基因整合方法及应用

本发明涉及生物学和医学领域，具体地涉及一种高效的基于mmej抑制的基因整合方法及应用。

背景技术：

1、使用crispr/cas9系统的基因组编辑依赖于由sgrna引导的cas9核酸内切酶诱导的dna双链断裂(dsbs)的修复(barrangou和doudna,2016；komor et al.，2017)。dna双链断裂的同源性介导修复(hdr)能够精确整合供体dna的基因组，引入基因组变化，包括序列替换、插入和缺失(barrangou和doudna,2016；komor et al.，2017)。因此，hdr已被广泛应用于通过合子注射crispr/cas9试剂和带有同源臂的外源dna供体来产生基因修饰的动物模型和生殖细胞基因校正(midic et al.，2017；wang et al.，2013；yang et al.，2013；yinet al，2014)。然而,由于非同源末端连接(nhej)(stinson et al.，2020)、微同源介导末端连接(mmej)(mcvey and lee，2008)和单链退火(ssa)(scully et al.，2019)等其他修复途径的竞争，通过hdr进行精确dna整合的总体效率相当低。因此，阻断其他修复途径已成为改善hdr的常用策略。

2、抑制nhej修复途径以前曾被用于提高hdr效率(chu et al.，2015；maruyama etal.，2015)，但在几项研究中发现这一策略无效(fu et al.，2021b；song et al.，2016)。最近的研究表明，mmej是一个重要的dsb修复途径，可能与其他修复途径协同工作，或在某些特定类型的dna损伤中单独发挥作用(truong et al.，2013)。此外，mmej和hdr都需要dna末端切除，可能直接相互竞争(ceccaldi et al.，2015；mateos-gomez et al.，2017)。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种高效的啮齿动物和灵长类胚胎中基于mmej抑制的基因整合方法。

2、在本发明的第一方面，提供了一种polq(微同源介导的末端连接mmej关键因子聚合酶q)抑制剂的用途，用于制备一组合物或制剂，所述组合物或制剂，用于：

3、(a)在基因编辑过程中，下调mmej；

4、(b)在基因编辑过程中，促进hdr(同源介导修复)；

5、(c)在基因编辑过程中，提高外源基因的整合效率；

6、(d)在基因编辑过程中，促进crispr/cas9的基因编辑；和/或

7、(e)促进细胞基因治疗和/或基因矫正。

8、在另一优选例中，所述基因编辑为基于crispr/cas9进行的基因编辑。

9、在另一优选例中，所述基因编辑包括对胚胎细胞的基因编辑。

10、在另一优选例中，所述基因编辑包括对处于2细胞阶段和/或4细胞阶段和/或8细胞阶段的胚胎细胞的基因编辑。

11、在另一优选例中，所述的组合物包括药物组合物。

12、在另一优选例中，所述的制剂包括实验用试剂。

13、在另一优选例中，所述的促进crispr/cas9的基因编辑选自下组：

14、(p1)提高crispr/cas9的基因编辑效率；

15、(p2)提高hdr效率；

16、(p3)提高了ssodn(单链寡核苷酸)介导的核苷酸替换的效率；

17、(p4)不增加脱靶效应；和/或

18、(p5)不引入额外突变。

19、在另一优选例中，所述“脱靶率”指toff/(ton+toff)比值，其中，ton为靶定位点的编辑率(即在grna引导下在预定靶点位置发生的编辑率)，toff为非靶定位点的编辑率(即碱基编辑器在非靶向位置的脱靶编辑效率)。

20、在另一优选例中，所述“促进crispr/cas9的基因编辑”包括：在提高crispr/cas9在靶编辑效率的同时，不导致或基本不导致脱靶编辑率升高。

21、在另一优选例中，所述的“促进crispr/cas9的基因编辑”包括：提高基因编辑效率。

22、在另一优选例中，所述的crispr/cas9基因编辑器选自下组：来源于streptococcus pyogenes的spcas9，及其扩展pam识别序列突变体(spcas9-vqr,-vrqr,-vrer，-ng和spry)，及其高保真突变体spcas9-hf和espcas9；来源于staphylococcusaureus的sacas9，及其突变体sacas9-kkh；cas12a，包括ascpf1，lbcpf1和fncpf1。

