一种噻虫嗪单克隆抗体的制备方法与流程

1.本技术涉及免疫学技术领域，更具体地说，它涉及一种噻虫嗪单克隆抗体的制备方法。


背景技术：

2.噻虫啉为广谱、内吸性新烟碱类杀虫剂，对刺吸口器害虫有良好的杀灭效果，作用于烟酸乙酰胆碱受体，与有机磷、氨基甲酸酯、拟除虫菊酯类常规杀虫剂无交互抗性，可用于抗性治理。而噻虫嗪单克隆抗体与其他化合物不发生交叉反应，用该抗体建立的酶联免疫层析分析方法可用于快速、灵敏、方便和廉价检测环境和农产品中噻虫啉残留。
3.现有技术中为得到噻虫嗪单克隆抗体，将其人工抗原免疫balb/c雌性小鼠，将骨髓瘤细胞sp2/0与小鼠脾脏细胞进行细胞融合，制备得到杂交瘤细胞；通过系列筛选和亚克隆得到能稳定分泌抗噻虫啉单克隆抗体的杂交瘤细胞株；再将该杂交瘤细胞株注射小鼠腹内制得腹水；采用辛酸硫酸铵法纯化小鼠腹水，制得噻虫啉的特异性单克隆抗体。其中在杂交瘤细胞的制备过程中，因细胞融合需要，过程中多选用化学融合剂聚乙二醇(peg)。
4.针对上述中的相关技术，细胞融合效果与peg的分子量和浓度有关，分子量和浓度越大，起到的细胞融合效果越优异，但过程中对细胞的毒性也就越大，导致噻虫嗪单克隆抗体的效价、敏感性、亲和力以及特异性不佳，整体品质有损失，因此，需要提出一种新的方案来解决上述问题。


技术实现要素：

5.为了减少peg在细胞融合过程中的不利影响，并提高得到噻虫嗪单克隆抗体的整体品质，本技术提供一种噻虫嗪单克隆抗体的制备方法。
6.本技术提供的一种噻虫嗪单克隆抗体的制备方法，采用如下的技术方案：一种噻虫嗪单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：(1)制备免疫抗原和包被抗原：将噻虫啉半抗原溶解在dmf中，然后在溶液中加入n-羟基琥珀酰亚胺，搅拌均匀后加入二环已基碳二亚胺，反应完全后取上清液加入到牛血清蛋白中，继续搅拌反应完成后，用pbs缓冲液进行透析，即可得到免疫抗原；并同法将牛血清蛋白替换为卵清蛋白制得包被抗原；(2)杂交瘤细胞株的建立：sp2/0骨髓瘤细胞与balb/c小鼠脾细胞在融合剂的作用下融合，将细胞悬液置于dmem培养基的恒温培养箱中进行培养，融合后用hat培养液半量换液，培养完全后，取细胞上清液，间接elisa法测定并选取阳性高的孔，通过有限稀释法对阳性孔进行亚克隆，直至建立产生噻虫嗪单克隆抗体的杂交瘤细胞株；(3)单克隆抗体的大量制备：选用balb/c小鼠，腹腔注射腹水刺激剂，将杂交瘤细胞株注入小鼠腹腔，然后采集腹水，并通过辛酸-硫酸铵沉淀纯化腹水，-20℃保存，获得噻虫嗪单克隆抗体。
7.上述步骤中，所述融合剂主要包括聚乙二醇、芝麻酚、甜菊糖苷和羊脂，且聚乙二
醇、芝麻酚、甜菊糖苷和羊脂的质量混合比为1000：(100-120)：(50-70)：(2-3)。
8.通过采用上述技术方案，聚乙二醇可与水分子借氢键结合，导致细胞脱水而发生质膜结构的变化，从而引起细胞融合，而在细胞融合过程中，通过加入芝麻酚、甜菊糖苷和羊脂的组合进去，能够深入细胞膜，能改善细胞的通透性，使受损的细胞更替加快，并对层粘连蛋白的生成有促进作用，促进细胞因子的产生和膜表面蛋白的表达，抗干扰性能优异，进而能够起到良好的促细胞融合效果。同时，在保证细胞融合效果的前提下，选用分子量较小和浓度较低的聚乙二醇，进而降低聚乙二醇自身的毒性影响，且本技术人发现，上述融合剂中的芝麻酚、甜菊糖苷和羊脂能够起到良好的细胞保护作用，显著降低细胞受聚乙二醇的毒性影响，有利于得到效价高、敏感性好、亲和力以及特异性优异的噻虫嗪单克隆抗体。
