一种人质膜膜泡关联蛋白PV-1融合蛋白及其制备方法与流程

本发明涉及生物，具体涉一种人质膜膜泡关联蛋白pv-1融合蛋白及其制备方法。

背景技术：

1、血管内皮细胞位于心血管系统的内表面，它既是感应细胞又是效应细胞，不仅能感知血液中的炎性信号、激素水平、切应力、压力等信息，而且能通过分泌多种血管活性物质对这些信息做出反应，在维持内环境渗透压平衡，血管壁完整性和阻止血栓形成中发挥重要的作用。血管内皮细胞的空隙(trans endothelial channels，tec)或带有隔膜的微孔(fenestrae)或凹洞(caveolae)是重要的亚细胞结构，在血管-组织间物质交换中发挥重要的作用。

2、人质膜膜泡关联蛋白(plasmalemma vesicle associated protein，即plvap，简称pv-1)分子量约55-60kd，ii型跨膜糖蛋白，是目前已知唯一的内皮血管微孔隔膜或质膜凹洞隔膜蛋白。早期研究证明，pv-1在内环境渗透性，白细胞迁移和血管新生中具有重要作用，近期研究表明pv-1与癌症、创伤性脊髓损伤，缺血性脑疾病或眼病密切相关。生物系统的血管-脑组织屏障和血管-视网膜屏障等内皮血管管壁上无质膜微孔或凹洞，也无pv-1蛋白表达，但病理状态下，如缺血性脑中风、脑部原发性或转移性肿瘤、糖尿病视网膜病变等情况下，血管-组织屏障结构遭到破坏，内皮血管管壁出现有微孔并伴有pv-1抗原表达。

3、综上所述，pv-1蛋白有望成为治疗年龄相关性黄斑变性(age-related maculardegeneration，amd)、糖尿病黄斑水肿(diabetic macular edema，dme)和成年患者视网膜静脉阻塞引起的黄斑水肿等疾病的新靶点。但是，目前关于pv-1靶点表达相关的文献报道较少。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种可提高人质膜膜泡关联蛋白分泌效率的信号肽和/或人质膜膜泡关联蛋白融合蛋白及其制备方法。所要解决的技术问题不限于所描述的技术主题，本领域技术人员通过以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技术主题。

2、为了实现上述目的，本发明首先提供了多肽，所述多肽的氨基酸序列可为seq idno.1。

3、所述多肽可为信号肽，名称为sp1。

4、所述信号肽sp1为人工改造的用于促进人质膜膜泡关联蛋白在哺乳动物细胞中分泌表达的信号肽。

5、本发明还提供了融合蛋白，所述融合蛋白可为包括人质膜膜泡关联蛋白和所述信号肽sp1的蛋白质。

6、所述人质膜膜泡关联蛋白(plasmalemma vesicle associated protein，plvap，pv-1)的氨基酸序列为seq id no.3，pv-1编码序列(cds)的核苷酸序列为seq id no.4。

7、进一步地，所述信号肽sp1(seq id no.1)可连接(融合)至所述人质膜膜泡关联蛋白(seq id no.3)的n端。

8、进一步地，所述融合蛋白还可包括组氨酸标签蛋白。

9、所述组氨酸标签蛋白的氨基酸序列可为hhhhhh。

10、进一步地，所述组氨酸标签蛋白(hhhhhh)可直接或者通过接头(linker)连接(融合)至所述人质膜膜泡关联蛋白(seq id no.3)的c端。

11、所述接头用于连接所述组氨酸标签蛋白和所述人质膜膜泡关联蛋白，所述接头可为柔性肽接头，包括(ggggs)n，a(eaaak)na，(ggqgg)n和iegrmd，但不限于此。

12、进一步地，所述接头(linker)的氨基酸序列可为ggggs。

13、进一步地，所述融合蛋白的氨基酸序列可为seq id no.5或seq id no.5的第1-409位。

14、seq id no.5的第1-409位所示的融合蛋白(名称为sp1-pv1)从n端到c端依次为：信号肽sp1(seq id no.1)、人质膜膜泡关联蛋白(seq id no.3)。

15、seq id no.5所示的融合蛋白(名称为sp1-pv1-his)从n端到c端依次为：信号肽sp1(seq id no.1)、人质膜膜泡关联蛋白(seq id no.3)、接头(ggggs)、组氨酸标签蛋白(hhhhhh)。

