高原芽孢杆菌SX-3及其在降解工业污水中的应用

高原芽孢杆菌sx-3及其在降解工业污水中的应用
(一)技术领域
1.本发明涉及一种高原芽孢杆菌sx-3及其在降解工业污水中的应用。
(二)

背景技术：

2.cod(chemicaloxygendemand)即化学需氧量，通常用来反应污水中有机污染物的含量，随着经济的发展，皮革、纺织、油漆、染料和制药等行业层出不穷，工业污水的排放量也日益增多，工业污水中cod的组成成分也变得更加复杂，工业污水cod组成成分通常包括多环芳烃(pahs)、酚类、染料、有机重金属等污染物，这种复杂组成导致工业污水cod数值高且难以高效降解。在某些情况下，这些有机污染物存在于工业废物的混合基质中，这对人类、水生生物和整个生态系统造成了严重的健康风险，因为大多数这些混合有机污染物在水中积聚的浓度超过了环境中允许的排放限制。混合有机污染物通过直接排入水体、非点源径流、生活污水和工业废水进而进入水生环境，对人类、水生生物和整个环境都有极高的毒性，因为它们具有致癌性，容易损害重要器官。因此，需要开发实用性、高效性的修复技术来解决工业污水对环境带来的危害。
3.目前来说，工业污水的处理有物理、化学及生物方法。物理技术包括膜分离技术、吸附等，物理方法具有设备尺寸小、能耗低、投资成本低等优点，但由于废水的性质和复杂性的变化，在效率、空间要求、能源、渗透质量和技术技能要求方面都有更多的改进空间；化学技术包括电化学、化学絮凝、高级氧化等，化学方法对可生化性差、相对分子质量大的污水处理能力强，但是该方法投资成本高、运行维修技术复杂；生物方法包括活性污泥法、厌氧生物处理、自然处理法等等，生物法具有应用方便、成本低、绿色环保等优点被认为是具有广阔应用前景的工业污水处理技术，但是由于工业废水的成分极其复杂，污水中含有大量的毒性有机物、重金属离子以及高温、高盐、 ph不稳定等环境因素均会影响常规微生物的生长代谢甚至造成微生物死亡，影响微生物生化系统的运行。在此背景下，微生物强化技术产生，微生物强化技术是通过人工筛选培养土著和外来优势微生物菌株，并进行驯化使其适应工业污水复杂的环境及增强高效降解工业污水的能力，最终将高效降解菌株投加到原生态体系中和有针对性的提高高效降解菌株在微生物种群中的比例。微生物强化技术具有对环境扰动小、降解效率高、不产生二次污染及运行成本低等优点，这一技术的关键是从环境中筛选得到高效降解工业污水的优良菌株。
4.目前国内外研究者已经从环境中分离出很多能够对工业污水达到降解目的的菌株，主要包括芽孢杆菌、假单胞菌、酵母菌、光合细菌等等，但是，目前为止通过微生物强化技术处理工业污水的成功案例很少，主要原因就是对工业污水高效降解的菌株资源还是不够丰富，各种菌株对工业污水中能够降解的有机物的种类有限，降解效率不高。对于工业污水中的某些大分子、有毒有机物仅仅靠几种降解菌株是无法将其完全降解的。因此，从环境中筛选出更多对工业污水有高效降解作用的菌株非常重要。
5.微生物对工业污水的降解有两种方式：(1)微生物处理工业污水依靠自身新陈代谢作用，利用污水中的有机物作为其自身生长代谢所需的碳源，从而使得污水中有机物转
化为co2、h2o等无机物而达到降解污水的目的；(2)微生物通过共代谢作用来处理工业污水，即微生物在利用污水中某些有机物作为其自身生长基质，将这类有机物降解的同时会将污水中一些不能被利用的有机物(非生长基质)转化为其他有机物。因此，需要不断从环境中筛选高效降解工业污水的微生物菌株，扩充工业污水降解菌株资源，为微生物强化技术处理工业污水提供足够的微生物菌种资源，同时也为后续工程菌的构建及微生物菌剂开发提供资源。
(三)

技术实现要素：

6.本发明目的是提供从污水厂活性污泥中筛选的一株工业污水高效降解菌株
ꢀ‑‑
bacillus altitudinis sx-3及其降解工业污水的应用，解决目前工业污水高效降解菌株从环境中较难分离及当前工业污水降解菌株微生物资源不够丰富的问题。
7.本发明采用的技术方案是：
8.本发明提供一种新菌株
‑‑
高原芽孢杆菌sx-3(bacillus altitudinis sx-3)，保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏日期：2022年5月19日，保藏编号：cctccno:m 2022669，地址：中国武汉，武汉大学，邮政编码：430072。
