L-乳酸脱氢酶及其编码基因与应用的制作方法

本发明属于生物，涉及l-乳酸脱氢酶及其编码基因与应用。

背景技术：

1、乳酸为世界三大有机酸(乙酸、柠檬酸和乳酸)之一，被美国食品和药品管理局认定为“公认安全物质(gras)”，广泛地应用在食品、药品、化妆品和日化中。近些年来，随着人们对白色污染问题的重视以及政府对生物可降解塑料的推行，聚乳酸的产能不断得到扩大。聚乳酸的合成步骤一般为乳酸、丙交酯、聚乳酸，作为合成聚乳酸的原料，乳酸要满足光纯和高化学纯度的要求。现有的两种乳酸生产方法，由于化学合成法的乳酸为外消旋体，不满足聚乳酸的要求，因此工业上目前生产乳酸普遍采用的方法为微生物合成法。

2、微生物合成法生产得到的乳酸基本可以满足丙交酯对乳酸光纯大于99％的要求，但是在发酵的过程中，微生物产生乳酸也会产生一些其他的副产物，如色素、蛋白、碳链较短的醇类、羧酸和2-羟基丁酸等。目前普遍采用的发酵液后分离路线的步骤为发酵液加入氢氧化钙或氧化钙进行碱解，使用板框过滤掉菌体以后，加入硫酸进行酸化，再次使用板框除去硫酸钙，得到的上清经过脱色、纳滤和离子交换，最后经过浓缩和分子蒸馏得到成品乳酸。一些副产物如蛋白、色素、甲酸、乙酸、乙醇和丁二酸等会在分离的过程中被除掉，而一些副产物如2-羟基丁酸由于与乳酸沸点和分子自由程较为接近，无法在上述的分离过程中得到有效的去除。这些产物残留在乳酸中会影响到下游丙交酯的合成，进一步影响聚乳酸的品质。

3、由于在后分离的过程中对2-羟基丁酸分离较为困难，因此最佳的方法为在上游发酵的过程中进行解决。根据报道，2-羟基丁酸的产生途径很可能为氨基酸经过氨基转移酶、d-氨基酸氧化酶或者l-氨基酸脱氨酶的作用得到α-酮酸，而α-酮酸在脱氢酶的作用下转化为2-羟基丁酸。在乳酸的发酵过程中，l-乳酸脱氢酶的活性较高，表达量较大，且具有较广的底物谱，因此α-酮酸可能被l-乳酸脱氢酶转化为2-羟基丁酸。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种l-乳酸脱氢酶，以提高现有的l-乳酸脱氢酶的底物特异性，降低发酵液中的2-羟基丁酸含量，提高乳酸的产量。

2、具体地，本发明根据大肠杆菌的密码子偏好性对来源于凝结芽孢杆菌(bacilluscoagulans)b1821的野生型l-乳酸脱氢酶的基因(seq id no：1)进行密码子优化，合成seqid no:2,以提高该基因的表达效率；通过基因突变的方法在该基因中引入单点突变或多点突变，使改造之后的l-乳酸脱氢酶具有较高的底物特异性，在发酵过程中降低发酵液中的2-羟基丁酸含量，并提高乳酸的产量，以利于下游乳酸的分离。

3、在第一方面，本发明提供一种l-乳酸脱氢酶，其是将seq id no:41所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的蛋白质，该蛋白质相比于未突变的seq id no:41所示的l-乳酸脱氢酶具有提高的底物特异性。

4、在一些实施方案中，上述l-乳酸脱氢酶中，所述l-乳酸脱氢酶是在seq id no:1所示的氨基酸序列的第61、75、77、103、150、230和/或276位进行氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的蛋白质；

5、优选为seq id no:22、seq id no:23、seq id no:24、seq id no:25、seq id no:26、seq id no:27、seq id no:28、seq id no:29、seq id no:30、seq id no:31、seq idno:32、seq id no:33、seq id no:34、seq id no:35、seq id no:36、seq id no:37、seq idno:38、seq id no:39、seq id no:40所示的蛋白质。

