红曲发酵夏秋茶菌种筛选方法及适生性基质与流程

1.本发明涉及茶叶发酵菌种筛选技术领域，尤其涉及一种红曲发酵夏秋茶菌种筛选方法及适生性基质。


背景技术：

2.茶树体内的生理活性物质的合成受到温度和光照的影响,夏秋季节相比春季温度高日照时间长，导致夏秋茶多酚、花青素及咖啡碱类物质含量较高，氨基酸含量较低，酚氨比变大，故滋味苦涩。
3.夏秋茶常存在滋味苦涩、香气低、利用率低下、资源浪费等问题，加之茶青采摘、茶叶加工的机械化程度低，技术简单、产量低、成本高，导致其销价过低，故茶园对于夏秋茶鲜叶少采甚至不采，资源浪费尤为明显。
4.红曲菌是真菌中的一个属，能产生红曲色素、莫纳可林k和桔霉素等多种代谢产物，故红曲霉菌具有降胆固醇、降血糖及降血压等功效。研究表明，大部分红曲菌都可以产生活性较高的蛋白酶，蛋白酶能将蛋白质水解成氨基酸、多肽等小分子化合物。利用红曲发酵夏秋茶在国内研究尚属空白，将益生菌-红曲菌与夏秋茶结合，利用生物转化，有望获得功能性茶，同时能提高夏秋茶利用率，从而减少资源浪费。


技术实现要素：

5.本发明所要解决的技术问题在于，针对夏秋茶常存在滋味苦涩、香气低、利用率低下、资源浪费的问题，提出了一种红曲发酵夏秋茶菌种筛选方法及适生性基质。
6.为了解决上述技术问题，本发明提供了一种红曲发酵夏秋茶菌种筛选方法包括：菌体的活化：选取适用于食品及保健食品的4株红曲菌，分别为保藏编号cgmcc no.3.890的橙色红曲霉、保藏编号cgmcc no.3.4629的紫红曲霉、保藏编号cgmcc no.3.15746的红色红曲霉、保藏编号cgmcc no.3.7196锈色红曲霉，采用平板划线法分别将4株红曲菌接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基 (pda)斜面上，置于28℃培养箱中培养7天，挑取较好菌落反复采用平板划线法将其进行活化；
7.步骤二：孢子悬浮液的制备：分别从4株活化好的红曲菌平板中刮取一环菌体于pda培养皿中培养7天，用7mm打孔器分别从4株活化好的红曲菌平板中打三个菌饼于无菌pda培养皿中，倒置培养5天，再使用30ml无菌水刮洗菌体，过滤于无菌三角瓶中，使用血球计数板计数，确保孢子浓度达106cfu/ml；
8.步骤三：菌种的筛选：包括孢子悬浮液的接种、菌体干重的测定以及色价的测定；孢子悬浮液的接种：分别将4株红曲菌的孢子悬浮液按2％接种量接入基础培养液中，于180r/min、28℃摇瓶培养5天，每株红曲菌做三个平行；菌体干重的测定：使用烘干恒重的定量滤纸过滤发酵液，滤液用50ml离心管收集备用，滤渣用超纯水充分洗涤后置于60℃烘干至恒重，称重计算前后质量差即得菌体干重；色价的测定：参照gb1886.19-2015测定过滤后的发酵液色价。
no.3.890，购于中国普通微生物菌种保藏管理中心；红色红曲霉cgmccno.3.15746，购于中国普通微生物菌种保藏管理中心；紫红曲霉cgmccno.3.4629，购于中国普通微生物菌种保藏管理中心；锈色红曲霉cgmccno.3.7196，购于中国普通微生物菌种保藏管理中心。
32.本发明提供了一种红曲发酵夏秋茶菌种筛选方法包括：
33.菌体的活化：选取适用于食品及保健食品的4株红曲菌，分别为保藏编号 cgmcc no.3.890的橙色红曲霉、保藏编号cgmcc no.3.4629的紫红曲霉、保藏编号cgmcc no.3.15746的红色红曲霉、保藏编号cgmcc no.3.7196锈色红曲霉，采用平板划线法分别将4株红曲菌接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基(pda) 斜面上，置于28℃培养箱中培养7天，挑取较好菌落反复采用平板划线法将其进行活化；
34.孢子悬浮液的制备：分别从4株活化好的红曲菌平板中刮取一环菌体于pda 培养皿中培养7天，用7mm打孔器分别从4株活化好的红曲菌平板中打三个菌饼于无菌pda培养皿中，倒置培养5天，再使用30ml无菌水刮洗菌体，过滤于无菌三角瓶中，使用血球计数板计数，确保孢子浓度达106cfu/ml；
35.菌种的筛选：包括孢子悬浮液的接种、菌体干重的测定以及色价的测定；
