一种拜耳威利格单加氧酶突变体及其应用的制作方法

1.本发明属于酶工程技术领域，具体涉及一种拜耳威利格单加氧酶突变体及其应用。


背景技术：

2.手性亚砜是esomeprazole,ceralasertib,cenicriviroc等临床阶段或上市药物的重要手性中间体；传统上先用双氧水或过氧化物氧化硫醚得到消旋体，通过不对称成盐的结晶方法，再拆分得到手性亚砜，收率低且有安全风险；现有的方法是用手性的制备色谱来分离，成本较高，产能受限；现有的金属催化不对称氧化的方法，都不能得到目标手性亚砜类化合物；现有的天然酶或商品酶，对于目标底物，或者不反应，或者没有手性。
3.酶催化不对称氧化，用空气作为氧化剂成本及其低廉，无安全风险，可一步构建手性硫原子得到单一对映体的手性亚砜。这种方法环境污染小，副产物少，原子经济性好，而且产物光学纯度高，因此利用酶法不对称氧化合成手性亚砜受到了越来越多的关注。


技术实现要素：

4.本发明要解决的技术问题是克服现有技术中手性亚砜类化合物制备方法收率低的缺陷，为此提供一种拜耳威利格单加氧酶突变体及其应用。本发明中拜耳威利格单加氧酶突变体催化活性较高，立体选择性较好。本发明突变用于制备手性亚砜类化合物，能以高收率制备得到手性亚砜类化合物。此外，本发明突变用于制备手性亚砜类化合物，得到手性亚砜类化合物的纯度以及产物的e.e.值均较高，综上，本发明提供的制备手性亚砜类化合物的方法具有比较高的工业应用价值。
5.本发明是通过以下技术方案来解决上述技术问题的。
6.本发明提供了一种手性亚砜类化合物的制备方法，其包含以下步骤：在单加氧酶突变体的存在下，将化合物1进行单加氧反应，得到手性亚砜类化合物即可；
[0007][0008]
其中，*表示对应硫原子的手性为s构型或r构型；
[0009]
r1为h、me、meo、f、cl或i；
[0010]
所述单加氧酶突变体为在如seq id no:2所示的氨基酸序列上具有选自以下一个或多个位点的氨基酸残基的差异：
[0011]
第3位、第14位、第34位、第43位、第71位、第111位、第141位、第143位、第144位、第149位、第174位、第209位、第240位、第246位、第248位、第277位、第288位、第307位、第326位、第327位、第341位、第383位、第386位、第388位、第390位、第400位、第415位、第426位、第
432位、第433位、第434位、第435位、第438位、第448位、第449位、第464位、第481位、第488位、第489位、第490位、第505位、第516位、第526位、第537位和第540位。
[0012]
在某一方案中，所述差异可为缺失、增加或替换，优选为替换。
[0013]
某一方案中，所述单加氧酶突变体为在如seq id no:2所示的氨基酸序列的第3位氨基酸残基替换为a、f、g、h、k、l、m、s、t或v，和/或，第14位氨基酸残基替换为a、c、d、f、h、i、k、l、m、n、p、q、r、s、t、v、w或y，和/或，第34位氨基酸残基替换为c、d、e、f、g、h、i、k、l、m、p、r、s、t、v、w或y，和/或，第43位氨基酸残基替换为c、f、g、h、i、k、l、m、p、r、v、w或y，和/或，第71位氨基酸残基替换为a、d、g、h、i、k、m、p、q、r、s、t、v或y，和/或，第111位氨基酸残基替换为c、e、f、g、i、k、m、n、p、r、s、t、v、w或y，和/或，第141位氨基酸残基替换为a、d、e、g、h、i、m、n、p、q、r、s、t、v、w或y，和/或，第143位氨基酸残基替换为a、c、e、f、g、h、i、k、m、n、p、q、s、t或w，和/或，第144位氨基酸残基替换为a、c、d、e、f、g、h、i、k、m、n、p、q、r、s、v或w，和/或，第149位氨基酸残基替换为a、c、d、e、f、g、h、i、k、m、n、p、q、r、s、t、v或w，和/或，第174位氨基酸残基替换为a、c、d、e、h、i、k、l、m、n、q、r、s、v、w或y，和/或，第209位氨基酸残基替换为c、d、e、f、g、h、i、k、l、m、n、p、q、r、s、t、w或y，和/或，第240位氨基酸残基替换为a、d、e、f、g、h、i、k、l、m、n、p、q、r、v或y，和/或，第246位氨基酸残基替换为a、c、d、e、g、h、i、k、l、m、n、p、q、r、s、t、v、w或y，和/或，第248位氨基酸残基替换为a、c、d、e、f、g、h、i、k、m、n、p、r、s、t、v或y，和/或，第277位氨基酸残基替换为a、c、d、e、g、h、k、l、m、n、p、q、r、s、t、v、w或y，和/或，第288位氨基酸残基替换为c、d、e、g、h、i、k、l、m、n、p、q、r、s、t、v、w或y，和/或，第307位氨基酸残基替换为d、f、g、h、i、l、m、n、p、q、r、s、t、v、w或y，和/或，第326位氨基酸残基替换为a、c、d、e、f、h、i、l、m、n、p、q、r、s、t、v、w或y，和/或，第327位氨基酸残基替换为a、d、e、f、g、h、i、k、l、m、n、p、q、s、t、v、w或y，和/或，第341位氨基酸残基替换为a、c、e、f、g、h、i、k、l、m、n、p、q、r、s、t、v、w或y，和/或，第383位氨基酸残基替换为c、d、e、f、g、h、i、k、l、m、n、p、s、t、w或y，和/或，第386位氨基酸残基替换为a、c、d、e、f、h、i、k、m