一种复壮迭代的瓦尼桑黄菌种及其栽培方法和应用

1.本发明属于食用菌技术领域，具体涉及一种复壮迭代的瓦尼桑黄菌种及其栽培方法和应用。


背景技术：

2.桑黄是最早收录于我国中药古籍中的一类大型珍稀药用真菌的总称，广泛分布于我国及北半球不同地区，并生长在桑树、杨树、丁香、忍冬、栎树、锦带花、水曲柳、枣树、核桃楸等多种阔叶树上。瓦尼桑黄(sanghuangporus vaninii) (或称杨树桑黄)是生长在杨树上的一种珍稀药用真菌。关于桑黄的药用功能历代本草著作中均有详细记载药用价值很高，尤其在抗肿瘤方面。有研究对27 种真菌提取多糖的抗癌效果进行比较，发现其中桑黄多糖的肿瘤抑制率高达 96.7％，是目前真菌中抑制肿瘤细胞效果最好的真菌类活性物质，显著优于灵芝及香菇多糖，是未来抗癌药物的重要研发方向之一。已成为国内外医药制剂和保健品研究开发的热点，具有较好的经济效益和社会效益。目前桑黄产业规模正逐年扩大，全国桑黄栽培规模超过2000万段(袋)，形成了具有广阔发展潜力的健康产业。
3.以桑黄多糖为主要成分的药材、药物和保健品具有广阔的市场空间和巨大的商业价值，相关企业也逐步将重心投放在高产多糖的目标菌株以提高自身产品的质量。在另一个珍稀食药菌灵芝中，其灵芝孢子粉具有增强机体免疫力，抑制肿瘤，保护肝损伤和辐射防护等作用，广泛用于肿瘤患者术后的康复、提高机体免疫力。而瓦尼桑黄作为食药用菌的一种，在以往的生产中未发现大量弹射孢子的品种。同时，目前在实际生产中也存在生产品种少，还存在瓦尼桑黄品种在使用1-2年后就面临退化风险，不仅表现在产量下降，更重要的是代表其功效的主要成分，如多糖、三萜、黄酮等生物活性物质活性也大幅下降，严重影响产品质量，由此可见搜集驯化高产桑黄孢子粉新品种的选育工作是非常重要和迫切的。