36.孢子悬浮液的接种：分别将4株红曲菌的孢子悬浮液按2％接种量接入基础培养液中，于180r/min、28℃摇瓶培养5天，每株红曲菌做三个平行；
37.菌体干重的测定：使用烘干恒重的定量滤纸过滤发酵液，滤液用50ml离心管收集备用，滤渣用超纯水充分洗涤后置于60℃烘干至恒重，称重计算前后质量差即得菌体干重；
38.色价的测定：参照gb1886.19-2015测定过滤后的发酵液色价。
39.其中，基础培养液的制备方法为：分别称取葡萄糖1g、蛋白胨0.5g于100ml 三角瓶中，加入50ml茶汁，于121℃灭菌15min，冷却备用。茶汁的制备方法为：准确称取夏秋茶5g于茶壶中，2000ml蒸馏水煮沸3分钟，过滤，稀释2 倍即得备用茶汁。
40.菌种筛选结果与分析：
41.红曲色素一般通过微生物红曲霉发酵培养基的次级代谢产物获取，色价则是评价红曲色素高低的指标，菌体干重的测定是微生物生长情况评价的常用方法之一，不同红曲菌株对茶汁的利用率不同，为筛选出对夏秋茶适生性较好的红曲菌株，选取了常用于食品或保健食品发酵的红曲菌株，对同一基质进行摇瓶发酵，通过菌体干重及色价综合评价其适生性，结果见图1，图1为菌种筛选结果图。
42.由图1可知，橙色红曲霉3.890(编号a)发酵夏秋茶汁，其发酵液色价最低(0.785μ/g)，锈色红曲霉3.7196(编号d)居中，紫红曲霉3.4629(编号b) 和红色红曲霉3.15746(编号c)色价值相差不大，但紫红曲霉3.4629(编号b) 略高于红色红曲霉3.15746(编号c)，色价值最高，达2.413μ/g。4株菌对夏秋茶汁利用率也不同，通过锈色红曲霉3.7196(编号d)发酵的茶汁其菌体干重最低，为0.269g，橙色红曲霉3.890(编号a)和紫红曲霉3.4629(编号b) 相差不大，但紫红曲霉3.4629(编号b)菌体干重略高于橙色红曲霉3.890(编号a)，红色红曲霉3.15746(编号c)菌体干重最高，达0.316g。综合分析菌体干重和色价两个指标，紫红曲霉3.4629色价最高，说明其产生的次生代谢产物-红曲色素最高，红色红曲霉3.15746菌体干重最大，说明其生长繁殖能力最强，但红色红曲霉3.15746色价值与紫红曲霉3.4629相差甚少，菌体干重却明显优于红色红曲霉3.15746，故红色红曲霉3.15746为选定的四株红曲菌株中对夏秋茶适生性最强的菌株。
43.通过上述红曲发酵夏秋茶菌种筛选方法筛选后，发现红色红曲霉为四株红曲菌株中对夏秋茶适生性最强的菌株。
44.种子液适生基质筛选：
45.采用单因素试验进行筛选：
①
碳源：量取50ml茶汁于100ml三角瓶中，加入0.5g蛋白胨和0.05g硫酸镁，分别以葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、可溶性淀粉为单因素，以0.5、0.75、1、1.25、1.5g/50ml茶汁为水平加入碳源，按2％接种量接入筛选出的菌株孢子悬浮液，于180r/min、28℃摇瓶培养5天。
46.不同碳源对菌体生长情况的影响：
47.选择常用碳源葡萄糖、麦芽糖、蔗糖和可溶性淀粉分别作为种子液碳源，设置不同添加量梯度，以菌体干重和色价为评价指标，筛选较优碳源，同时找出碳源添加量可行性范围，其结果见图2和图3，图2为不同碳源对菌体干重的影响，图3为不同碳源对色价的影响。
48.由图2和图3可知，从菌体干重来看，添加量为0.5g/50ml茶汁时，添加葡萄糖的种子液菌体干重高于其他三种碳源，而添加可溶性淀粉的种子液菌体干重较低。当添加量从0.5g/50ml升至1.25g/ml茶汁时，四种碳源的种子液菌体干重均呈上升趋势，但当添加量为从1.25g/50ml茶汁将至1.5g/50ml茶汁时，菌体干重下降，此时色价反而上升，这可能是因为菌体繁殖受限，次级代谢产物积累。虽然添加葡萄糖的种子液菌体干重在添加量为0.5g/50ml茶汁时高于其余三种碳源，但当添加量上升至0.75g/ml茶汁时，添加蔗糖的种子液菌体干重高于葡萄糖，之后一直处于领先。从色价来看，添加量为0.5g/50ml茶汁时，添加葡萄糖的种子液色价最优，达2.35μ/g。