9.优选的，所述聚乙二醇、芝麻酚、甜菊糖苷和羊脂的质量混合比为1000：110：55：3。
10.通过采用上述技术方案，上述比例的聚乙二醇、芝麻酚、甜菊糖苷和羊脂，相互间配合对细胞的毒性破坏作用较低，并在应用过程中起到的细胞融合效果最优。
11.优选的，所述步骤(2)中，融合剂的ph值为7.8-8.2。
12.通过采用上述技术方案，选择上述ph值的融合剂，能够发挥出良好稳定的细胞融合效果。
13.优选的，所述步骤(2)中，融合剂的滴加操作为，先以0.03ml/s滴加融合剂总量的30-40％，再以0.015ml/s滴加融合剂总量的40-50％，最后再以0.03ml/s滴加融合剂剩余部分。
14.优选的，所述步骤(2)中，融合剂的滴加操作为，先以0.03ml/s滴加融合剂总量的30％，再以0.015ml/s滴加融合剂总量的45％，最后再以0.03ml/s滴加融合剂剩余部分。
15.通过采用上述技术方案，融合剂选用上述滴加方式，并控制滴加速度，能够发挥出优异的细胞融合效果。
16.优选的，所述步骤(2)中，在加入融合剂反应1.5-2.5min后，加入10-15ml的gnk溶液进行终止反应。
17.通过采用上述技术方案，在加入融合剂反应一段时间后，加入gnk溶液进行终止反应，使细胞融合效果最佳。
18.优选的，所述gnk溶液在加入前进行预热，预热温度为37-40℃，且滴加速度为0.03-0.04ml/s。
19.通过采用上述技术方案，对gnk溶液进行预热，并预热至37-40℃，不易对细胞造成损伤，而选用上述滴加速度，能够发挥出优异的细胞融合效果。
20.优选的，所述步骤(3)中，腹水刺激剂可以选用为无菌液体石蜡、降植烷和弗氏不完全佐剂中的任意一种。
21.通过采用上述技术方案，述种类的腹水刺激剂能有效抑制小鼠巨噬细胞和淋巴细胞的免疫功能，使小鼠能更好的接纳腹腔中具有恶性生长特性的杂交瘤，进而在后续收集腹水时，能够获得较好的效果。
22.优选的，所述步骤(3)中，注入单只小鼠腹腔的细胞个数为2
×
10
6-5
×
106个。
23.通过采用上述技术方案，上述注射量的亚克隆后扩大的细胞，能够在小鼠腹腔内形成数量稳定和品质优异的噻虫嗪单克隆抗体。
24.优选的，所述聚乙二醇的分子量为5000，浓度为30-40％。
25.通过采用上述技术方案，上述分子量和浓度的聚乙二醇，能够和芝麻酚、甜菊糖苷、羊脂相互配合并起到良好的作用效果，使细胞不易被破坏，进而能够发挥出优异的细胞融合效果。
26.综上所述，本技术具有以下有益效果：1、由于本技术将聚乙二醇、芝麻酚、甜菊糖苷和羊脂按一定比例范围混合作为融合剂使用时，不仅能够起到优异的细胞融合效果，还能够降低对细胞的毒性作用，有利于得到效价高、敏感性好、亲和力以及特异性优异的噻虫嗪单克隆抗体。
27.2、本技术中优选采用融合剂的滴加操作，并控制滴加速度，以及在加入融合剂反应一段时间后，加入gnk溶液进行终止反应，并控制gnk溶液滴加速度，能够发挥出优异的细胞融合效果。
具体实施方式
28.以下结合实施例对本技术作进一步详细说明。
29.本技术的各实施例中所用的原料，除下述特殊说明之外，其他均为市售：