6、其中，seq id no:22所示的氨基酸序列是对野生型l-乳酸脱氢酶进行r61g突变后的序列，其对应的核苷酸序列如seq id no:3所示；

7、seq id no:23所示的氨基酸序列是对野生型l-乳酸脱氢酶进行r61i突变后的序列，其对应的核苷酸序列如seq id no:4所示；

8、seq id no:24所示的氨基酸序列是对野生型l-乳酸脱氢酶进行l75w突变后的序列，其对应的核苷酸序列如seq id no:5所示；

9、seq id no:25所示的氨基酸序列是对野生型l-乳酸脱氢酶进行l75y突变后的序列，其对应的核苷酸序列如seq id no:6所示；

10、seq id no:26所示的氨基酸序列是对野生型l-乳酸脱氢酶进行v77c突变后的序列，其对应的核苷酸序列如seq id no:7所示；

11、seq id no:27所示的氨基酸序列是对野生型l-乳酸脱氢酶进行v77e突变后的序列，其对应的核苷酸序列如seq id no:8所示；

12、seq id no:28所示的氨基酸序列是对野生型l-乳酸脱氢酶进行v77h突变后的序列，其对应的核苷酸序列如seq id no:9所示；

13、seq id no:29所示的氨基酸序列是对野生型l-乳酸脱氢酶进行g103s突变后的序列，其对应的核苷酸序列如seq id no:10所示；

14、seq id no:30所示的氨基酸序列是对野生型l-乳酸脱氢酶进行g103t突变后的序列，其对应的核苷酸序列如seq id no:11所示；

15、seq id no:31所示的氨基酸序列是对野生型l-乳酸脱氢酶进行d150a突变后的序列，其对应的核苷酸序列如seq id no:12所示；

16、seq id no:32所示的氨基酸序列是对野生型l-乳酸脱氢酶进行d150q突变后的序列，其对应的核苷酸序列如seq id no:13所示；

17、seq id no:33所示的氨基酸序列是对野生型l-乳酸脱氢酶进行t230k突变后的序列，其对应的核苷酸序列如seq id no:14所示；

18、seq id no:34所示的氨基酸序列是对野生型l-乳酸脱氢酶进行t230h突变后的序列，其对应的核苷酸序列如seq id no:15所示；

19、seq id no:35所示的氨基酸序列是对野生型l-乳酸脱氢酶进行t230r突变后的序列，其对应的核苷酸序列如seq id no:16所示；

20、seq id no:36所示的氨基酸序列是对野生型l-乳酸脱氢酶进行i276t突变后的序列，其对应的核苷酸序列如seq id no:17所示；

21、seq id no:37所示的氨基酸序列是对野生型l-乳酸脱氢酶进行i276e突变后的序列，其对应的核苷酸序列如seq id no:18所示；

22、seq id no:38所示的氨基酸序列是对野生型l-乳酸脱氢酶进行i276m突变后的序列，其对应的核苷酸序列如seq id no:19所示；

23、seq id no:39所示的氨基酸序列是对野生型l-乳酸脱氢酶进行v77e和t230r的多点突变后的序列，其对应的核苷酸序列如seq id no:20所示；

24、seq id no:40所示的氨基酸序列是对野生型l-乳酸脱氢酶进行r61i，d150q和i276t的多点突变后的序列，其对应的核苷酸序列如seq id no:21所示。

25、在一些实施方案中，上述l-乳酸脱氢酶中，除了在第61、75、77、103、150、230和/或276位发生上述突变之外，其进一步可以在其他位点上具有氨基酸的保守取代，使得突变后的氨基酸比seq id no:41所示的l-乳酸脱氢酶具有更加优异的底物特异性。优选地，所述氨基酸的保守取代保留本发明l-乳酸脱氢酶变体的底物特异性。对于本领域的技术人员而言很明显，这种取代可以在上述位点以外的区域发生，而仍保留相应活性。优选地，所述保守取代变体具有至少一个位置的氨基酸保守取代。保守取代的实例是在下列氨基酸组内发生的取代：碱性氨基酸(如精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸(如谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(如谷氨酰胺、天冬酰胺)、疏水性氨基酸(如亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳香氨基酸(如苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)，以及小分子氨基酸(如甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸)。最常见的氨基酸互换有氨基酸g至a；a至g，s；v至i，l，a，t，s；i至v，l，m；l至i，m，v；m至l，i，v；p至a，s，n；f至y，w，h；y至f，w，h；w至y，f，h；r至k，e，d；k至r，e，d；h至q，n，s；d至n，e，k，r，q；e至q，d，k，r，n；s至t，a；t至s，v，a；c至s，t，a；n至d，q，h，s；q至e，n，h，k，r的互换，以及它们的相反的互换。与上述l-乳酸脱氢酶变体的氨基酸序列具有一定的氨基酸同源性的l-乳酸脱氢酶变体，优选地同源性为70-99％之间，更优选地同源性为80-99％之间，更优选地同源性为90-99％之间，最优选地同源性为99％，也属于本发明的保护范围。