9.本发明所述高原芽孢杆菌sx-3为革兰氏阳性菌，在lb培养基琼脂平板上菌落为乳白色、圆形、表面湿润，且能在7％高盐lb平板生长良好，同时菌株sx-3在相差显微镜下细胞呈直杆状，大小(0.2-1.2)μm
×
(2.5-6)μm，单个、成对或栅栏状排列。
10.本发明还提供一种所述高原芽孢杆菌sx-3在降解工业污水中的应用，所述工业污水cod为200-500mg/l，nh
3-n为10-20mg/l、tn为20-30mg/l，优选污水cod266mg/l，nh
3-n 16.12mg/l、tn 27.8mg/l。
11.进一步，所述的应用方法为：将高原芽孢杆菌sx-3菌液加入工业污水中，在 30-40℃(优选30℃)好氧条件下处理，实现工业污水的降解；所述菌液中菌体浓度为1.0
×
10
10-2.8
×
10
11
cfu/l(优选2.8
×
10
11
cfu/l)，所述菌液与污水体积比为1： 1000-10000(优选1：10000)；所述好氧是指溶解氧为1-5mg/l，优选2mg/l。
12.进一步，所述高原芽孢杆菌sx-3菌液按如下方法制备：(1)将高原芽孢杆菌 sx-3接种至lb固体培养基平板，37℃恒温培养箱培养24h；lb固体培养基：nacl 10g/l、胰蛋白胨10g/l、酵母提取物5g/l，琼脂20g/l，溶剂为水；
13.(2)挑取步骤(1)菌落接种至lb液体培养基，37℃、180rpm恒温摇床培养 24h，获得一级种子液；lb液体培养基：nacl 10g/l、胰蛋白胨10g/l、酵母提取物 5g/l，溶剂为水；
14.(3)将步骤(2)一级种子液按体积浓度2％的接种量分别接种至lb液体培养基(组成同步骤2)中，37℃、180rpm摇床培养1d，获得高原芽孢杆菌sx-3菌液。
15.与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：本发明提供了从活性污泥中筛选得到的一株工业污水高效降解菌株
‑‑
高原芽孢杆菌sx-3，该菌株7d内对工业污水的降解率达56％，同时该菌株实际处理工业污水规模为50t，按1/10000投加量投加 sx-3菌液5l，增氧机控制溶解氧(do)2mg/l，30℃处理条件下，4d内菌株sx-3 对绍兴某污水厂工业污水cod降解率可达28.0％，nh
3-n降解率可达90.2％，tn降解率可达28.1％。高原芽孢杆菌sx-3菌株有应用于工业污水的生物修复工程中的可能，促进工业污水的降解。
(四)附图说明
16.图1为菌株sx-3的菌落形态图。
17.图2为菌株sx-3的显微照片。
18.图3为菌株sx-3在7％高盐lb平板上的生长状况。
19.图4为菌株sx-3的生长曲线图。
(五)具体实施方式
20.下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：本发明所述室温为25-30℃。
21.实施例1：工业污水高效降解菌株的筛选
22.本发明通过对活性污泥的富集驯化、分离纯化及工业污水降解性实验筛选出工业污水高效降解菌株，具体实施方法如下：
23.(1)活性污泥富集驯化。
24.本发明所用的活性污泥取自浙江省绍兴市柯桥区马鞍镇江滨路绍兴水处理发展有限公司三期污水处理氧化沟工艺段。所用工业污水是指绍兴某污水厂高效沉淀池出水，cod为500mg/l。
25.在250ml的锥形瓶中加入80ml无机盐培养基，20ml工业污水作为微生物生长的生长基质，共100ml混合液作为第一次驯化培养基，向其中加入5g活性污泥， 180rpm、37℃恒温摇床培养7d(以混合培养液明显变浑浊或检测培养液od值明显增大作为传代依据)。
26.取第一次驯化培养7天的混合液10ml添加到装有40ml工业污水和50ml新鲜无机盐培养基的锥形瓶中，相同培养条件下进行第二次驯化7d，最后取第二次驯化混合液10ml到装有70ml工业污水和20ml新鲜无机盐培养基的锥形瓶中，相同培养条件进行第三次驯化7d。
27.无机盐培养基配方：1g/l k2hpo4、1g/l kh2po4、1g/l(nh4)2so4、0.2g/lmgso4·
7h2o、0.02g/l cacl2、1ml/l微量元素溶液，溶剂为去离子水；微量元素溶液组成：2.5g/l feso4·
7h2o、0.3g/l mnso4·
h2o、0.5g/l(nh4)6mo7o
24
·
4h2o、1g/lznso4·
7h2o，溶剂为去离子水。
28.(2)菌株分离纯化。