、p、r、s、t、v、w或y，和/或，第388位氨基酸残基替换为a、c、d、e、g、h、i、k、l、m、n、p、q、r、s、t、w或y，和/或，第390位氨基酸残基替换为a、c、e、f、g、h、i、k、l、n、p、r、s、t、v、w或y，和/或，第400位氨基酸残基替换为a、c、d、f、h、i、k、l、n、p、q、s、t、v或w，和/或，第415位氨基酸残基替换为a、c、e、f、g、i、k、l、m、n、r、s、w或y，和/或，第426位氨基酸残基替换为a、c、d、e、f、g、h、k、m、n、p、q、r、s、t、v或w，和/或，第432位氨基酸残基替换为a、c、d、e、g、h、i、k、l、m、n、p、s、v或y，和/或，第433位氨基酸残基替换为c、d、e、f、g、h、i、k、l、m、n、q、s、v或y，和/或，第434位氨基酸残基替换为a、c、d、f、g、h、i、k、l、m、p、q、r、s、v、w或y，和/或，第435位氨基酸残基替换为a、c、d、e、f、g、i、k、n、q、r、s、v、w或y，和/或，第438位氨基酸残基替换为a、c、d、e、f、g、h、i、k、m、n、q、r、t、v、w或y，和/或，第448位氨基酸残基替换为f、h、k、l、r、s、v或y，和/或，第449位氨基酸残基替换为c、d、e、f、g、h、i、k、m、n、p、q、r、s、v、w或y，和/或，第464位氨基酸残基替换为a、d、e、g、h、i、k、l、m、n、p、r、s、v或y，和/或，第481位氨基酸残基替换为a、c、d、e、g、h、k、l、n、p、q、r、s、t、v或w，和/或，第488位氨基酸残基替换为a、c、d、e、f、g、h、i、k、l、m、n、p、s、t、v、w或y，和/或，第489位氨基酸残基替换为a、c、d、e、f、g、h、i、k、l、m、n、q、r、t、v、w或y，和/或，第490位氨基酸残基替换为a、c、d、e、f、g、i、k、l、m、n、p、q、r、s、t、v或y，和/或，第505位氨基酸残基替换为a、c、d、e、h、i、k、l、m、p、q、r、s、t、v、w或y，和/或，第516位氨基酸残基替换为c、d、e、f、g、h、i、k、l、m、n、p、q、r、s、t、v、w或y，和/或，第526位氨基酸残基替换为c、f、g、k、s、v或y，和/或，第537位氨基
酸残基替换为d、h、k、l、m、r、s、t或w，和/或，第540位氨基酸残基替换为d、k、l、m、n、q、s或w。
[0014]
某一方案中，所述突变体为在如seq id no:2所示的氨基酸序列的第3位氨基酸残基替换为t，和/或，第14位氨基酸残基替换为a，和/或，第34位氨基酸残基替换为k或w，和/或，第43位氨基酸残基替换为g或v，和/或，第71位氨基酸残基替换为m或p，和/或，第111位氨基酸残基替换为n或t，和/或，第141位氨基酸残基替换为v，和/或，第143位氨基酸残基替换为m、n、p或w，和/或，第144位氨基酸残基替换为i，和/或，第149位氨基酸残基替换为a、f或w，和/或，第174位氨基酸残基替换为e、i、k或q，和/或，第209位氨基酸残基替换为p，和/或，第240位氨基酸残基替换为k或l，和/或，第246位氨基酸残基替换为d、g、m或p，和/或，第248位氨基酸残基替换为h、k、t或v，和/或，第277位氨基酸残基替换为m、p、t或v，和/或，第288位氨基酸残基替换为i或q，和/或，第307位氨基酸残基替换为n或r，和/或，第326位氨基酸残基替换为c或l，和/或，第327位氨基酸残基替换为g或h，和/或，第341位氨基酸残基替换为e、i、p、t或w，和/或，第383位氨基酸残基替换为g或n，和/或，第386位氨基酸残基替换为p、s或w，和/或，第388位氨基酸残基替换为k或p，和/或，第390位氨基酸残基替换为i、r、t或y，和/或，第400位氨基酸残基替换为i，和/或，第415位氨基酸残基替换为a，和/或，第426位氨基酸残基替换为e、f或w，和/或，第432位氨基酸残基替换为l，和/或，第433位氨基酸残基替换为d、f、n或v，和/或，第434位氨基酸残基替换为g、i、l、q或v，和/或，第435位氨基酸残基替换为c、r或s，和/或，第438位氨基酸残基替换为i，和/或，第448位氨基酸残基替换为k或v，和/或，第449位氨基酸残基替换为f，和/或，第464位氨基酸残基替换为d或m，和/或，第481位氨基酸残基替换为e或k，和/或，第488位氨基酸残基替换为f或k，和/或，第489位氨基酸残基替换为c、f或w，和/或，第490位氨基酸残基替换为a、n、r、t或v，和/或，第505位氨基酸残基替换为l，和/或，第516位氨基酸残基替换为g、p或v，和/或，第526位氨基酸残基替换为v，和/或，第537位氨基酸残基替换为t，和/或，第540位氨基酸残基替换为n或q。
[0015]
某一方案中，所述单加氧酶突变体为在如seq id no:2所示的氨基酸序列上具有选自以下一个或多个位点的氨基酸残基的差异：
[0016]
第3位、第14位、第34位、第43位、第71位、第111位、第141位、第143位、第149位、第174位、第209位、第240位、第246位、第248位、第277位、第288位、第307位、第326位、第327位、第341位、第383位、第386位、第388位、第390位、第400位、第415位、第426位、第432位、第433位、第434位、第435位、第438位、第448位、第449位、第464位、第481位、第488位、第489位、第490位、第505位、第516位、第526位、第537位和第540位。