23、在另一优选例中，crispr/cas9基因编辑器包括不同的突变体。

24、在另一优选例中，所述的基因编辑包括体内基因编辑、体外基因编辑、或其组合。

25、在另一优选例中，所述的基因编辑针对的样品选自下组：细胞、组织、器官、或其组合。

26、在另一优选例中，所述的样品来自动物。

27、在另一优选例中，所述的样品来自人和非人哺乳动物。

28、在另一优选例中，所述的细胞包括原代细胞和传代的细胞。

29、在另一优选例中，所述的细胞包括体细胞、生殖细胞、配子、干细胞。

30、在另一优选例中，所述的干细胞包括：全能干细胞、多能干细胞、和单能干细胞。

31、在另一优选例中，所述的干细胞为诱导性多能干细胞(ipsc)。

32、在另一优选例中，所述的细胞包括：悬浮细胞、贴壁细胞。

33、在另一优选例中，所述polq抑制剂选自下组：小分子、抗体、多肽、寡核苷酸、适体、基因编辑试剂、或其组合。

34、在另一优选例中，所述polq抑制剂选自下组：shrna、干扰rna、sirna、microrna、或其组合。

35、在另一优选例中，所述polq抑制剂为下调polq表达的rna编辑器casrx。

36、在本发明的第二方面，提供了一种crispr/cas9基因编辑的方法，所述方法包括：

37、在polq抑制剂的存在下，对细胞进行基因编辑，从而促进所述细胞内的基因编辑。

38、在另一优选例中，所述polq抑制剂选自下组：小分子、抗体、多肽、寡核苷酸、适体、基因编辑试剂、或其组合。

39、在另一优选例中，所述polq抑制剂选自下组：shrna、干扰rna、sirna、microrna、或其组合。

40、在另一优选例中，所述polq抑制剂为下调polq表达的rna编辑器casrx。

41、在另一优选例中，所述的方法包括体内和/或体外方法。

42、在另一优选例中，在进行基因编辑之前、之中和/或之后，将所述polq抑制剂与所述进行基因编辑的细胞进行接触。

43、在另一优选例中，所述的体外的基因编辑在一体外反应体系中进行。

44、在另一优选例中，所述方法为非诊断性和非治疗性的。

45、在另一优选例中，所述的制剂包括药物组合物。

46、在本发明的第三方面，提供了一种体外的crispr/cas9基因编辑的方法，所述方法包括：

47、在polq抑制进剂的存在下，在体外对待编辑的细胞进行基因编辑，从而促进所述细胞内的基因编辑。

48、在另一优选例中，所述polq抑制剂选自下组：小分子、抗体、多肽、寡核苷酸、适体、基因编辑试剂、或其组合。

49、在另一优选例中，所述polq抑制剂选自下组：shrna、干扰rna、sirna、microrna、或其组合。

50、在另一优选例中，所述polq抑制剂为下调polq表达的rna编辑器casrx。

51、在另一优选例中，所述的方法是非诊断和非治疗的。

52、在另一优选例中，所述细胞选自下组：胚胎细胞、干细胞、或其组合。

53、在另一优选例中，所述胚胎细胞为处于2细胞阶段和/或4细胞阶段和/或8细胞阶段的胚胎细胞。

54、在本发明的第四方面，提供了一种试剂产品(或试剂组合)，包括：

55、(i)第一试剂，所述的第一试剂为polq抑制剂；和

56、(ii)第二试剂，所述的第二试剂是进行crispr/cas9基因编辑的试剂。

57、在另一优选例中，所述的第二试剂包括选自下组的一种或多种试剂：

58、(c1)crispr/cas9编辑器、crispr/cas9编辑器的编码序列、或表达crispr/cas9编辑器的载体、或组合；

59、(c2)grna、crrna、或用于产生所述grna或crrna的载体；

