一种基于CRISPR/Cas12a的用温度计检测链格孢菌的方法

本发明涉及生物，尤其涉及一种基于crispr/cas12a的用温度计检测链格孢菌的方法。

背景技术：

1、链格孢菌(alternaria)作为一种常见的植物病原真菌，在自然环境和基质中有很强的适应性，因此能够广泛分布在自然界中，而高于95％的种类都兼性寄生于植物上，具有种类繁多，寄主范围广等特点。它能够通过侵染植物，引起多种植物病害，如：梨、红枣、番茄黑斑病，柠檬、柑桔褐斑病，板栗灰斑病，烟草赤星病等，造成全球性田间和产后巨大的经济损失，严重阻碍了此类经济作物产业的发展。研究表明，这些植物病害主要是由其产生的次级代谢产物毒素所导致的，且这些毒素大都具有致畸、致癌、致突变等慢性毒害。

2、链格孢菌除了能够引起植物病害，一些种类还可侵染人和动物的皮肤，引起某些慢性皮肤病等动物性疾病。虽然链格孢菌能够对动植物的健康产生危害，但是，因为一些具有生物活性的链格孢菌次生代谢产物可以杀灭昆虫，它也可以作为人类重要的真菌资源。根据长柄链格孢中某些菌株的特点研制生物防治剂，可防治烟草赤星病，防治效果达90％以上；百日草链格孢菌可防除加拿大一枝花；长春碱、紫衫醇等抗癌药物可由一些植物内生菌的链格孢产生。如此来看，正确检测链格孢菌具有重要的理论和现实意义。

3、目前，对于链格孢菌的检测主要包括形态学观察法、核苷酸序列分析法、蛋白质基因序列分析法以及同工酶、可溶性蛋白质分析技术等。这些方法都可以实现链格孢菌的灵敏、准确检测，在链格孢菌的检测中应用广泛。但是这些技术需要繁琐的样品前处理、大型精密仪器、有毒试剂以及专业技术人员，因而极大地限制了它们在链格孢菌快速检测中的应用。因此，开发其它高效、灵敏、快速的链格孢菌检测方法十分迫切。

技术实现思路

1、本发明的目的在于解决现有技术中存在的对链格孢菌的检测方法复杂、需要大型精密仪器或有毒试剂，导致检测效率低，检测成本高的问题，提供一种基于crispr/cas12a的用温度计检测链格孢菌的方法。

2、为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：一种基于crispr/cas12a的用温度计检测链格孢菌的方法，包括以下步骤：

3、s1、分别制备金纳米颗粒(aunps)、capture ssdna-mbs捕获探针和detectorssdna-hrp-aunps探针；

4、s2、将2μl 1×tolo buffer、2μm lbcas12a、5μm crrna、待测样品dna的pcr扩增产物、1μm单链dna底物s和10μl dnase/rnase free water混匀，混合物于37℃孵育30min后，于80℃灭活lbcas12a；

5、s3、将s2中灭活lbcas12a后的混合物冷却至室温，依次用capture ssdna-mbs捕获探针、detector ssdna-hrp-aunps探针和tmb-h2o2溶液进行孵育，孵育后分离出悬浮液，用激光照射悬浮液40s，用温度计监测悬浮液的温度变化；

6、s4、结果判定：s3中用激光照射悬浮液后，温度上升，则待测样品的dna中不含有链格孢菌dna；温度不上升，则样品中含有链格孢菌dna。

7、优选地，所述s1中detector ssdna-hrp-aunps探针的制备方法为将10μl的100μmdetector ssdna与100μlaunps溶液混合，加入2μl辣根过氧化物酶(hrp，2.5mg/ml)混匀，在-80℃冷冻30min；解冻后用0.1％吐温溶液洗涤2次，4℃以12000r/min离心30分钟；将所得溶液重悬于100μl偶联缓冲液中，制得detector ssdna-hrp-aunps探针；4℃保存备用。

8、优选地，所述s2中单链dna底物s的核苷酸序列如seq id no.1所示

9、优选地，所述s3中capture ssdna-mbs捕获探针的孵育方法为：加入15μl capturessdna-mbs捕获探针和5μl偶联缓冲液，在室温下孵育20min，再用偶联缓冲液洗涤3次。

10、进一步优选，所述s3中detector ssdna-hrp-aunps探针的孵育方法为：加入10μldetector ssdna-hrp-aunps探针，在室温下孵育10min，再用偶联缓冲液洗涤3次，并重悬于50μl醋酸缓冲液中。

11、进一步优选，所述s3中tmb-h2o2溶液的孵育方法为：加入50μltmb-h2o2溶液，于37℃孵育10min。

12、本发明在aunps(金纳米颗粒)表面同时修饰上detector ssdna(检测dna)和具有催化tmb(3,3',5,5'-四甲基联苯胺)氧化能力的hrp(辣根过氧化物酶),sa-mbs(链霉亲和素-磁珠)上修饰biotin(生物素)-capture ssdna(捕获dna),再通过一条单链dna底物s，利用dna杂交的方式，三者杂交形成似三明治夹心结构，从而将tmb-h2o2和crispr cas12a系统连接起来。由于tmb(3,3',5,5'-四甲基联苯胺)单电子氧化产物的电荷转移复合物具有强烈的近红外光激光驱动的光热效应，氧化的tmb可用作光热探针，将目标信号转化为热量，利用温度计进行简单的光热分析，以实现链格孢的便携式检测。

13、对链格孢的检测原理如附图1所示：当链格孢菌基因存在时，链格孢菌基因会与crispr-cas12a系统中的crrna的部分碱基序列互补杂交形成双链，此时crispr-cas12a系统被激活，加入单链dna底物s，该dna被切割成若干短的dna片段，再加入mbs-capturessdna、aunps-detector ssdna-hrp探针时，三者不会杂交，则几乎无杂交复合物残留在磁珠上，再加入tmb-h2o2，tmb不会被氧化为tmb+，当用808nm激发光照射时，溶液的温度不会上升；当链格孢菌基因不存在时，加入crrna和cas12a的复合物，没有dna与cispr-cas12a系统中的crrna的部分碱基序列互补杂交形成成双链，此时cispr-cas12a系统不能被激活，加入单链dna底物s，该dna不会被cas12a剪切，再加入mbs-capture ssdna、aunps-detectorssdna-hrp探针，三者杂交，杂交后的复合物连接在磁珠上，此时加入tmb-h2o2，tmb被催化为具有光热转换效应的tmb+，当用808nm激发光照射时，溶液的温度会上升。因此本发明基于该检测原理，仅用温度计就可实现对链格孢菌的便携式检测。

14、本发明所具有的有益效果：

15、一)本发明利用aunps的高比表面积和lbcas12a高效剪切能力的双重信号放大策略，实现了检测信号的有效放大，对链格孢菌的检测具有非常高的灵敏度；同时本发明利用crrna和目标dna进行特异性识别，对链格孢菌的检测具有非常好的特异性，可实现对待测样品中链格孢菌的快速、准确、灵敏的检测；

16、二)本发明中无需使用大型检测仪器和有毒试剂，在本发明的检测方法中，仅使用温度计就可以实现对链格孢菌的便携式现场检测。