适合体外合成RNA的T7-RNA聚合酶突变体及其应用

本发明涉及核酸工具酶与核酸生物领域，特别涉及适合体外合成rna的t7-rna聚合酶突变体及其应用。

背景技术：

1、rna(核糖核酸)作为遗传信息传递过程中一类极其重要的生物大分子，在自然界中广泛存在。除最初鉴定的三大类rna：mrna、rrna以及trna外，近些年陆续发现的几类新颖rna也迅速成为rna研究中的热点，如microrna(mirna)(cheng et al.,2005)、long non-coding rna(lncrna)(dey et al.,2014)、circular rnas(circrna)(memczak et al.,2013)等。此外，随着rna相关研究的逐步深入，rna在疾病治疗方面的价值也慢慢凸显出来，例如体外合成的mrna有望成为蛋白质药物的绝佳替代品，而sirna则有望成为靶向治疗领域的重要药物(sahin et al.,2014；wittrup et al.,2015)。一些大型制药公司如merck、shire等都已经着手研发rna药物。体外合成的mrna因具有可在体内瞬时表达蛋白、生产方便等优点，也已被作为一类全新的疫苗——mrna疫苗被推广应用(pardiet al.,2018)。

2、伴随着rna相关研究的大量开展以及应用的迅速推广，业内迎来了供给高质量rna的巨大挑战。rna体外合成主要依赖化学合成和酶法合成两种方法。化学合成仅适用于合成短链rna，其合成成本会随着rna长度的增加急剧上升；当需要合成的rna长度超过100个核苷酸时，由于生产成本的限制，化学合成法已不适用。然而，编码蛋白质的mrna常常有几千个核苷酸，因此，酶法合成是目前制备长链mrna的最佳方案。

3、癞子短尾噬菌体编码的单亚基rna聚合酶具有结构简单、体外转录效率高等显著优点，现已被广泛应用于体外转录合成rna，其中应用最广泛的是来自大肠杆菌噬菌体t7的单亚基rna聚合酶。t7rna聚合酶于上世纪70年代被鉴定，此后广泛应用于rna的体外合成、体内蛋白表达(细菌高表达系统)等(davanloo et al.,1984)，近年来t7rna聚合酶转录系统在合成生物学中也发挥了重要作用(wang et al.,2018)。然而，t7rna聚合酶虽然优点显著，但其作为体外rna合成工具也存在一些无法忽略的缺点，它在合成rna的过程中会产生很多的副产物，包括转录起始过程中产生的寡核苷酸、遇到终止信号产生的中断rna产物、rdrp活性造成的3’末端延伸产物等(katalin et al.,2011)。

4、研究发现，两类终止信号可造成t7rna聚合酶转录终止，第一类终止信号是由rna形成的茎环结构，第二类终止信号是特定的碱基序列—5’-haucuguu-3’(macdonald etal.,1994)。尽管存在一些纯化方法，比如高效液相色谱(hplc)，能够去除转录终止造成的副产物，但在大规模生产中使用这种纯化方法会大大增加生产成本，而且纯化流程的增加也会降低rna药物的稳定性。因而开发新的rna合成工具酶使其在维持高效转录的同时减少rna转录终止副产物具有非常重要的应用价值。

5、现有技术中，美国专利申请us20190309337a1公开了多种rna聚合酶突变体，其主要针对double-strand rna(双链rna)和run-on rna(末端超长延伸产生的双链rna)两种杂质问题，先采用alanine screen(丙氨酸突变筛选)，把蛋白质一定区域的每个氨基酸逐一突变成丙氨酸，然后用双链rna特异性的抗体筛选产物中双链rna最少的t7-rna聚合酶突变体，结果发现s43a和g47a两个突变体即43位丝氨酸变为丙氨酸及47位甘氨酸变为丙氨酸的突变体，具有减少两种双链rna的特征。