当添加量为1g/50ml茶汁时，葡萄糖种子液的色价依然最优，但当添加量为1.25g/50ml茶汁时，蔗糖色价高于葡萄糖，当添加量从1.25g/50ml茶汁上升至1.5g/50ml茶汁时，蔗糖色价持续上升，而葡萄糖色价反而降低。添加麦芽糖和可溶性淀粉的种子液色价在1g/50ml茶汁至1.5g/50m茶汁时，色价均低于蔗糖。综上所述，无论是从菌体干重还是色价值来看，当添加量为1g/50ml茶汁至1.5g/50ml茶汁时，蔗糖的菌体干重和色价都领先于其余三种碳源，因此，应选择蔗糖作为碳源，且其添加量水平应设置为1g/50ml茶汁、1.25g/50ml茶汁和1.5g/50ml茶汁。
49.②
氮源：量取50ml茶汁于100ml三角瓶中，加入1g葡萄糖和0.05g硫酸镁，分别以蛋白胨、尿素、硫酸铵为单因素，以0.1、0.3、0.5、0.7、0.9g/50ml 茶汁为水平加入氮源，按2％接种量接入筛选出的菌株孢子悬浮液，于180r/min、 28℃摇瓶培养5天。
50.不同氮源对菌体生长情况的影响：
51.氮源是微生物生长发育最重要的营养成为之一，分别选择常用的有机氮源蛋白胨、无机氮源硫酸铵和人工合成无机氮源尿素作为种子液的氮源，通过测定不同碳源在不同添加量的条件下菌体干重及色价，筛选出较优型碳源并确定其添加量的可行性范围。结果见图4和图5，图4为不同氮源对菌体干重的影响；图5为不同氮源对色价的影响。
52.由图4和图5可知，从菌体干重来看，当蛋白胨作为氮源时，菌体干重从最低添加量到最高添加量始终优于硫酸铵和尿素，当添加量从0.1g/50ml茶汁升至0.7g/50ml茶汁时，菌体干重呈上升趋势，但当添加量从0.7g/50ml茶汁升至 0.9g/50ml茶汁时，菌体干重下降。尿素虽然随着添加量增加菌体干重始终保持上升，但是菌体干重比蛋白胨和硫酸铵都低。从色价来看，蛋白胨和尿素添加量从0.1g/50ml茶汁上升至0.7g/50ml茶汁时色价也呈上升趋势，添加量从 0.7g/50ml茶汁升至0.9g/50ml茶汁时，色价下降。但蛋白胨色价在同
等添加量时始终优于尿素和硫酸铵，表明选定的红曲菌更易利用有机氮源蛋白胨。综上所述，应选择有机氮源蛋白胨作为氮源，且添加量水平应设置为0.5g/50ml茶汁、 0.7g/50ml茶汁、0.9g/50ml茶汁。
53.③
无机盐：量取50ml茶汁于100ml三角瓶中，加入1g葡萄糖和0.5g蛋白胨，分别以葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、可溶性淀粉为单因素，以0.03、0.04、0.05、 0.06、0.07g/50ml茶汁为水平加入碳源，按2％接种量接入筛选出的菌株孢子悬浮液，于180r/min、28℃摇瓶培养5天。
54.不同无机盐对菌体生长情况的影响：
55.无机盐是微生物生长繁殖不可或缺的营养物质之一，分别选择常用无机盐硫酸镁、磷酸二氢钾和硫酸亚铁作为种子液的无机盐，选择菌体干重和色价为评价指标，筛选出所选红曲菌的较优无机盐，并确定其添加量的可行性范围。结果见图6和图7，图6为不同无机盐对菌体干重的影响，图7为不同无机盐对色价的影响。
56.由图6和图7可知，无论是从菌体干重还是色价为评价指标，添加硫酸镁的种子液都在同等添加量下均优于添加磷酸二氢钾和硫酸亚铁的种子液，当添加量从0.03g/50ml茶汁上升至0.06g/50ml茶汁时，添加硫酸镁的种子液菌体干重和色价呈上升趋势，当添加量从0.06g/50ml茶汁上升至0.07g/50ml茶汁时，菌体干重和色价又呈下降趋势。综上所示，应选择加入种子液的无机盐应为硫酸镁，且添加量水平应设置为0.05g/50ml茶汁、0.06g/50ml茶汁、0.07g/50ml 茶汁。
57.响应面优化试验：
58.在单因素试验的基础上，以碳源蔗糖、氮源蛋白胨、无机盐硫酸镁添加量为自变量，每个因素设计3个水平，用(-1，0，1)作为编码，分别以菌体重量、色价为响应指标(y)，使用design-expert10软件box-benhnken法进行试验设计，确定红曲种子液基质的最佳配方，每个处理进行3次重复，试验因素与水平见表1。
59.表1响应面试验因素和水平
[0060][0061]
响应面法优化试验设计及结果分析：