原料和/或中间体的制备例噻虫啉半抗原通过如下方法制得：在氮气保护下将噻虫啉、巯基丙酸和氢氧化钾按质量比为2.7:1:1.02混合，然后加入5倍质量的二甲亚砜，搅拌至全部溶解，并在100℃下保温反应2h；随后加入3倍质量的去离子水并调节至25℃，且调节ph值至3，接着用三氯甲烷进行萃取，收集下层有机层，经无水硫酸钠干燥和减压浓缩，经硅胶柱层析，获得噻虫啉半抗原成品。实施例
30.实施例1一种噻虫嗪单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：(1)制备免疫抗原和包被抗原：将2.2mg噻虫啉半抗原溶解在1m dmf中，然后在溶液中加入4.5mg n-羟基琥珀酰亚胺，25℃搅拌3h后加入10mg二环已基碳二亚胺，反应完全后取上清液0.5ml加入到12ml牛血清蛋白中，室温37℃避光搅拌6h，用pbs缓冲液进行透析3天，即可得到免疫抗原；并同法将牛血清蛋白替换为卵清蛋白制得包被抗原；
(2)杂交瘤细胞株的建立：sp2/0骨髓瘤细胞与balb/c小鼠脾细胞在融合剂的作用下融合，将细胞悬液置于dmem培养基的37℃恒温培养箱中进行培养，7天融合后用hat培养液半量换液，15天后取细胞上清液，间接elisa法测定并选取阳性高的孔，通过有限稀释法对阳性孔进行亚克隆，直至建立产生噻虫嗪单克隆抗体的杂交瘤细胞株；(3)单克隆抗体的大量制备：选用8周龄balb/c小鼠，腹腔注射0.5ml腹水刺激剂，10天后将杂交瘤细胞株注入小鼠腹腔，5天后采集腹水，并通过辛酸-硫酸铵沉淀纯化腹水，-20℃保存，获得噻虫嗪单克隆抗体。
31.注：上述步骤中，融合剂以0.03ml/s滴加1ml，且融合剂由聚乙二醇、芝麻酚、甜菊糖苷和羊脂按质量比为1000：110：55：3组成；腹水刺激剂可以选用为无菌液体石蜡。注入单只小鼠腹腔的细胞个数为3.5
×
106个。融合剂的ph值为8.0。聚乙二醇的分子量为5000，浓度为35％。
32.实施例2一种噻虫嗪单克隆抗体的制备方法，与实施例1的不同之处在于，融合剂中聚乙二醇、芝麻酚、甜菊糖苷和羊脂的质量混合比为1000：110：60：2.5。
33.实施例3一种噻虫嗪单克隆抗体的制备方法，与实施例1的不同之处在于，融合剂中聚乙二醇、芝麻酚、甜菊糖苷和羊脂的质量混合比为1000：100：50：2。
34.实施例4一种噻虫嗪单克隆抗体的制备方法，与实施例1的不同之处在于，融合剂中聚乙二醇、芝麻酚、甜菊糖苷和羊脂的质量混合比为1000：120：70：3。
35.实施例5一种噻虫嗪单克隆抗体的制备方法，与实施例1的不同之处在于，步骤(2)中，融合剂的滴加操作为，先以0.03ml/s滴加融合剂总量的30％，再以0.015ml/s滴加融合剂总量的45％，最后再以0.03ml/s滴加融合剂剩余部分。
36.实施例6一种噻虫嗪单克隆抗体的制备方法，与实施例1的不同之处在于，步骤(2)中，融合剂的滴加操作为，先以0.03ml/s滴加融合剂总量的35％，再以0.015ml/s滴加融合剂总量的45％，最后再以0.03ml/s滴加融合剂剩余部分。
37.实施例7一种噻虫嗪单克隆抗体的制备方法，与实施例1的不同之处在于，所述步骤(2)中，融合剂的滴加操作为，先以0.03ml/s滴加融合剂总量的30％，再以0.015ml/s滴加融合剂总量的40％，最后再以0.03ml/s滴加融合剂剩余部分。
38.实施例8一种噻虫嗪单克隆抗体的制备方法，与实施例1的不同之处在于，所述步骤(2)中，融合剂的滴加操作为，先以0.03ml/s滴加融合剂总量的40％，再以0.015ml/s滴加融合剂总量的50％，最后再以0.03ml/s滴加融合剂剩余部分。