6、国际专利申请wo2004053089a3公开了第172和173位氨基酸同时缺失(δ172-173)的t7rna聚合酶，第140-143位氨基酸同时缺失的sp6rna聚合酶，以及第173和174位氨基酸同时缺失的t3rna聚合酶的。与野生型t7rna聚合酶相比，突变型δ172-173t7rna聚合酶在富含g:c的模板上显示出显着提高的合成速率和产物产率。

7、中国授权专利cn102177236b提供了功能改善的rna聚合酶突变体，通过将构成野生型t7rna聚合酶的氨基酸序列中的786位的谷氨酰胺、179位的赖氨酸以及685位的缬氨酸中的至少1个位置的氨基酸残基被其它氨基酸取代，提高了这种t7rna聚合酶突变体的热稳定性和/或比活性。又例如中国专利申请cn107460177a提供了可利用化学修饰核苷酸的rna聚合酶突变体，通过将构成野生型t7rna聚合酶的氨基酸序列中的632位的精氨酸被半胱氨酸取代的突变体，转录活力提高，并可以掺入2’修饰三磷酸核苷。

8、然而，这些技术依然不能使其在维持高效转录的同时减少rna转录终止副产物。

技术实现思路

1、针对以上现有技术的不足，本发明提供了适合体外合成rna的t7-rna聚合酶突变体及其应用，具体通过以下技术实现。

2、适合体外合成rna的t7-rna聚合酶突变体，是将seq id no.1所示的野生型t7rna聚合酶的氨基酸序列的第173位的精氨酸，被丙氨酸或组氨酸替代后形成。

3、申请人通过噬菌体辅助的定向进化(pace)系统对syn5rna聚合酶转录跨过二类终止信号(5’-haucuguu-3’)的能力进行了筛选(esvelt et al.,2010,bin zhu et al,.2014)，最终我们发现syn5rna聚合酶的h145和t148氨基酸位点对其跨过二类终止信号的能力影响很大。

4、由于syn5rna聚合酶和t7rna聚合酶同属短尾噬菌体单亚基rna聚合酶，我们将二者的三级结构进行了对比，发现在t7rna聚合酶上有与之对应的氨基酸位点，即l170和r173氨基酸位点。于是我们将这两个氨基酸位点及其中间的氨基酸位点分别突变成丙氨酸(l170a、n171a、k172a和r173a)，同时把r173氨基酸位点突变成组氨酸(r173h)，然后通过分子克隆的方法，将突变体基因插入到原核表达载体pqe82l中，在大肠杆菌中进行蛋白表达并纯化。最后申请人通过体外转录的方法检测了t7rna聚合酶突变体的终止效果，发现突变体l170a、r173a和r173h的终止效率显著降低，因此申请人推断l170和r173位点很可能是影响终止的关键位点，并对这一突变点及突变体l170a进行后续研究，最终确认r173a和r173h这两种突变体能够使终止效率大大降低，而l170a降低终止效率不如r173a和r173h显著。

5、上述适合体外合成rna的t7-rna聚合酶突变体在体外转录中的应用。

6、上述的适合体外合成rna的t7-rna聚合酶突变体在非治疗目的的非编码rna或mrna合成中的应用。

7、优选地，所述非编码rna为sgrna、trna、sirna、snorna或寡核苷酸。。

8、上述适合体外合成rna的t7-rna聚合酶突变体在非治疗目的的基因编辑中的应用。

9、上述的适合体外合成rna的t7-rna聚合酶突变体在rna药物合成中的应用。

10、上述的适合体外合成rna的t7-rna聚合酶突变体在非治疗目的的体内蛋白质表达或无细胞蛋白表达体外翻译系统中的应用。

11、上述适合体外合成rna的t7-rna聚合酶突变体在非治疗目的的生物学转录调控元件合成中的应用。

12、需要强调的是，本发明提供的t7-rna聚合酶突变体除了能用于上述非治疗目的的各个研究领域以外，还能用于其他各项与rna转录、翻译有关的研究中。

13、与现有技术相比，本发明的有益之处在于：本发明发现并鉴定了影响t7rna聚合酶响应第二类终止信号的关键氨基酸位点，开发出在产量和纯度上更适用于体外合成rna工具酶，即本发明的t7rna聚合酶突变体。