[0017]
某一方案中，所述突变体为在如seq id no:2所示的氨基酸序列的第3位氨基酸残基替换为t，和/或，第14位氨基酸残基替换为a，和/或，第34位氨基酸残基替换为k，和/或，第43位氨基酸残基替换为g，和/或，第71位氨基酸残基替换为m，和/或，第111位氨基酸残基替换为t，和/或，第141位氨基酸残基替换为v，和/或，第143位氨基酸残基替换为m或p，和/或，第149位氨基酸残基替换为w，和/或，第174位氨基酸残基替换为i，和/或，第209位氨基酸残基替换为p，和/或，第240位氨基酸残基替换为k，和/或，第246位氨基酸残基替换为d、g、m或p，和/或，第248位氨基酸残基替换为v，和/或，第277位氨基酸残基替换为l、m、t或v，和/或，第288位氨基酸残基替换为i，和/或，第307位氨基酸残基替换为r，和/或，第326位氨基酸残基替换为c，和/或，第327位氨基酸残基替换为g，和/或，第341位氨基酸残基替换为e，和/或，第383位氨基酸残基替换为g，和/或，第386位氨基酸残基替换为s，和/或，第388位
氨基酸残基替换为k，和/或，第390位氨基酸残基替换为i，和/或，第400位氨基酸残基替换为i，和/或，第415位氨基酸残基替换为a，和/或，第426位氨基酸残基替换为f，和/或，第432位氨基酸残基替换为l，和/或，第433位氨基酸残基替换为n或v，和/或，第434位氨基酸残基替换为g、i或l，和/或，第435位氨基酸残基替换为s，和/或，第438位氨基酸残基替换为i，和/或，第448位氨基酸残基替换为v，和/或，第449位氨基酸残基替换为f，和/或，第464位氨基酸残基替换为d，和/或，第481位氨基酸残基替换为k，和/或，第488位氨基酸残基替换为k，和/或，第489位氨基酸残基替换为c，和/或，第490位氨基酸残基替换为a、n、r、t或v，和/或，第505位氨基酸残基替换为l，和/或，第516位氨基酸残基替换为v，和/或，第526位氨基酸残基替换为v，和/或，第537位氨基酸残基替换为t，和/或，第540位氨基酸残基替换为q。
[0018]
在某一方案中，所述突变体与如seq id no:2所示的氨基酸序列的差异如下表1所示：
[0019]
表1单加氧酶的突变位置和种类
[0020]
[0021]
[0022]
[0023]
[0024]
[0025]
[0026]
[0027]
[0028]
[0029]
[0030]
[0031]
[0032]
[0033]
[0034]
[0035][0036]
在某一方案中，所述单加氧反应的反应溶剂为缓冲液、或、缓冲液和有机溶剂的混合物；所述有机溶剂可为本领域常规有机溶剂，优选选自醚类溶剂、环氧类溶剂、酯类溶剂、亚砜类溶剂、酰胺类溶剂和醇类溶剂中的一种或多种；所述醚类溶剂可选自甲基叔丁基醚、异丙醚、四氢呋喃和2-甲基四氢呋喃中的一种或多种；所述环氧类溶剂可为1,4-二氧六环；所述酯类溶剂可为乙酸乙酯；所述亚砜类溶剂可为二甲基亚砜；所述酰胺类溶剂可为n,n-二甲基甲酰胺；所述醇类溶剂可选自甲醇、乙醇、异丙醇和正丁醇中的一种或多种。
[0037]
在某一方案中，所述有机溶剂优选为二甲基亚砜。
[0038]
在某一方案中，所述缓冲液为本领域常规的缓冲液，可选自硼酸钠缓冲液、磷酸盐缓冲液(pbs)、三羟甲基甲胺盐缓冲液(tris)和三乙醇胺盐缓冲液(teoa)中的一种或多种；优选为硼酸钠缓冲液、磷酸盐缓冲液、三羟甲基甲胺盐缓冲液或三乙醇胺盐缓冲液；例如：teoa-hcl、tris-hcl、硼酸钠缓冲液或磷酸盐缓冲液。
[0039]
在某一方案中，当所述单加氧反应的反应溶剂为缓冲液和本领域常规的有机溶剂的混合物时，所述有机溶剂与所述缓冲液的体积比为(0.01-0.5):1，例如0.02:1、0.04:1或
0.08:1。
[0040]
在某一方案中，所述单加氧反应的反应溶剂与所述化合物1的体积质量比可为10～100ml/g，例如25ml/g或50ml/g。
[0041]
在某一方案中，所述单加氧酶突变体与所述化合物1的质量比可为(0.01～1):1，可为(0.01～0.5):1，例如0.02:1、0.1:1或0.2:1。
[0042]
在某一方案中，所述制备方法进一步包含氧化剂，所述氧化剂可为含氧气体(含氧气体中其他成分为常见的惰性气体)，较佳地，选自空气、氧气与氮气的混合气体、氧气与氩气的混合气体、氧气与氦气的混合气体中的一种。
[0043]
在某一方案中，所述含氧气体中氧气的体积百分比为5～30％；优选为10-25％，例如15-22％。
[0044]
在某一方案中，所述制备方法中还进一步包含氢供体，所述氢供体可为本领域常规的氢供体，优选为nadph，或nadp
+
和异丙醇；其中氢供体可为nadph直接加入，也可以通过加入nadp
+
、异丙醇以及kred的辅酶循环系统循环得到。较佳地，所述氢供体通过加入nadp
+
和异丙醇循环得到。
[0045]
在某一方案中，所述异丙醇与所述化合物1的摩尔比为(1～10):1，例如1:1、2:1、5:1或10:1。
[0046]
在某一方案中，所述nadp
+
与所述化合物1的质量比可为(0.001～0.1):1，又可为(0.001～0.05):1，例如0.0025:1、0.01:1或0.02:1。
[0047]
