一种稗草生防菌B-48及其应用方法

一种稗草生防菌b-48及其应用方法
技术领域
1.本发明涉及微生物农药技术领域，具体为一株稗属炭疽菌b-48及其在除 草中的应用。


背景技术：

2.水稻是重要的粮食作物，世界上以水稻为主食的人口，占世界总人口的 60％-70％，而我国水稻产量占全世界总产的近40％。稻田杂草是限制水稻产量 的最重要的生物因素之一，它们与水稻争夺阳光、养料和水分等，直接导致 稻田减产、水稻品质下降。稗草(echinochloa crus-galli)适应性强、喜潮 湿，已经成为水稻田危害最严重的杂草之一。长期以来，稗草以化学防治为 主，随着除草剂的大量、广泛使用，稗草已成为世界上最严重的抗性杂草之 一，并严重威胁农业生产。与化学除草剂相比，从微生物等生物资源中寻找 具有除草活性的潜力菌株及其活性成分，具有环境兼容性且不易产生抗药性 等优点，已经成为开发“环境友好”除草剂的重要来源。
3.根据文献调研，已商品化或即将商品化的微生物除草剂有近20种。其中， 刺盘孢属(colletotrichum)真菌作为生物除草剂已用于防除多种杂草，具有 开发潜力。本发明涉及的稗属炭疽菌(colletotrichum echinochloae)菌株 b-48，其孢子悬浮液对稗草具有显著除草活性，具有开发为防除稗草的生物 除草剂的潜力。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供一株牛筋草炭疽菌b-48及其在除草中的应用。该菌 株易于规模发酵，其孢子悬浮液对稗草具有显著除草活性，具有开发为防除 稗草的生物除草剂的潜力。
5.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：本发明的稗草炭疽菌菌株colletotrichum echinochloa b-48已于2020年11月6日保藏于中国典型培 养物保藏中心，保藏号：cctcc no.m2020689，地址：中国.武汉.武汉大学， 邮编：430072。
6.本发明所述的稗属炭疽菌菌株b-48的孢子液制备方法，该方法包括以下 步骤：将b-48接种于psb培养基，28℃、220rpm摇培7d，收集孢子并配制 成1
×
106个孢子/ml浓度的孢子液，最终配制成孢子液：大豆油＝9:1(v/v) 体积比及含0.1％吐温的孢子悬浮液。
7.本发明所述的接种方法，该方法包括以下步骤：稗草炭疽菌侵染致病的 最佳条件是接种浓度在106个孢子/ml数量级或更高，接种后保湿培养24h， 并在整个侵染期保持温度在25-28℃，湿度在80％以上。
8.与现有技术相比，本发明的有益效果是：该稗草炭疽菌菌株的孢子对稗 草生长有较强的抑制作用，可用于禾本科杂草稗草的防治。使用孢子液浓度 106个孢子/ml，孢子液：大豆油＝9:1(v/v)体积比及0.1％吐温80喷施3-4叶期 的稗草，接种3天后能形成明显的叶部病斑，接种7的后对稗草地上部分的生 长抑制率达到74.92％。该菌对玉米、小麦、水稻安全，专一性强，有进一步 开发的潜力。
附图说明
9.图1为本发明提出的一种稗草生防菌及其应用的生防菌b-48的形态特 征；
10.图2为本发明提出的一种稗草生防菌及其应用的基于its序列采用nj法 构建菌株b-48及其相关菌株的系统发育树；
11.图3为本发明提出的一种稗草生防菌及其应用的稗草炭疽菌b-48菌株在 不同培养基上的生长速率表格；
12.图4为本发明提出的一种稗草生防菌及其应用的稗草炭疽菌b-48菌株不 同孢子液浓度对稗草致病的影响表格；
13.图5为本发明提出的一种稗草生防菌及其应用的b-48菌株孢子液对不同 叶龄的稗草的生长抑制率的比较表格。
具体实施方式
14.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行 清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而 不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做 出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
15.实施例1除草真菌的分离纯化与鉴定
16.1.稗草病原菌分离、纯化：采集稗草病叶样品，采用常规组织分离法分 离病原菌，用清水洗净病叶并剪取3mm
×