技术实现要素：

4.本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本技术的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。
5.本发明的qjf-8菌种，分类命名杨树桑黄sanghuangporus vaninii，其于 2022年03月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 (cgmcc)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，其保藏编号为：cgmcc no.40120。
6.瓦尼桑黄新菌种qjf-8，具有能够大量弹射孢子的特点，瓦尼桑黄二三层叠生，呈马蹄形或扇形，木质、坚硬，菌盖呈深黄色至褐色，边缘白色生长圈消失孢子弹射结束后及时采收。
7.作为本发明其中一个方面，本发明提供所述的瓦尼桑黄菌种在生产桑黄孢子粉中的应用。
8.作为本发明其中一个方面，本发明提供桑黄孢子粉在制备抗癌药物中的应用。
9.作为本发明其中一个方面，本发明提供桑黄孢子粉多糖在制备抗癌药物中的应用。
10.其中，所述桑黄，包括所述瓦尼桑黄菌种qjf-8。
11.其中，所述抗癌药物，包括抗肝炎药物。
12.作为本发明其中一个方面，本发明提供所述的瓦尼桑黄菌种的栽培方法，其由以下步骤组成，
13.原种的制备；
14.栽培种的制备；
15.将段木捆扎后在水中浸泡，取出控水，装入聚乙烯料袋中，在木段两头和缝隙内填充营养料，加入水混合均匀，灭菌，自然降温；用接种铲挖取栽培种后送入料袋，在通风条件良好的培养室内避光培养至菌丝长满菌袋；
16.将所述菌袋移入栽培棚内，在菌袋上割口并割破菌皮，将菌袋立放于栽培棚内的坑中，采用昼夜温差的方法刺激出黄；割口处现黄后，将空气湿度提高到95％，加大通风，进入冬季后，将遮阳网直接覆盖在菌袋表面，控温保湿，次年4月份将遮阳网揭至栽培棚顶部，气温进入20℃以后，桑黄子实体进入生长期，常规出菇方式进行管理。
17.作为本发明所述的瓦尼桑黄菌种的栽培方法的一种优选方案：所述原种的制备，以重量百分比计，将2％石膏、1％石灰、2％白糖、0.5％豆饼、74.5％木屑、20％麦麸混合，加入无菌水，使得水分含量为62～65w.t.％，装袋，高压灭菌，灭菌后自然降温，得到栽培种培养料，接入qjf-8试管种，在28℃的温度下避光培养35～40天，得到qjf-8原种。
18.作为本发明所述的瓦尼桑黄菌种的栽培方法的一种优选方案：所述栽培种的制备，按照5wt％将所述qjf-8原种接种到所述栽培种培养料上，在28℃的温度下避光培养35～40天，得到qjf-8栽培种。
19.作为本发明所述的瓦尼桑黄菌种的栽培方法的一种优选方案：所述营养料，由木屑、麦麸按照质量比为3:1混合，加入无菌水混合均匀，无菌水的含量为 60wt％。
20.本发明的有益效果：
21.(1)本发明提供的qjf-8菌种，能够弹射孢子，表明其孢子粉产量较高，这是在以往栽培生产未发现的，是目前唯一一种弹射孢子的瓦尼桑黄品种。
22.(2)本发明所述的桑黄孢子粉中的总糖(40.6％)和粗多糖(1475mg/100g) 含量都远远高于子实体(31.8％，402mg/100g)。
23.(3)本发明桑树桑黄孢子粉提取的多糖具有抗肿瘤的功效，也可用于制备抗肿瘤的功能性产品，可广泛用于食品、保健品、动物饲料、医药等方面。
附图说明
24.图1是瓦尼桑黄(sanghuangporus vaninii)qjf-8的野生状态子实体生长图；
25.图2是瓦尼桑黄(sanghuangporus vaninii)qjf-8人工栽培情况图；左图为 qjf-8菌种栽培情况，右图为qjf-8菌种产生的孢子粉。
26.图3是桑黄孢子粉多糖对细胞作用情况图；
27.图4是桑黄孢子粉多糖对hepg2的作用(72h)差异显著性分析**为p﹥ 0.01，*为p﹥0.05；
28.图5是qjf-8产生的孢子粉图。
具体实施方式
29.为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
30.实施例1：高产孢子粉的瓦尼桑黄品种sanghuangporus vaninii qjf-8的获取
31.瓦尼桑黄主要分布广东、湖南、安徽、陕西、吉林等地。本团队科研人员从吉林省延吉市采集到一株野生菌株子实体桑黄sanghuangporus vaninii qjf-8，子实体侧生，无菌柄，菌盖平展盖型，具有明显的年轮，颜色由黑色、深褐色、黄色到白色逐步延伸(图1)。
32.1、组织分离
33.将野外采集获得的子实体用75％酒精擦拭表面，在无菌环境下撕开并夹取 0.2mm
×
0.2mm的内部菌肉组织接入加富综合pda培养基。置于25℃培养箱中恒温避光培养，待菌丝长满斜面后取尖端菌丝转接纯化培养。
34.2、分子鉴定
35.its鉴定方法：按常规方法提取瓦尼桑黄菌株qjf-8的dna，测序结果显示与sanghuangporus vaninii的its序列同源性最高。
36.3、子实体形态
37.qjf-8子实体二三层叠生，呈马蹄形或扇形，坚硬木质，菌盖背面呈深黄色至褐色，腹面呈黄色，质地紧密；在pda培养基上培养14d后，观察到菌落质地成为黄色，反面呈褐色，菌丝呈浅褐色，菌丝直径约3.5μm，有隔膜、分枝较多，形态特征表明其为正宗的瓦尼桑黄。
38.结合子实体形态、菌丝体形态、显微特征和its鉴定等实验数据，认定该桑黄菌株为正宗的瓦尼桑黄(sanghuangporus vaninii)。