在某一方案中，所述制备方法还进一步包含氧化还原酶，所述氧化还原酶为本领域常规的氧化还原酶，优选为kred(kred主要是用于nadph的循环，异丙醇和nadp
+
在kred的作用下生成nadph，nadph参与到拜尔威力格单加氧酶的氧化中，同时本身被还原为nadp
+
)，例如来源于lactobacillus kefir dsm 20587(genebank no.：wp_054768785)的kred。
[0048]
在某一方案中，所述氧化还原酶与所述化合物1的质量比可为(0.005～0.1):1，又可为(0.01～0.05):1，例如0.01:1、0.04:1或0.08:1。
[0049]
在某一方案中，所述制备方法中还进一步包含过氧化氢酶，例如：来源于sigma,pcode:100302788；cas:9001-05-2的过氧化氢酶。
[0050]
在某一方案中，所述过氧化氢酶与所述化合物1的质量比可为(0.001～0.1):1，又可为(0.001～0.05):1，例如0.0025:1、0.01:1或0.02:1。
[0051]
在某一方案中，所述氧化还原酶与所述nadp
+
的质量比可为(1-5):1，例如4:1。
[0052]
在某一方案中，所述单加氧反应的反应温度为本领域常规的反应温度，例如25℃～50℃，又例如27℃、37℃或47℃。
[0053]
在某一方案中，所述单加氧反应的反应时间为本领域常规的反应时间，反应时间通常与反应规模相关，优选为16～24h；例如18h。
[0054]
在某一方案中，所述单加氧反应的ph值可为6.0～10.5；例如7.0～10.0，优选为7.0、7.5、8.0、8.5或9.0。
[0055]
在某一方案中，所述手性亚砜类化合物的制备方法，其包括以下步骤：向所述反应溶剂中，加入所述化合物1和所述单加氧酶突变体，混合均匀后在25℃～50℃下反应即可。
[0056]
在某一方案中，所述手性亚砜类化合物的制备方法包含以下步骤：在溶剂中，所述化合物1在所述单加氧酶突变体、所述氧化剂、所述氧化还原酶、nadp
+
、所述过氧化氢酶和
所述异丙醇的存在下，进行单加氧反应，得到手性亚砜类化合物即可。
[0057]
在某一方案中，所述手性亚砜类化合物的制备方法的反应原料由以下物质组成：所述反应溶剂、所述化合物1、所述单加氧酶突变体、所述氧化剂、所述氧化还原酶、nadp
+
、所述过氧化氢酶和所述异丙醇。
[0058]
在某一方案中，所述手性亚砜类化合物的制备方法的反应原料由以下物质组成：所述反应溶剂、所述化合物1、所述单加氧酶突变体、所述氧化剂、所述氧化还原酶、nadph和所述过氧化氢酶。
[0059]
在某一方案中，所述单加氧反应结束后，可通过以下步骤进行后处理，其包含：萃取，浓缩。
[0060]
所述萃取为用本领域此类操作常用的有机溶剂萃取，所述有机溶剂较佳地为醇类溶剂，例如正丁醇。所述有机溶剂的用量与反应液的体积比为本领域常规的体积比，例如3:1。
[0061]
所述浓缩可通过减压蒸馏的方式浓缩，例如在-0.09mpa真空度下减压蒸馏进行浓缩。
[0062]
本发明还提供了一种单加氧酶的突变体，其为如上所述方法中所定义的突变体。
[0063]
本发明还提供了一种分离的核酸，其中所述核酸编码如上所述单加氧酶的突变体。
[0064]
本发明还提供了一种重组表达载体，其中所述重组表达载体包含如上所述核酸。
[0065]
本发明还提供了一种转化体，其中所述转化体包含如上所述重组表达载体。
[0066]
本发明还提供了一种制备单加氧酶突变体的方法，其包括培养如上所述转化体并获得含单加氧酶突变体的培养物的步骤。
[0067]
本发明还提供了一种上述单加氧酶突变体在制备手性亚砜类化合物中的应用。所述应用中，反应底物、反应产物、反应条件和步骤如前所述。
[0068]
在不违背本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
[0069]
本发明所用试剂和原料均市售可得。
[0070]
本发明中的氨基酸简写符号如无特殊说明均为本领域常规，具体简写符号对应的氨基酸如表2所示。
[0071]
表2
[0072][0073]
本发明的积极进步效果在于：
[0074]
本发明通过基因工程对一种拜耳威利格单加氧酶进行定向进化，得到若干具有高活性和立体特异性的突变体，以化合物1为底物，在所述拜耳威利格单加氧酶突变体的作用下能以较高收率和立体选择性生成手性亚砜类化合物。本发明的优选突变体，催化化合物1氧化时，能达到如下条件中的一种或多种：立体选择性可达99.7％，转化率可达100％，收率可达95.8％和纯度可达98％。综上，本发明的单加氧酶突变体具有比较高的工业应用价值。
具体实施方式
[0075]
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
[0076]
kred为来源于lactobacillus kefir dsm 20587(genebank no.：wp_054768785)的kred；catalase为商业购买酶，来源于sigma,pcode:100302788；cas:9001-05-2。
[0077][0078]
实施例1在teoa-hcl(三乙醇胺)缓冲液中拜耳威利格单加氧酶催化化合物1(r1为cl)合成手性亚砜类化合物。
[0079]
向50ml的烧杯中加入16mg kred,4mg nadp
+