29.取第三次驯化后的混合液，8000rpm离心5min，弃上清液，收集菌体并用无菌水将菌体稀释成10-2
、10-3
、10-4
、10-5
、10-6
五个梯度，然后将不同梯度的稀释液涂布到固体选择培养基平板上，置于37℃恒温培养箱培养，每天观察平板上菌株的生长情况，并将能够生长的菌株挑取出来，多次划线转接到固体富集培养基平板上，直到平板上菌株菌落形态一致，并且显微镜观察是否为单一菌株，筛选得到3种单一菌株，分别记为菌株sx-1、菌株sx-2和菌株sx-3。
30.固体选择培养基组成：1g/l k2hpo4、1g/l kh2po4、1g/l(nh4)2so4、0.2g/l mgso4·
7h2o、0.02g/l cacl2、1ml/l微量元素溶液、20g/l琼脂，溶剂为工业污水；
31.液体富集培养基组成：1g/l k2hpo4、1g/l kh2po4、1g/l(nh4)2so4、0.2g/lmgso4·
7h2o、0.02g/l cacl2、1ml/l微量元素溶液、10g/l胰蛋白胨，溶剂为工业污水。固体富集培养基是在液体富集培养基中添加20g/l琼脂。
32.微量元素溶液均为：2.5g/l feso4·
7h2o、0.3g/l mnso4·
h2o、0.5g/l (nh4)6mo7o
24
·
4h2o、1g/l znso4·
7h2o，溶剂为去离子水。
33.(3)菌株复筛。
34.将步骤(2)分离纯化后的菌株分别转接于液体富集培养基(组成同步骤2)，180rpm、37℃恒温摇床培养1d；离心(8000rpm 5min)收集菌体，并用无菌水冲洗3 次，冲洗完后重置于无机盐培养基中，od值调节为1.0作为种子液放于4℃冰箱保存备用。
35.实验组：按体积比5：95的比例将种子液：工业污水配制100ml混合液，随后均置于180rpm 37℃恒温摇床培养7d，每隔2d检测一次各混合液的cod，检测方法为重铬酸钾法(gb11914-89)。根据cod去除率判断各菌株降解性能的优劣性，结果见表1，复筛得到工业污水降解效果较好的菌株sx-3。同样条件下，将种子液经 121℃高温灭菌30min后代替实验组中种子液作为对照组。
36.硫酸亚铁铵标定方法：向500ml锥形瓶中加入10ml配制好的重铬酸钾标准溶液，再加入100ml去离子水，随后加入30ml浓硫酸(98％)，摇晃均匀后，静置冷却至室温，随后加入3滴试亚铁灵指示剂，摇晃使颜色均匀，最后用硫酸亚铁铵标准溶液来滴定，溶液颜色由黄色—蓝绿色—红褐色即为终点。根据公式(1)计算硫酸亚铁铵浓度。
37.重铬酸钾标准溶液(1/6k2cro7＝0.2500mol/l)：称取干燥的重铬酸钾12.258g溶于蒸馏水中，移入100ml容量瓶，稀释至标线，摇匀。
38.硫酸亚铁铵标准溶液[(nh4)2fe(so4)2·
6h2o≈0.1mol/l]：称取39.5g硫酸亚铁铵溶于蒸馏水中，边搅拌边缓慢加入20ml浓硫酸，冷却后移入1000ml容量瓶中，加蒸馏水稀释至标线，摇匀。
[0039]
亚铁灵指示剂：称取1.485g邻菲啰啉(c12h8n2·
h2o)，0.695g硫酸亚铁 (feso4·
7h2o)溶于水，稀释至100ml，储于棕色瓶。
[0040]
c[(nh4)2fe(so4)2·
6h2o]＝(0.2500
×
10.00)/v 公式(1)
[0041]
c-硫酸亚铁铵的浓度(mol/l)；
[0042]
v-硫酸亚铁铵标准溶液的滴定用量(ml)。
[0043]
cod测定方法：向250ml锥形瓶中加入20ml待测水样，随后量取10ml重铬酸钾标准溶液加入锥形瓶中，连接好冷凝装置，从冷凝管上口倒入事先量取好的30ml 硫酸-硫酸银溶液，慢慢晃动锥形瓶使溶液混匀，加热锥形瓶，当锥形瓶中溶液开始沸腾时计时2小时。冷却后，用90ml蒸馏水冲洗冷凝管壁，取下锥形瓶。溶液再度冷却后，加3滴试亚铁灵指示剂，用硫酸亚铁铵标准溶液滴定，溶液由黄色经蓝绿色至红褐色即为终点，记录硫酸亚铁铵标准溶液的用量。测定水样的同时，以蒸馏水按同样步骤做空白实验。根据公式(2)计算cod值，根据公式(3)计算cod降解率。
[0044]
cod(mg/l)＝c(v
0-v1)8
×
1000/v 公式(2)
[0045]
公式(2)中c-硫酸亚铁铵标准溶液的浓度(mol/l)；
[0046]v0-滴定空白时硫酸亚铁铵标准溶液用量(ml)；
[0047]v1-滴定水样时硫酸亚铁铵标准溶液用量(ml)；
[0048]