26、本发明提供的上述l-乳酸脱氢酶可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到，例如使用重组技术从原核宿主(例如大肠杆菌)或真核宿主(例如酵母、高等植物)中表达获得。

27、在一些实施方案中，上述l-乳酸脱氢酶是通过将含有其编码基因的重组载体导入大肠杆菌(例如bl21(de3))得到重组工程菌，然后将该重组工程菌进行诱导表达得到l-乳酸脱氢酶。

28、在第二方面，本发明提供编码上述任一所述的l-乳酸脱氢酶的核酸分子，所述核酸分子可以是dna，如cdna、基因组dna或重组dna；所述核酸分子也可以是rna，如mrna或hnrna等。

29、在一些实施方案中，上述核酸分子为如下1)或2)或3)所示的核酸分子：

30、1)具有seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7、seqid no:8、seq id no:9、seq id no:10、seq id no:11、seq id no:12、seq id no:13、seqid no:14、seq id no:15、seq id no:16、seq id no:17、seq id no:18、seq id no:19、seqid no:20、seq id no:21任一所示的核苷酸序列的核酸分子；

31、2)与1)限定的核酸分子杂交且编码上述任一所述的l-乳酸脱氢酶的核酸分子；

32、3)与1)或2)限定的核酸分子具有90％以上的同一性且编码上述任一所述的l-乳酸脱氢酶的核酸分子。

33、本发明提供的上述核酸分子通常可以通过pcr扩增或人工合成的方法获得。

34、这里使用的术语“同一性”可以用肉眼或计算机软件(比如ausubel et al.eds.(2007)在current protocols in molecular biology中所述的软件程序)进行评价。当被比较的序列中的位置被相同的碱基或氨基酸占据时，则分子在该位置是同一的。两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。多聚核苷酸序列或氨基酸序列与另一序列有具有一定百分比(例如90％、95％、98％或者99％)的“序列同一性”是指当序列比对时，所比较的两个序列中该百分比的碱基或氨基酸相同。

35、在第三方面，本发明提供一种重组载体，其包含上述任一所述的核酸分子。

36、所述重组载体包括克隆载体和表达载体，所述克隆载体用于复制相关序列，所述表达载体用于表达相关基因，其中构建表达载体时用到的载体可以为prsfduet-1。

37、在一些实施方案中，上述重组载体为将编码上述l-乳酸脱氢酶的核酸分子替换prsfduet-1的ncoi和ecori酶切位点间序列，其余序列保持不变得到的。

38、在第四方面，本发明提供一种重组细胞，其包含上述任一所述的重组载体。

39、在一些实施方案中，所述重组细胞诱导(如iptg诱导)产生上述任一所述的l-乳酸脱氢酶。

40、在一些实施方案中，所述重组细胞的构建方法包括如下：

41、将所述重组载体转化到宿主细胞中，经诱导，得到表达上述任一所述的l-乳酸脱氢酶。

42、进一步地，所述重组载体为上述任一所述的重组载体，所述宿主细胞为原核生物细胞或真核生物细胞，例如大肠杆菌、酵母等，比如大肠杆菌bl21(de3)，rosetta(de3)，bl21(de3)plyss，m15或top10f’，优选大肠杆菌bl21(de3)。