,4mg catalase(过氧化氢酶)，400μl ipa(异丙醇)，800μldmso及18.8ml 100mmol/l、ph＝8.0的teoa缓冲液，搅拌直到得到均匀的溶液。从烧杯中取出2ml的溶液加入到10.0ml的反应瓶中，并向溶液中添加0.04g的化合物1(r1为cl)和0.004g拜耳威利格单加氧酶突变体280。漩涡震荡混匀所得的溶液后于27℃条件下反应18h。结束后取出反应液，并用三倍体积的正丁醇进行萃取之后取出有机相，在-0.09mpa(表压)的真空度下减压蒸馏，最终得到产物0.0382g(收率为95.6％)，转化率为
0.09mpa(表压)的真空度下减压蒸馏，最终得到产物0.0382g(收率为95.6％)，转化率为99.3％。通过sfc(超临界流体色谱)检测，s构型手性亚砜的对映异构体过量值(e.e.)为99.6％。产物经核磁检测，结果显示，产物的纯度大于98％。
[0088]
实施例6在teoa-hcl(三乙醇胺)缓冲液中拜耳威利格单加氧酶催化化合物1(r1为cl)合成手性亚砜类化合物。
[0089]
向50ml的烧杯中加入16mg kred,4mg nadp
+
,4mg catalase(过氧化氢酶)，400μl ipa(异丙醇)，800μldmso及18.8ml 100mmol/l、ph＝8.0的teoa缓冲液，搅拌直到得到均匀的溶液。从烧杯中取出2ml的溶液加入到10.0ml的反应瓶中，并向溶液中添加0.04g的化合物1(r1为cl)和0.004g拜耳威利格单加氧酶突变体476。漩涡震荡混匀所得的溶液后于27℃条件下反应18h。结束后取出反应液，并用三倍体积的正丁醇进行萃取之后取出有机相，在-0.09mpa(表压)的真空度下减压蒸馏，最终得到产物0.0382g(收率为95.4％)，转化率为99.5％。通过sfc(超临界流体色谱)检测，s构型手性亚砜的对映异构体过量值(e.e.)为99.5％。产物经核磁检测，结果显示，产物的纯度大于98％。
[0090]
实施例7在teoa-hcl(三乙醇胺)缓冲液中拜耳威利格单加氧酶催化化合物1(r1为cl)合成手性亚砜类化合物。
[0091]
向50ml的烧杯中加入16mg kred,4mg nadp
+
,4mg catalase(过氧化氢酶)，400μl ipa(异丙醇)，800μldmso及18.8ml 100mmol/l、ph＝8.0的teoa缓冲液，搅拌直到得到均匀的溶液。从烧杯中取出2ml的溶液加入到10.0ml的反应瓶中，并向溶液中添加0.04g的化合物1(r1为cl)和0.0008g拜耳威利格单加氧酶突变体476。漩涡震荡混匀所得的溶液后于27℃条件下反应18h。结束后取出反应液，并用三倍体积的正丁醇进行萃取之后取出有机相，在-0.09mpa(表压)的真空度下减压蒸馏，最终得到产物0.0362g(收率为90.5％)，转化率为92.4％。通过sfc(超临界流体色谱)检测，s构型手性亚砜的对映异构体过量值(e.e.)为99.4％。产物经核磁检测，结果显示，产物的纯度大于98％。
[0092]
实施例8在teoa-hcl(三乙醇胺)缓冲液中拜耳威利格单加氧酶催化化合物1(r1为cl)合成手性亚砜类化合物。
[0093]
向500ml的烧杯中加入80mg kred,20mg nadp
+
,20mg catalase(过氧化氢酶)，2ml ipa(异丙醇)，4ml dmso及94ml 100mmol/l、ph＝8.0的teoa缓冲液，搅拌直到得到均匀的溶液。从烧杯中取出50ml的溶液加入到250ml的夹套瓶中，并向溶液中添加1g的化合物1(r1为cl)和0.2g拜耳威利格单加氧酶突变体476。漩涡震荡混匀所得的溶液后于27℃条件下反应18h。结束后取出反应液，并用三倍体积的正丁醇进行萃取之后取出有机相，在-0.09mpa(表压)的真空度下减压蒸馏，最终得到产物0.0383g(收率为95.8％)，转化率为99.4％。通过sfc(超临界流体色谱)检测，s构型手性亚砜的对映异构体过量值(e.e.)为99.5％。产物经核磁检测，结果显示，产物的纯度大于98％。
[0094]
实施例9在teoa-hcl(三乙醇胺)缓冲液中拜耳威利格单加氧酶催化化合物1(r1为i)合成手性亚砜类化合物。
[0095]
向50ml的烧杯中加入16mg kred,4mg nadp
+
,4mg catalase(过氧化氢酶)，400μl ipa(异丙醇)，800μldmso及18.8ml 100mmol/l、ph＝8.5的teoa缓冲液，搅拌直到得到均匀的溶液。从烧杯中取出2ml的溶液加入到10.0ml的反应瓶中，并向溶液中添加0.04g的化合物1(r1为i)和0.004g拜耳威利格单加氧酶突变体466。漩涡震荡混匀所得的溶液后于27℃
条件下反应18h。结束后取出反应液，并用三倍体积的正丁醇进行萃取之后取出有机相，在-0.09mpa(表压)的真空度下减压蒸馏，最终得到产物0.0381g(收率为95.3％)，转化率为99.2％。通过sfc(超临界流体色谱)检测，s构型手性亚砜的对映异构体过量值(e.e.)为99.5％。产物经核磁检测，结果显示，产物的纯度大于98％。
[0096]
实施例10在teoa-hcl(三乙醇胺)缓冲液中拜耳威利格单加氧酶催化化合物1(r1为i)合成手性亚砜类化合物。
[0097]
向50ml的烧杯中加入16mg kred,4mg nadp
+