v-水样的体积(ml)。
[0049]
cod
去除率
＝(c
样品菌株-c
ck
)/c
ck
ꢀꢀ
公式(3)
[0050]
公式(3)中，c
样品菌株-加入降解菌株样品cod(mg/l)
[0051]cck-无菌对照水样的cod(mg/l)
[0052]
最终筛选的菌株sx-3对工业污水降解效果最好(表1)，在实验室180rpm 37℃条件下，sx-3对工业污水最终降解率可达56％。
[0053]
表1、各初筛菌株对工业污水降解效果
[0054][0055]
(4)菌株鉴定。
[0056]
将菌株sx-3送至杭州擎科生物公司进行16s rdna测序，采用16s细菌通用引物27f和1492r扩增，序列长度为1375bp，随后将16srdna序列(seq id no.1) 提交ncbi数据库中进行序列比对分析，结果显示，菌株sx-3与bacillus altitudinis 同源性最高，因此确定该菌株sx-3为高原芽孢杆菌。16s rdna序列已经上传于 genbank数据库，登录号为ol664046。
[0057]
菌株sx-3序列：
[0058]
gttacctcaccgacttcgggtgttgcaactctcgtggtgtgacgggcggtg tgtacaaggcccgggaacgtattcaccgcggcatgctgatccgcgattactagc gattccagcttcacgcagtcgagttgcagactgcgatccgaactgagaacagat ttgtgggattggctaaaccttgcggtctcgcagccctttgttctgtccattgtag cacgtgtgtagcccaggtcataaggggcatgatgatttgacgtcatccccacctt cctccggtttgtcaccggcagtcaccttagagtgcccaactgaatgctggcaac taagatcaagggttgcgctcgttgcgggacttaacccaacatctcacgacacga gctgacgacaaccatgcaccacctgtcactctgtccccgaagggaaagccctat ctctagggttgtcagaggatgtcaagacctggtaaggttcttcgcgttgcttcg aattaaaccacatgctccaccgcttgtgcgggcccccgtcaattcctttgagttt cagtcttgcgaccgtactccccaggcggagtgcttaatgcgttagctgcagcac taaggggcggaaaccccctaacacttagcactcatcgtttacggcgtggactac cagggtatctaatcctgttcgctccccacgctttcgctcctcagcgtcagttaca gaccagagagtcgccttcgccactggtgttcctccacatctctacgcatttcacc gctacacgtggaattccactctcctcttctgcactcaagtttcccagtttccaat gaccctccccggttgagccgggggctttcacatcagacttaagaaaccgcctgc gagccctttacgcccaataattccggacaacgcttgccacctacgtattaccgcg gctgctggcacgtagttagccgtggctttctggttaggtaccgtcaaggtgcaa gcagttactcttgcacttgttcttccctaacaacagagctttacgatccgaaaac cttcatcactcacgcggcgttgctccgtcagactttcgtccattgcggaagattc cctactgctgcctcccgtaggagtctgggccgtgtctcagtcccagtgtggccg atcaccctctcaggtcggctacgcatcgtcgccttggtgagccgttacctcacca actagctaatgcgccgcgggtccatctgtaagtgacagccgaaaccgtctttca tccttgaaccatgcggttcaaggaactatccggtattagctccggtttcccggag ttatcccagtcttacaggcaggttacccacgtgttactcacccgtccgccgctaa catccgggagcaagct.