16、本发明还提供了核酸分子，所述核酸分子可为下述任一种：

17、a1)编码所述信号肽sp1的核酸分子；

18、a2)编码所述融合蛋白的核酸分子；

19、a3)编码序列是seq id no.2、seq id no.6的第16-1278位或seq id no.6的第16-1242位所示的dna分子；

20、a4)核苷酸序列是seq id no.2、seq id no.6的第16-1278位或seq id no.6的第16-1242位所示的dna分子。

21、seq id no.2所示的dna分子编码氨基酸序列是seq id no.1的信号肽sp1。

22、seq id no.6的第16-1278位所示的dna分子编码氨基酸序列是seq id no.5的融合蛋白(sp1-pv1-his)。

23、seq id no.6的第16-1242位所示的dna分子编码氨基酸序列是seq id no.5的第1-409位所示的融合蛋白(sp1-pv1)。

24、其中，seq id no.6的第1-6位为hindiii识别位点，第7-15位为kozak序列，第16-72位为信号肽sp1的编码序列，第73-1242位为pv-1蛋白的编码序列，第1243-1257位为连接肽(接头)的编码序列，第1258-1275位为组氨酸标签蛋白的编码序列，第1276-1278位为终止密码子，第1279-1286位为paci识别位点。本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法(定向进化和点突变等)，对本发明的信号肽sp1编码基因或融合蛋白的编码基因进行突变。经过人工改造的，具有与本发明的信号肽sp1编码基因或融合蛋白的编码基因75％或75％以上同一性的基因序列，只要编码信号肽sp1或本发明的融合蛋白且具有相同功能，均是衍生于本发明的序列并且等同于本发明的序列。

25、上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。

26、本文中，所述80％以上的同一性可为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。

27、本文中，同一性是指氨基酸序列或核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如ncbi主页网站的blast网页。例如，可在高级blast2.1中，通过使用blastp作为程序，将expect值设置为10，将所有filter设置为off，使用blosum62作为matrix，将gap existence cost，per residue gap cost和lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索以对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。

28、与本发明所述融合蛋白(sp1-pv1-his或sp1-pv1)具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质也在本发明的保护范围内。

29、本发明还提供了生物材料，所述生物材料可为下述任一种：

30、c1)含有所述核酸分子的表达盒；

31、c2)含有所述核酸分子的重组载体、或含有c1)所述表达盒的重组载体；

32、c3)含有所述核酸分子的重组微生物、或含有c1)所述表达盒的重组微生物、或含有c2)所述重组载体的重组微生物；

33、c4)含有所述核酸分子的重组细胞、或含有c1)所述表达盒的重组细胞、或含有c2)所述重组载体的重组细胞。

34、上述任一所述生物材料中，所述表达盒是指能够在宿主菌或宿主细胞中表达人质膜膜泡关联蛋白pv-1或上述融合蛋白的dna，该dna不但可包括启动目的基因转录的启动子，还可包括终止目的基因转录的终止子。进一步地，所述表达盒还可包括增强子序列。

35、本文所述载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒、噬菌体(如λ噬菌体或m13丝状噬菌体等)、黏粒(即柯斯质粒)、人工染色体(如酵母人工染色体(yac)、细菌人工染色体(bac)、p1人工染色体(pac)或ti质粒人工染色体(tac)等)、病毒载体(如逆转录病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒或疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)等)，所述载体具体可为pcgs3表达载体。

36、本文所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。其中，细菌可来自埃希氏菌属(escherichia),欧文氏菌(erwinia),根癌农杆菌属(agrobacterium)、黄杆菌属(flavobacterium),产碱菌属(alcaligenes),假单胞菌属(pseudomonas),芽胞杆菌属(bacillus)等。

37、本文所述细胞(宿主细胞)是指可用于导入载体的细胞，其包括但不限于：真核细胞(如酵母细胞、曲霉菌)、动物细胞(如哺乳动物细胞、昆虫细胞)或原核细胞(如大肠杆菌或枯草杆菌)。所述细胞具体可为cho细胞(如expicho-stm cells)和/或hek293细胞(如expi293ftm cells)。