39.实施例2：
40.瓦尼桑黄qjf-8的段木仿野生栽培试验
41.(1)原种的制备：栽培种培养料，以重量百分比计，将2％石膏、1％石灰、2％白糖、0.5％豆饼、74.5％木屑、20％麦麸混合，加入无菌水，使得水分含量为62w.t.％，装袋，栽培袋规格为17cm
×
33cm
×
0.05cm的聚丙烯袋，在 120℃，180min的条件下高压灭菌，灭菌后自然降温，得到栽培种培养料。在无菌条件下接入桑黄qjf-8试管种，在28℃的温度下避光培养38d，得到qjf-8 原种。
42.(2)栽培种的制备：按照5wt％将步骤(1)得到的所述桑黄qjf-8原种接种到所述栽培种培养料上，在28℃的温度下避光培养38d，得到qjf-8栽培种。
43.(3)将桑木制成直径为16cm的段木捆，捆扎后投入无菌水中浸泡30min，取出控水，装入折径20cm、长40cm、厚0.005cm的低压聚乙烯料袋中，在木段两头和缝隙内填充营养料，所述营养料由木屑、麦麸按照质量比为3:1混合，加入无菌水混合均匀，无菌水的含量为60wt％，100℃常压灭菌20h，自然降温。
44.采用一头接种的方式，用接种铲挖取菌种后快速送入料袋，菌种须覆盖料面1/2以上，接种后立即用滤菌封口膜，在28℃、通风条件良好的室内避光培养55d，至菌丝长满菌袋。
45.(4)按深5～7cm，株行距10～12cm
×
10～12cm的距离挖坑，坑中喷撒绿霉净，将所
述菌袋移入栽培棚内，用灭菌刀片在菌袋上割口并割破菌皮，将菌袋立放于坑中，埋上沙土，沙土含水量70wt％，将栽培棚分为a和b两个区域，a区域作为对照，接种目前生产上的主要栽培品种qjf-3，b区域内接种所述瓦尼桑黄新品种qjf-8，之后采用昼夜温差的方法刺激出黄，即白天温度 28℃，夜间温度20℃。催蕾期间空气湿度85％，散射光，尽量不通风。割口处现黄后，将空气湿度提高到95％，加大通风，光照800lux。观察到子实体生长期，b区菌袋子实体长势优于a区，农艺性状均优良。
46.进入冬季后，将遮阳网直接覆盖在菌袋表面，控温保湿，第二年4月份将遮阳网揭至栽培棚顶部，起到防晒作用。当地气温进入20℃以后，桑黄子实体进入生长期，按常规出黄方式进行管理。
47.三年生瓦尼桑黄新品种qjf-8，在第二年的9月初到10月中旬这一时间段孢子大量弹射，这一阶段菇棚的管理注意降低空气湿度，湿度控制在65％，温度控制在25℃，禁止向子实体表面喷水，用塑料布或纸在菌盖下面铺好，待孢子粉弹射后，收集起来。也可在每个子实体上套上一个纸套，直至孢子粉采收完毕。a区和b区的的子实体生长及农艺性状见表1。
48.表1
[0049][0050]
qjf-8菌种的孢子粉产量：4.44g/每段，
[0051]
qjf-8菌种的孢子粉产量的计算方法为：孢子粉总产量/产孢子粉桑黄总段数。
[0052]
按照每克桑黄子实体产孢子粉产量计算，瓦尼桑黄qjf-8菌种的孢子粉产量为0.06g/g。
[0053]
图5为qjf-8产生的孢子粉图。
[0054]
实施例3：
[0055]
qjf-8孢子粉多糖的提取
[0056]
采用水提醇沉法提取本发明qjf-8菌种产出的孢子粉的多糖，将采收后的瓦尼桑黄qjf-8孢子粉在60℃的条件下热风干燥3h，然后按液料质量比10∶ 1加入去离子水，在温度为90℃的条件下浸提4h，4500r/min离心15min收集上清液，将得到的水提取物用质量分数为95％的乙醇溶液4℃沉淀24h后，在转速为10000r/min的条件下离心10min，使用无水乙醇和丙酮依次洗涤2 次，收集沉淀物，经冷冻干燥，得瓦尼桑黄多糖，测得多糖浓度为3644.33mg/100 g，待用。
[0057]
实施例4：
[0058]
qjf-8孢子粉多糖抗肿瘤效果的研究
[0059]
将hepg2细胞复苏传代之后，用pbs清洗细胞，然后加入胰酶进行细胞消化，将消化好的细胞(5000个/孔)接种于96孔板，于37℃，5％co2的培养箱中过夜培养。待细胞贴壁之
后，弃去培养液，设置药物组、阴性对照组和溶剂对照组，分别加入100μl相应的溶液，每组均设置3个复孔。将96孔板放入培养箱中分别培养24h、48h、72h，弃去培养液，每孔加入100ml含 10％wst-1试剂的无血清培养液，培养箱中静置2h，使用酶标仪于450nm处测定吸光值。结果用统计软件spss分析。在给药24h内，qjf-8菌株的孢子粉多糖对于hepg2细胞无显著的生长抑制作用，然而意外的是，在给药48h 后，qjf-8菌株的孢子粉多糖开始发挥较强的抑制hepg2细胞生长的作用。结果见图3、图4。给药72h，桑黄qjf-8孢子粉多糖对hepg2肿瘤细胞活力影响的ic
50
值为450μg/ml，当多糖浓度为800μg/ml，抑制率达到82.3％。
[0060]
实施例5：
[0061]
瓦尼桑黄qjf-8孢子粉和子实体中总糖、粗多糖、总黄酮和总三萜含量的测定
[0062]
委托谱尼测试集团股份有限公司(北京)测定桑黄子实体、实施例3所得桑黄孢子粉中总糖、粗多糖、总黄酮和总三萜含量，发现桑黄qjf-8孢子粉中总糖(40.6％)和粗多糖(1475mg/100g)的含量远远高于子实体(总糖31.8％，粗多糖402mg/100g)。此外，桑黄孢子粉中总黄酮的含量(0.2g/100g)低于子实体总黄酮(0.96g/100g)，总三萜的含量(76.9mg/100g)与子实体(202mg/100 g)相比显著较低。
[0063]
应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。