,4mg catalase(过氧化氢酶)，400μl ipa(异丙醇)，800μldmso及18.8ml 100mmol/l、ph＝8.5的teoa缓冲液，搅拌直到得到均匀的溶液。从烧杯中取出2ml的溶液加入到10.0ml的反应瓶中，并向溶液中添加0.04g的化合物1(r1为i)和0.004g拜耳威利格单加氧酶突变体383。漩涡震荡混匀所得的溶液后于37℃条件下反应18h。结束后取出反应液，并用三倍体积的正丁醇进行萃取之后取出有机相，在-0.09mpa(表压)的真空度下减压蒸馏，最终得到产物0.0380g(收率为95.1％)，转化率为98.8％。通过sfc(超临界流体色谱)检测，s构型手性亚砜的对映异构体过量值(e.e.)为99.7％。产物经核磁检测，结果显示，产物的纯度大于98％。
[0098]
实施例11在teoa-hcl(三乙醇胺)缓冲液中拜耳威利格单加氧酶催化化合物1(r1为i)合成手性亚砜类化合物。
[0099]
向50ml的烧杯中加入16mg kred,4mg nadp
+
,4mg catalase(过氧化氢酶)，400μl ipa(异丙醇)，800μldmso及18.8ml 100mmol/l、ph＝8.5的teoa缓冲液，搅拌直到得到均匀的溶液。从烧杯中取出2ml的溶液加入到10.0ml的反应瓶中，并向溶液中添加0.04g的化合物1(r1为i)和0.004g拜耳威利格单加氧酶突变体83。漩涡震荡混匀所得的溶液后于47℃条件下反应18h。结束后取出反应液，并用三倍体积的正丁醇进行萃取之后取出有机相，在-0.09mpa(表压)的真空度下减压蒸馏，最终得到产物0.0381g(收率为95.2％)，转化率为99.3％。通过sfc(超临界流体色谱)检测，s构型手性亚砜的对映异构体过量值(e.e.)为99.4％。产物经核磁检测，结果显示，产物的纯度大于98％。
[0100]
实施例12在teoa-hcl(三乙醇胺)缓冲液中拜耳威利格单加氧酶催化化合物1(r1为i)合成手性亚砜类化合物。
[0101]
向50ml的烧杯中加入16mg kred,4mg nadp
+
,4mg catalase(过氧化氢酶)，400μl ipa(异丙醇)，800μldmso及18.8ml 100mmol/l、ph＝9.0的teoa缓冲液，搅拌直到得到均匀的溶液。从烧杯中取出2ml的溶液加入到10.0ml的反应瓶中，并向溶液中添加0.04g的化合物1(r1为i)和0.004g拜耳威利格单加氧酶突变体450。漩涡震荡混匀所得的溶液后于27℃条件下反应18h。结束后取出反应液，并用三倍体积的正丁醇进行萃取之后取出有机相，在-0.09mpa(表压)的真空度下减压蒸馏，最终得到产物0.0382g(收率为95.4％)，转化率为98.9％。通过sfc(超临界流体色谱)检测，s构型手性亚砜的对映异构体过量值(e.e.)为99.4％。产物经核磁检测，结果显示，产物的纯度大于98％。
[0102]
实施例13在teoa-hcl(三乙醇胺)缓冲液中拜耳威利格单加氧酶催化化合物1(r1为h)合成手性亚砜类化合物。
[0103]
向50ml的烧杯中加入16mg kred,4mg nadp
+
,4mg catalase(过氧化氢酶)，400μl ipa(异丙醇)，800μldmso及18.8ml 100mmol/l、ph＝9.0的teoa缓冲液，搅拌直到得到均匀的溶液。从烧杯中取出2ml的溶液加入到10.0ml的反应瓶中，并向溶液中添加0.04g的化合
物1(r1为h)和0.004g拜耳威利格单加氧酶突变体336。漩涡震荡混匀所得的溶液后于37℃条件下反应18h。结束后取出反应液，并用三倍体积的正丁醇进行萃取之后取出有机相，在-0.09mpa(表压)的真空度下减压蒸馏，最终得到产物0.0375g(收率为93.6％)，转化率为96.5％。通过sfc(超临界流体色谱)检测，s构型手性亚砜的对映异构体过量值(e.e.)为99.1％。产物经核磁检测，结果显示，产物的纯度大于98％。
[0104]
实施例14在teoa-hcl(三乙醇胺)缓冲液中拜耳威利格单加氧酶催化化合物1(r1为h)合成手性亚砜类化合物。
[0105]
向50ml的烧杯中加入16mg kred,4mg nadp
+
,4mg catalase(过氧化氢酶)，400μl ipa(异丙醇)，800μldmso及18.8ml 100mmol/l、ph＝9.0的teoa缓冲液，搅拌直到得到均匀的溶液。从烧杯中取出2ml的溶液加入到10.0ml的反应瓶中，并向溶液中添加0.04g的化合物1(r1为h)和0.004g拜耳威利格单加氧酶突变体277。漩涡震荡混匀所得的溶液后于47℃条件下反应18h。结束后取出反应液，并用三倍体积的正丁醇进行萃取之后取出有机相，在-0.09mpa(表压)的真空度下减压蒸馏，最终得到产物0.0381g(收率为95.3％)，转化率为99.4％。通过sfc(超临界流体色谱)检测，s构型手性亚砜的对映异构体过量值(e.e.)为99.5％。产物经核磁检测，结果显示，产物的纯度大于98％。
[0106]
实施例15在teoa-hcl(三乙醇胺)缓冲液中拜耳威利格单加氧酶催化化合物1(r1为h)合成手性亚砜类化合物。
[0107]
向50ml的烧杯中加入16mg kred,4mg nadp
+