[0059]
将菌株sx-3接种至lb培养基平板上，37℃培养1d，如图1所示，在lb固体培养基平板上，该菌落呈圆形，乳白色，直径0.1-0.4mm，表面湿润无光泽，边缘整齐。菌株sx-3的菌落显微图如图2所示，菌株sx-3在相差显微镜下细胞呈直杆状，大小(0.2-1.2)μm
×
(2.5-6)μ
m，单个、成对或栅栏状排列。
[0060]
lb液体培养基：nacl 10g/l、胰蛋白胨10g/l、酵母提取物5g/l，溶剂为水。lb 固体培养基是在lb液体培养基中添加琼脂20g/l。
[0061]
因此，将菌株sx-3鉴定为高原芽孢杆菌，命名为高原芽孢杆菌(bacillusaltitudinis)sx-3，保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)，地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号，邮政编码：430072，保藏日期：2022年5月19日，cctcc 保藏编号：cctcc m 2022669。
[0062]
实施例2：高原芽孢杆菌sx-3生长曲线测定
[0063]
将高原芽孢杆菌sx-3转接到lb液体培养基，37℃180rpm恒温摇床培养，每半小时取样一次，在od
600
nm下检测吸光值，绘制生长曲线。如图4，实验结果表明菌株sx-3在2h左右进入对数生长期，5h左右进入生长末期，9.5h左右进入生长稳定期，13h左右进入衰亡期。
[0064]
lb液体培养基：nacl 10g/l、胰蛋白胨10g/l、酵母提取物5g/l，溶剂为水。
[0065]
实施例3：高原芽孢杆菌sx-3耐盐度试验
[0066]
为探究高原芽孢杆菌sx-3对高盐度条件下的抗性，对其在不同盐度lb培养基中的生长情况进行探究，具体操作如下：
[0067]
(1)将高原芽孢杆菌sx-3接种至nacl 10g/l的lb液体培养基，37℃180rpm 恒温摇床培养24h，获得种子液。lb液体培养基：nacl 10g/l、胰蛋白胨10g/l、酵母提取物5g/l，溶剂为水。
[0068]
(2)再将种子液分别涂布至nacl 10g/l的lb固体培养基平板，37℃恒温培养箱培养24h，检测该菌株生长状况。lb固体培养基：nacl 10g/l、胰蛋白胨10g/l、酵母提取物5g/l，琼脂20g/l，溶剂为水。
[0069]
(3)将步骤(1)和(2)中nacl浓度分别改为30g/l、50g/l、70g/l、90g/l，其他操作相同。
[0070]
结果表示高原芽孢杆菌sx-3具有广盐性，在10g/l、30g/l、50g/l、70g/l盐度梯度均能良好生长。图3为该菌株在70g/l高盐lb平板上的生长状况。
[0071]
实施例4：sx-3中试菌液的制备
[0072]
sx-3中试菌液采用逐级放大方式进行制备，具体如下：
[0073]
(1)将高原芽孢杆菌sx-3接种至lb固体培养基平板，37℃恒温培养箱培养24h。 lb固体培养基：nacl 10g/l、胰蛋白胨10g/l、酵母提取物5g/l，琼脂20g/l，溶剂为水。
[0074]
(2)挑取步骤(1)菌落接种至lb液体培养基100ml，37℃180rpm恒温摇床培养24h，获得一级种子液。lb液体培养基：nacl 10g/l、胰蛋白胨10g/l、酵母提取物5g/l，溶剂为水。
[0075]
(3)将步骤(2)一级种子液按体积浓度2％的接种量分别接种至50个100ml 的lb液体培养基(组成同步骤2)中，37℃180rpm摇床培养1d，合并培养液作为中试菌液，中试菌液量为5l，菌液活菌数为2.8
×
10
11
cfu/l。
[0076]
实施例5：菌株sx-3对50t工业污水的中试降解效果
[0077]
取绍兴某污水厂三期工业污水(cod为266.1mg/l、nh
3-n 16.12mg/l、tn 27.8 mg/l)50t，按1/10000投加量加入实施例4方法制备的sx-3菌液5l，30℃好氧处理 4d，溶解氧控制在2mg/l，每隔6h采用多参数水质消解仪(连华科技cod氨氮检测仪5b-3c、连华科技总氮检测仪lh-tn100)检测一次cod、nh
3-n、tn，结果见表 2所示。最终菌株sx-3对cod降解率可
达28.0％，对nh
3-n降解率达90.2％，对 tn降解率达28.1％。
[0078]
表2、菌株sx-3对50t工业污水中试降解效果
[0079]