60、在另一优选例中，所述polq抑制剂选自下组：小分子、抗体、多肽、寡核苷酸、适体、基因编辑试剂、或其组合。

61、在另一优选例中，所述polq抑制剂选自下组：shrna、干扰rna、sirna、microrna、或其组合。

62、在另一优选例中，所述polq抑制剂为下调polq表达的rna编辑器casrx。

63、在另一优选例中，所述的基因编辑针对致病基因、肿瘤相关基因(如致癌基因)、免疫相关基因(如与自身免疫相关的基因，或与免疫治疗相关基因)、视觉相关基因、听觉相关、肿瘤相关、脑发育相关、生殖相关、肝脏疾病相关、肾脏疾病、胰腺疾病相关、骨骼疾病相关、神经疾病相关、胶质疾病相关、肌肉疾病相关、血液疾病相关、器官发育相关、损伤修复、代谢相关、病毒感染相关、遗传疾病、衰老相关。

64、在另一优选例中，所述基因选自下组：actb，mecp2，stxbp1，dmd，scn1a等，或其组合。

65、在本发明第五方面，提供了一种试剂盒，包括：

66、(i)第一容器，以及位于所述第一容器的第一试剂，所述的第一试剂为polq抑制剂；和

67、(ii)第二容器，以及位于所述第二容器内的第二试剂，所述的第二试剂是进行crispr/cas9基因编辑的试剂。

68、在另一优选例中，所述的试剂盒还含有说明书。

69、在另一优选例中，所述的说明书记载了本发明的促进基因编辑的方法。

70、在另一优选例中，所述的基因编辑是针对体细胞、干细胞的基因编辑。

71、在另一优选例中，所述polq抑制剂选自下组：小分子、抗体、多肽、寡核苷酸、适体、基因编辑试剂、或其组合。

72、在另一优选例中，所述polq抑制剂选自下组：shrna、干扰rna、sirna、microrna、或其组合。

73、在另一优选例中，所述polq抑制剂为下调polq表达的rna编辑器casrx。

74、在本发明第六方面，提供了一个提高基因编辑效率的反应体系，包括：

75、(i)一个待编辑的dna靶序列；

76、(ii)crispr/cas9基因编辑器；

77、(iii)polq抑制剂；

78、(iv)grna、crrna、或用于产生所述grna或crrna的载体；和

79、(v)待整合入的外源基因表达盒。

80、在另一优选例中，所述polq抑制剂选自下组：小分子、抗体、多肽、寡核苷酸、适体、基因编辑试剂、或其组合。

81、在另一优选例中，所述polq抑制剂选自下组：shrna、干扰rna、sirna、microrna、或其组合。

82、在另一优选例中，所述polq抑制剂为下调polq表达的rna编辑器casrx。

83、在本发明第七方面，提供了一种筛选对胚胎细胞进行crispr/cas9基因编辑的潜在激动剂的方法，包括步骤：

84、(a)提供待测试的化合物；

85、(b)在测试组中，在所述待测试化合物存在下，培养细胞，并测定polq表达水平或活性e1，并且在对照组中，在无所述待测试化合物存在下，培养细胞，并测定polq表达水平或活性e0，其中对照组和测试组的除了所述测试化合物之外，其他条件相同；

86、其中，如果所述表达水平或活性e1显著低于表达水平或活性e0，则提示所述化合物为crispr/cas9基因编辑器的潜在激动剂。

87、在另一优选例中，所述方法还包括：

88、(c)进一步测试所述crispr/cas9基因编辑器的潜在激动剂，在细胞模型或动物模型中，对于crispr/cas9基因编辑是否存在促进作用。

89、应理解，在本发明范围内，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一赘述。