,4mg catalase(过氧化氢酶)，400μl ipa(异丙醇)，800μldmso及18.8ml 100mmol/l、ph＝7.0的teoa缓冲液，搅拌直到得到均匀的溶液。从烧杯中取出2ml的溶液加入到10.0ml的反应瓶中，并向溶液中添加0.04g的化合物1(r1为h)和0.004g拜耳威利格单加氧酶突变体446。漩涡震荡混匀所得的溶液后于27℃条件下反应18h。结束后取出反应液，并用三倍体积的正丁醇进行萃取之后取出有机相，在-0.09mpa(表压)的真空度下减压蒸馏，最终得到产物0.0383g(收率为95.7％)，转化率为99.2％。通过sfc(超临界流体色谱)检测，s构型手性亚砜的对映异构体过量值(e.e.)为99.5％。产物经核磁检测，结果显示，产物的纯度大于98％。
[0108]
实施例16在teoa-hcl(三乙醇胺)缓冲液中拜耳威利格单加氧酶催化化合物1(r1为h)合成手性亚砜类化合物。
[0109]
向50ml的烧杯中加入16mg kred,4mg nadp
+
,4mg catalase(过氧化氢酶)，400μl ipa(异丙醇)，800μldmso及18.8ml 100mmol/l、ph＝7.0的teoa缓冲液，搅拌直到得到均匀的溶液。从烧杯中取出2ml的溶液加入到10.0ml的反应瓶中，并向溶液中添加0.04g的化合物1(r1为h)和0.004g拜耳威利格单加氧酶突变体117。漩涡震荡混匀所得的溶液后于37℃条件下反应18h。结束后取出反应液，并用三倍体积的正丁醇进行萃取之后取出有机相，在-0.09mpa(表压)的真空度下减压蒸馏，最终得到产物0.0381g(收率为95.2％)，转化率为97.8％。通过sfc(超临界流体色谱)检测，s构型手性亚砜的对映异构体过量值(e.e.)为98.3％。产物经核磁检测，结果显示，产物的纯度大于98％。
[0110]
实施例17在teoa-hcl(三乙醇胺)缓冲液中拜耳威利格单加氧酶催化化合物1(r1为me)合成手性亚砜类化合物。
[0111]
向50ml的烧杯中加入16mg kred,4mg nadp
+
,4mg catalase(过氧化氢酶)，400μl ipa(异丙醇)，800μldmso及18.8ml 100mmol/l、ph＝7.0的teoa缓冲液，搅拌直到得到均匀
ipa(异丙醇)，800μldmso及8.8ml 100mmol/l、ph＝8.0的pbs缓冲液，搅拌直到得到均匀的溶液。从烧杯中取出2ml的溶液加入到10.0ml的反应瓶中，并向溶液中添加0.04g的化合物1(r1为ome)和0.004g拜耳威利格单加氧酶突变体23。漩涡震荡混匀所得的溶液后于27℃条件下反应18h。结束后取出反应液，并用三倍体积的正丁醇进行萃取之后取出有机相，在-0.09mpa(表压)的真空度下减压蒸馏，最终得到产物0.0371g(收率为92.8％)，转化率为95.6％。通过sfc(超临界流体色谱)检测，s构型手性亚砜的对映异构体过量值(e.e.)为98.9％。产物经核磁检测，结果显示，产物的纯度大于98％。
[0120]
实施例22在pbs(磷酸盐)缓冲液中拜耳威利格单加氧酶催化化合物1(r1为ome)合成手性亚砜类化合物。
[0121]
向50ml的烧杯中加入16mg kred,4mg nadp
+
,4mg catalase(过氧化氢酶)，400μl ipa(异丙醇)，800μldmso及18.8ml 100mmol/l、ph＝8.0的pbs缓冲液，搅拌直到得到均匀的溶液。从烧杯中取出2ml的溶液加入到10.0ml的反应瓶中，并向溶液中添加0.04g的化合物1(r1为ome)和0.004g拜耳威利格单加氧酶突变体370。漩涡震荡混匀所得的溶液后于27℃条件下反应18h。结束后取出反应液，并用三倍体积的正丁醇进行萃取之后取出有机相，在-0.09mpa(表压)的真空度下减压蒸馏，最终得到产物0.0383g(收率为95.8％)，转化率为99.2％。通过sfc(超临界流体色谱)检测，s构型手性亚砜的对映异构体过量值(e.e.)为99.2％。产物经核磁检测，结果显示，产物的纯度大于98％。
[0122]
实施例23在tris-hcl缓冲液中拜耳威利格单加氧酶催化化合物1(r1为ome)合成手性亚砜类化合物。
[0123]
向50ml的烧杯中加入16mg kred,4mg nadp
+
,4mg catalase(过氧化氢酶)，400μl ipa(异丙醇)，800μldmso及8.8ml 100mmol/l、ph＝8.0的tris-hcl缓冲液，搅拌直到得到均匀的溶液。从烧杯中取出2ml的溶液加入到10.0ml的反应瓶中，并向溶液中添加0.04g的化合物1(r1为ome)和0.004g拜耳威利格单加氧酶突变体145。漩涡震荡混匀所得的溶液后于27℃条件下反应18h。结束后取出反应液，并用三倍体积的正丁醇进行萃取之后取出有机相，在-0.09mpa(表压)的真空度下减压蒸馏，最终得到产物0.0334g(收率为83.5％)，转化率为87.0％。通过sfc(超临界流体色谱)检测，s构型手性亚砜的对映异构体过量值(e.e.)为98.9％。产物经核磁检测，结果显示，产物的纯度大于98％。
[0124]
实施例24在tris-hcl缓冲液中拜耳威利格单加氧酶催化化合物1(r1为ome)合成手性亚砜类化合物。
[0125]
向50ml的烧杯中加入16mg kred,4mg nadp
+