[0062]
在单因素试验基础上，分别以菌体重量、色价为响应指标，用design-expert 10软件box-benhnken法进行试验设计，确定红曲种子液基质的最佳配方，试验设计及结果见下表2。
[0063]
表2响应面试验设计及结果
[0064][0065][0066]
根据上述表2的试验结果，运用designexpert10.0软件对上述结果进行回归拟合，得到如下回归方程：菌体重量 y＝0.26+0.025a+0.027b+3.500e-003c-0.031ab-0.023ac+0.014bc-0.082a
2-0.028 b
2-0.070c2。如表3所示，该模型p为0.0006，说明模型是极显著的。模型相关系数r2＝0.9563，表明模型拟合较好。模型失拟项的p值为0.3335，差异不显著，表明该模型符合实际情况。由回归方程系数显著性检验可知：a2、c2差异极显著(p＜0.01)，a、b、ab、b2差异显著(p＜0.05)，其余不显著。
[0067]
表3回归模型方差分析(菌体重量)
[0068][0069]
通过design-expert10.0软件绘制菌体重量响应面图，并对试验结果进行可视化分析。请参见图8-10，图8为蔗糖和蛋白胨对红曲菌体重量影响的响应面和等高线，图9为蔗糖和硫酸镁对红曲菌体重量影响的响应面和等高线，图10为蛋白胨和硫酸镁对红曲菌体重量影响的响应面和等高线。
[0070]
根据表2的试验结果，运用designexpert10.0软件对结果进行回归拟合，得到如下回归方程：色价 z＝1.31+0.049a-2.925e-003b-0.036c+7.947e-004ab+0.041ac-3.430e-003bc-0.03 8a
2-0.10b
2-0.049c2。如表4所示，该模型p为0.0263，说明模型是显著的。模型相关系数r2＝0.9754，表明模型拟合较好。模型失拟项的p值为0.0552，差异不显著，表明该模型符合实际情况。由回归方程系数显著性检验可知：b2差异极显著(p＜0.01)，a差异显著(p＜0.05)，其余不显著。
[0071]
表4回归模型方差分析(色价)
[0072][0073]
通过design-expert10.0软件绘制色价响应面图，并对试验结果进行可视化分析。请参见图11-13，图11为蔗糖和蛋白胨对红曲色价影响的响应面和等高线，图12为蔗糖和硫酸镁对红曲色价影响的响应面和等高线，图13为蛋白胨和硫酸镁对红曲色价影响的响应面和等高线。
[0074]
从响应面三维图可以看出，菌体重量和色价方程的抛物线图形开口均向下，说明这两个方程均存在最大值。由软件分析红曲发酵夏秋茶种子液基质最佳配方为蔗糖1.141g/50ml、蛋白胨0.712g/50ml、硫酸镁0.048g/50ml，红曲菌体重量为0.256g/50ml、色价为1.323u/g。为验证响应面法所得结果的可靠性，按照响应面确定的各因素红曲种子液基质配置，发酵完成后，经测定菌体重量为 0.248g/50ml、色价为1.316u/g，模型预测值相近。
[0075]
本发明选择多株常用于食品及保健食品的红曲菌种为发酵菌种，以夏秋茶为种子液主要基质，结合菌体干重和色价评价菌种对夏秋茶的适生性，筛选出能利用夏秋茶进行生物转化的较优菌种，菌体干重可以评价菌种的繁殖能力，而色价能评价菌体次级代谢产物的能力，通过该方法能综合评价菌体对夏秋茶基质的适生性。结果表明，红色红曲霉3.15746能较好的利用夏秋茶基质进行生物转化。利用红色红曲霉3.15746发酵夏秋茶汁，选定常用的碳氮源及无机盐，通过单因素试验并结合模糊数学评定方法对发酵液进行评价，以菌体重量、色价为响应指标进行响应面优化试验，结果表明，红曲发酵夏秋茶种子液基质最佳添加剂的量为蔗糖1.141g/50ml、蛋白胨0.712g/50ml、硫酸镁0.048g/50ml，红曲菌体重量为0.256g/50ml、色价为1.323u/g，且经验证后，表明该结果是可靠且有效的。该研究结果可为红曲发酵夏秋茶种子液的扩大培养及固态发酵提供一定基础。
[0076]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。