3mm的病健交界处组织，用 75％乙醇处理30s，0.1％升汞消毒1-2min，无菌水冲洗3遍，接种在 pda培养基上，28℃下培养7d，将获得的菌株通过单孢纯化后保存在 pda斜面及滤纸片上，分别置于4℃及-20℃冰箱保存备用。
17.2.稗草病原菌的致病性鉴定：采用菌丝块离体接种进行：从三叶期健康 稗草植株上选取大小一致的无病害叶片20片，70％酒精1min进行表 面消毒，打取直径为5mm的菌丝块，接种至稗草健康叶片上；以接种 pda培养基作为对照，置于瓷盘内28℃保湿培养，接种2d后移去菌 丝块，观察发病情况；根据柯赫氏法则，对发病叶片进行再分离、培 养，在显微镜下观察分离得到的菌株是否为原始接种菌株。
18.3.稗草病原菌分类地位鉴定：病原菌形态学鉴定：将病原菌接种到pda、 psa培养平板上，25℃黑暗培养，观察菌落形态、颜色、分生孢子及 附着胞的特征等，对病原菌进行初步鉴定；病原菌的分子鉴定：采用 ctab法提取病原菌株的基因组dna。采用通用引物its1
19.(5'-tccgtaggtgaacctgcgg-3')/its4
20.(5'-tcctccgcttattgatatgc-3')扩增该病原菌的目的基因序列，所 得到的核苷酸序列与genbank中序列进行blast比对分析，使用mega 7.0软件将供试菌株的its序列与blast上同源性高的菌株序列进行 比对，采用邻近法(neighbor-joining，nj)进行聚类分析，构建系 统发育树。
21.实施例2：菌株b-48接种液的制备
22.将菌株b-48接种于psb培养基，28℃、220r/min摇培7d，收集孢子， 并配制成浓度为1
×
106个/ml的孢子悬浮液，最终配制成孢子液：大豆油＝9:1 (v/v)体积比及含0.1％吐温的孢子悬浮液。
23.实施例3：除草活性测定
24.将浓度为1
×
106个孢子/ml的孢子液，配制成孢子液：大豆油＝9:1(v/v) 体积比及含0.1％吐温80的孢子悬浮液，喷施3-4叶期稗草植株，28℃、黑 暗保湿培养24h后，16h/8h光/暗培养。以喷施水：大豆油＝9：1(v/v) 体积比及含0.1％的吐温80的植株为对照。接种3天后，观察供试稗草植株的 发病情况。7天后收集作物地上部分，统计鲜重抑制率。鲜重抑制率(freshweight inhibition rate,fwir)的计算公式：fwir(％)＝(对照平均鲜重-处 理平均鲜重)/对照平均鲜重
×
100。
25.实施例4：不同孢子浓度对除草的影响
26.将孢子浓度为设置为0、104、105、106、107、108个/ml，配制成孢子液： 大豆油＝9:1(v/v)体积比及含0.1％吐温80的孢子悬浮液，喷施3-4叶期稗 草植株，28℃、黑暗保湿培养24h后，16h/8h光/暗培养。以喷施水：大 豆油＝9：1(v/v)体积比及含0.1％的吐温80的植株为对照。接种3天后，观 察供试稗草植株的发病情况。7天后收集作物地上部分，统计鲜重抑制率。鲜 重抑制率(fresh weight inhibition rate,fwir)的计算公式：fwir(％)＝ (对照平均鲜重-处理平均鲜重)/对照平均鲜重
×
100。
27.实施例5：不同叶龄对除草的影响
28.将孢子浓度为设置为106个/ml，配制成孢子液：大豆油＝9:1(v/v)体积 比及含0.1％吐温80的孢子悬浮液，喷施4、5、6、7、8、9叶期稗草植株， 28℃、黑暗保湿培养24h后，16h/8h光/暗培养。以喷施水：大豆油＝9： 1(v/v)体积比及含0.1％的吐温80的植株为对照。接种3天后，观察供试稗 草植株的发病情况。7天后收集作物地上部分，统计鲜重抑制率。鲜重抑制率 (fresh weight inhibition rate,fwir)的计算公式：fwir(％)＝(对照平 均鲜重-处理平均鲜重)/对照平均鲜重
×
100。
29.尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人 员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其 中部分技术特征进行等同替换，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何 修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。