10ml，并用氙灯(波长λ》800nm)距反应器15厘米处光照反应24h；反应结束后，用高效液相色谱仪检测体系中(r)-1-[3,5-二(三氟甲基)]苯乙醇的含量；高效液相色谱条件：c18柱，柱温为20℃，检测器为210nm，流动相为：甲醇：水＝75:25(v/v)，流速为0.5ml/min。
[0064]
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰
为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。