,4mg catalase(过氧化氢酶)，400μl ipa(异丙醇)，800μldmso及18.8ml 100mmol/l、ph＝8.0的tris-hcl缓冲液，搅拌直到得到均匀的溶液。从烧杯中取出2ml的溶液加入到10.0ml的反应瓶中，并向溶液中添加0.04g的化合物1(r1为ome)和0.004g拜耳威利格单加氧酶突变体273。漩涡震荡混匀所得的溶液后于27℃条件下反应18h。结束后取出反应液，并用三倍体积的正丁醇进行萃取之后取出有机相，在-0.09mpa(表压)的真空度下减压蒸馏，最终得到产物0.0383g(收率为95.8％)，转化率为99.4％。通过sfc(超临界流体色谱)检测，s构型手性亚砜的对映异构体过量值(e.e.)为99.5％。产物经核磁检测，结果显示，产物的纯度大于98％。
[0126]
实施例25在硼酸钠缓冲液中拜耳威利格单加氧酶催化化合物1(r1为cl)合成手性亚砜类化合物。
[0127]
向50ml的烧杯中加入16mg kred,4mg nadp
+
,4mg catalase(过氧化氢酶)，400μl ipa(异丙醇)，800μl dmso及8.8ml 25mmol/l、ph＝8.0的硼酸钠缓冲液，搅拌直到得到均匀的溶液。从烧杯中取出2ml的溶液加入到10.0ml的反应瓶中，并向溶液中添加0.04g的化合物1(r1为cl)和0.004g拜耳威利格单加氧酶突变体63。漩涡震荡混匀所得的溶液后于27℃条件下反应18h。结束后取出反应液，并用三倍体积的正丁醇进行萃取之后取出有机相，在-0.09mpa(表压)的真空度下减压蒸馏，最终得到产物0.0380g(收率为95.1％)，转化率为98.6％。通过sfc(超临界流体色谱)检测，s构型手性亚砜的对映异构体过量值(e.e.)为99.3％。产物经核磁检测，结果显示，产物的纯度大于98％。
[0128]
实施例26在硼酸钠缓冲液中拜耳威利格单加氧酶催化化合物1(r1为cl)合成手性亚砜类化合物。
[0129]
向50ml的烧杯中加入16mg kred,4mg nadp
+
,4mg catalase(过氧化氢酶)，400μl ipa(异丙醇)，800μldmso及18.8ml 25mmol/l、ph＝8.0的硼酸钠缓冲液，搅拌直到得到均匀的溶液。从烧杯中取出2ml的溶液加入到10.0ml的反应瓶中，并向溶液中添加0.04g的化合物1(r1为cl)和0.004g拜耳威利格单加氧酶突变体47。漩涡震荡混匀所得的溶液后于27℃条件下反应18h。结束后取出反应液，并用三倍体积的正丁醇进行萃取之后取出有机相，在-0.09mpa(表压)的真空度下减压蒸馏，最终得到产物0.0382g(收率为95.6％)，转化率为99.2％。通过sfc(超临界流体色谱)检测，s构型手性亚砜的对映异构体过量值(e.e.)为99.2％。产物经核磁检测，结果显示，产物的纯度大于98％。
[0130]
实施例27通过sfc(超临界流体色谱)检测产物的转化率和手性，具体分析方法如下：
[0131][0132]
当r1为cl时，化合物1的保留时间为0.782min，产物s构型手性亚砜的保留时间为1.008min，异构体r构型手性亚砜的保留时间为1.132min；
[0133]
当r1为f时，化合物1的保留时间为0.836min，产物s构型手性亚砜的保留时间为1.125min，异构体r构型手性亚砜的保留时间为1.307min；
[0134]
当r1为i时，化合物1的保留时间为0.778min，产物s构型手性亚砜的保留时间为1.003min，异构体r构型手性亚砜的保留时间为1.126min；
[0135]
当r1为h时，化合物1的保留时间为0.650min，产物s构型手性亚砜的保留时间为
0.811min，异构体r构型手性亚砜的保留时间为0.923min；
[0136]
当r1为me时，化合物1的保留时间为0.682min，产物s构型手性亚砜的保留时间为0.853min，异构体r构型手性亚砜的保留时间为0.976min；
[0137]
当r1为meo时，化合物1的保留时间为0.752min，产物s构型手性亚砜的保留时间为0.935min，异构体r构型手性亚砜的保留时间为1.051min。
[0138]
拜耳威利格单加氧酶突变体文库的构建：
[0139]
针对seq id no:2的第3位、第14位、第34位、第43位、第71位、第111位、第141位、第143位、第144位、第149位、第174位、第209位、第240位、第246位、第248位、第277位、第288位、第307位、第326位、第327位、第341位、第383位、第386位、第388位、第390位、第400位、第415位、第426位、第432位、第433位、第434位、第435位、第438位、第448位、第449位、第464位、第481位、第488位、第489位、第490位、第505位、第516位、第526位、第537位和第540位中的一个或多个。
[0140]
在如seq id no:2的氨基酸序列所示野生型拜耳威利格单加氧酶上进行如下突变，获得本发明的酶突变体1-突变体502，具体突变位点和种类如表3所示，反应条件与实施例1相同，不同之处为反应的催化酶的突变体替换为表3中突变体，反应效果如表3所示：
[0141]
表3
[0142]
[0143]
[0144]
[0145]
[0146]
[0147]
[0148]
[0149]
[0150]
[0151]
[0152]
[0153]
[0154]
[0155]
[0156]
[0157]
[0158]
[0159]
[0160][0161]
注：表中
“‑”
表示生成反构型(即r构型)。
[0162]
上述实施例含本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。