43、在第五方面，本发明提供一种l-乳酸脱氢酶的制备方法，包括：

44、对上述任一所述的重组细胞进行诱导培养，得到培养物；

45、从所述培养物中分离上述任一所述的l-乳酸脱氢酶。

46、其中，对重组细胞进行诱导培养的方法、从培养物中分离l-乳酸脱氢酶的方法均为本领域的常规方法。重组细胞表达l-乳酸脱氢酶时使用的培养基可以是本领域可使该重组细胞生长并产生本发明的l-乳酸脱氢酶的培养基，优选lb培养基。

47、培养方法与培养条件没有特殊要求，只要能够使重组细胞正常生长，并表达l-乳酸脱氢酶即可。

48、在第六方面，本发明提供上述任一所述的l-乳酸脱氢酶、上述任一所述的核酸分子、上述重组载体、上述重组细胞和/或上述方法制备得到的l-乳酸脱氢酶在制备乳酸中的应用。

49、在第七方面，本发明提供一种制备乳酸的方法，包括对上述重组细胞进行发酵，催化底物葡萄糖，得到乳酸。

50、在一些实施方案中，上述方法中，所述发酵包含有氧发酵和之后的厌氧发酵两个阶段；

51、有氧发酵的发酵条件为：搅拌、通风使得do在30％以上，温度为35-42℃，例如35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃，ph为6.0-7.2；

52、例如：初始时，转速100r/min，通风量为0.5vvm，温度为37℃，ph值为7.0；在发酵的过程中使用氨水将ph维持到7.0；由于菌体的不断生长，会使得溶氧不断的下降，在这期间将通风量和转速与do进行关联，使得do维持在30％以上，通风量的最高值为3vvm，转速的最高值为1000r/min；

53、厌氧发酵的发酵条件为：od600达到10-20时，加入iptg诱导蛋白表达，od600达到30-35时，向发酵罐中补加葡萄糖溶液，使得发酵罐中葡萄糖的浓度在的20-30g/l之间，关闭通风，转速降低到100-300r/min，温度为35-42℃，ph为6.0-7.2；

54、例如，待od600达到15以后，加入终浓度为0.5mm的iptg，od600达到30-35(例如od600为31、32、33、34、35)时，将ph值调节剂氨水换成30％的氢氧化钙，向发酵罐中补加葡萄糖溶液，使得发酵罐中葡萄糖的浓度在的20-30g/l之间，关闭通风，将转速降低到100r/min，温度为35-42℃，ph为6.0-7.2。

55、在一些实施方案中，在上述方法中，发酵时所用的发酵培养基的组成为：葡萄糖5-60g/l(分消)，na2hpo4·12h2o 15-16g/l,kh2po4 2.5-3.5g/l，nh4cl 0.8-1.2g/l，nacl0.4-0.6g/l，在发酵开始之前加入0.01-0.1％(体积比)的mgso4(1mol/l)和0.01-0.1％(体积比)的微量元素；例如可以为：葡萄糖40g/l(分消)，na2hpo4·12h2o 15.11g/l,kh2po4 3g/l，nh4cl 1g/l，nacl 0.5g/l，121℃灭菌20min，在发酵开始之前加入千分之一体积的mgso4(1mol/l)和千分之一体积的微量元素；

56、所述微量元素可以为:fecl3·6h2o 2-3g/l，cocl2·6h2o 0.2-0.4g/l，cucl2·2h2o 0.1-0.2g/l，zncl2 0.2-0.4g/l，na2mo4·2h2o 0.2-0.4g/l，h3bo3 0.07-0.08g/l，mncl2·4h2o 0.49-0.5g/l；例如可以为：fecl3·6h2o 2.4g/l，cocl2·6h2o 0.3g/l，cucl2·2h2o 0.15g/l，zncl2 0.3g/l，na2mo4·2h2o 0.3g/l，h3bo3 0.075g/l，mncl2·4h2o0.495g/l。

57、在一些实施方案中，上述任一所述的方法中，发酵时的种子液的接种量为5％(v/v)，初始od600为0.5。

58、在一些实施方案中，上述任一所述的方法中，所述种子液培养时所用的培养基为lb培养基。

59、本发明通过理性设计，选择合适的突变位点进行突变，提高了l-乳酸脱氢酶的底物特异性，降低了发酵液中的2-羟基丁酸含量，提高了乳酸的产量，降低了分离成本，具有较高的工业应用价值。