38、所述重组载体具体可为重组载体pcgs3-pv1-his。所述重组载体pcgs3-pv1-his是用核苷酸是seq id no.6的dna片段替换pcgs3载体的hindiii识别位点和paci识别位点间的片段(小片段)，保持pcgs3载体的其它核苷酸序列不变得到的重组载体。seq id no.6的第1-6位为hindiii识别位点，第7-15位为kozak序列，第16-72位为信号肽sp1的编码序列，第73-1242位为pv-1蛋白的编码序列，第1243-1257位为连接肽(接头)的编码序列，第1258-1275位为组氨酸标签蛋白的编码序列，第1276-1278位为终止密码子，第1279-1286位为paci识别位点。重组载体pcgs3-pv1-his表达氨基酸序列如seq id no.5所示的融合蛋白sp1-pv1-his。

39、所述重组细胞具体可为将所述重组载体pcgs3-pv1-his导入宿主细胞cho细胞(expicho-stm cells)或hek293细胞(expi293ftm cells)得到的重组细胞。

40、本发明还提供了所述信号肽sp1，和/或，所述核酸分子，和/或，所述生物材料的下述任一种应用：

41、b1)在制备人质膜膜泡关联蛋白或其融合蛋白中的应用；

42、b2)在提高人质膜膜泡关联蛋白或其融合蛋白表达量或产量中的应用；

43、b3)在引导人质膜膜泡关联蛋白或其融合蛋白在哺乳动物细胞中分泌表达中的应用；

44、b4)在提高人质膜膜泡关联蛋白或其融合蛋白分泌效率中的应用。

45、上述任一所述应用中，所述提高人质膜膜泡关联蛋白pv-1或其融合蛋白表达量或产量可为提高人质膜膜泡关联蛋白pv-1或其融合蛋白在宿主细胞中的表达量或产量。在本发明的具体实施例中，所述宿细胞可为cho细胞或hek293细胞。所述提高的方法可为在所述宿主细胞中导入所述重组质粒pcgs3-pv1-his。

46、本发明还提供了本文中任一所述融合蛋白(sp1-pv1-his和/或sp1-pv1)的下述任一种应用：

47、d1)在以人质膜膜泡关联蛋白为靶点的相关药物的筛选和/或开发中的应用；

48、d2)在制备人质膜膜泡关联蛋白结合试剂中的应用；

49、d3)在制备人质膜膜泡关联蛋白抗体中的应用。

50、本发明还提供了一种制备人质膜膜泡关联蛋白融合蛋白的方法，所述方法可包括使编码本文中任一所述融合蛋白的核酸分子在宿主细胞中进行表达，得到所述人质膜膜泡关联蛋白融合蛋白。

51、进一步地，所述方法可包括如下步骤：

52、e1)构建含有编码本文中任一所述融合蛋白(sp1-pv1-his和/或sp1-pv1)的核酸分子的重组表达载体；

53、e2)将所述重组表达载体导入宿主细胞，得到重组细胞；

54、e3)培养所述重组细胞，经分离和/或纯化得到所述人质膜膜泡关联蛋白融合蛋白。

55、进一步地，所述编码本文中任一所述融合蛋白的核酸分子可为下述任一种：

56、f1)seq id no.6的第16-1278位所示的dna分子；

57、f2)seq id no.6的第16-1242位所示的dna分子；

58、f3)seq id no.6所示的dna分子。

59、进一步地，所述宿主细胞为cho细胞(expicho-stm cells)或hek293细胞(expi293ftm cells)。

60、进一步地，所述导入是通过电转或转染试剂等转染等方式，导入cho或hek293细胞。

61、本发明采用信号肽sp1(seq id no.1)促进人质膜膜泡关联蛋白pv-1融合蛋白真核细胞分泌表达，hek293表达系统蛋白产量和纯度显著高于cho表达系统。进一步研究证明：人质膜膜泡关联蛋白组氨酸标签融合蛋白(sp1-pv1-his)表达效率显著高于fc融合蛋白(sp1-pv1-fc)，其中，hek293表达系统提高27.2倍，cho表达系统纯化未获得sp1-pv1-fc。此外，组氨酸标签分子量小，空间位阻弱，有利于保持蛋白活性，纯化简单，更适用于大规模工业化生产，降低生产成本。本发明开发的信号肽sp1及与之融合的融合蛋白sp1-pv1-his和sp1-pv1将为设计新型pv-1靶点药物提供关键抗原，为后期以pv-1为靶点的相关药物的应用和开发提供强有力的支撑。