39.实施例9一种噻虫嗪单克隆抗体的制备方法，与实施例1的不同之处在于，步骤(2)中，融合剂的ph值为7.8。
40.实施例10一种噻虫嗪单克隆抗体的制备方法，与实施例1的不同之处在于，步骤(2)中，融合剂的ph值为8.2。
41.实施例11一种噻虫嗪单克隆抗体的制备方法，与实施例1的不同之处在于，步骤(3)中，腹水刺激剂可以选用为降植烷。
42.实施例12一种噻虫嗪单克隆抗体的制备方法，与实施例1的不同之处在于，步骤(3)中，腹水刺激剂可以选用为弗氏不完全佐剂。
43.实施例13一种噻虫嗪单克隆抗体的制备方法，与实施例1的不同之处在于，步骤(3)中，注入单只小鼠腹腔的细胞个数为5
×
106个。
44.实施例14一种噻虫嗪单克隆抗体的制备方法，与实施例1的不同之处在于，步骤(3)中，注入单只小鼠腹腔的细胞个数为2
×
106个。
45.实施例15一种噻虫嗪单克隆抗体的制备方法，与实施例1的不同之处在于，步骤(2)中，乙二醇的分子量为5000，浓度为30％。
46.实施例16一种噻虫嗪单克隆抗体的制备方法，与实施例1的不同之处在于，步骤(2)中，乙二醇的分子量为5000，浓度为40％。
47.实施例17一种噻虫嗪单克隆抗体的制备方法，与实施例1的不同之处在于，步骤(2)中，在加入融合剂反应2min后，加入12.5ml的gnk溶液进行终止反应，gnk溶液在加入前进行预热，预热温度为38.5℃，且滴加速度为0.035ml/s。
48.实施例18一种噻虫嗪单克隆抗体的制备方法，与实施例1的不同之处在于，步骤(2)中，在加入融合剂反应1.5min后，加入10ml的gnk溶液进行终止反应，gnk溶液在加入前进行预热，预热温度为37℃，且滴加速度为0.03ml/s。
49.实施例19一种噻虫嗪单克隆抗体的制备方法，与实施例1的不同之处在于，步骤(2)中，在加入融合剂反应2.5min后，加入15ml的gnk溶液进行终止反应，gnk溶液在加入前进行预热，预热温度为40℃，且滴加速度为0.04ml/s。
50.对比例对比例1一种噻虫嗪单克隆抗体的制备方法，与实施例1的不同之处在于，融合剂由聚乙二醇、甜菊糖苷和羊脂按质量比为1000：55：3组成。
51.对比例2一种噻虫嗪单克隆抗体的制备方法，与实施例1的不同之处在于，融合剂由聚乙二
醇、芝麻酚和羊脂按质量比为1000：110：3组成。
52.对比例3一种噻虫嗪单克隆抗体的制备方法，与实施例1的不同之处在于，融合剂由聚乙二醇、芝麻酚和甜菊糖苷按质量比为1000：110：55组成。
53.对比例4一种噻虫嗪单克隆抗体的制备方法，与实施例1的不同之处在于，融合剂由聚乙二醇和羊脂按质量比为1000：3组成。
54.对比例5一种噻虫嗪单克隆抗体的制备方法，与实施例1的不同之处在于，融合剂由聚乙二醇、甜菊糖苷按质量比为1000：55组成。
55.对比例6一种噻虫嗪单克隆抗体的制备方法，与实施例1的不同之处在于，融合剂由聚乙二醇、芝麻酚按质量比为1000：110组成。
56.对比例7一种噻虫嗪单克隆抗体的制备方法，与实施例1的不同之处在于，融合剂为聚乙二醇。
57.性能检测试验试验样品：采用实施例1-19中获得的噻虫嗪单克隆抗体为试验样品1-19，采用对比例1-7中获得的噻虫嗪单克隆抗体作为对照样品1-7。
58.试验方法：(1)效价测定，采用间接elisa测定其效价。
59.(2)敏感性鉴定，用阻断elisa测定噻虫嗪单克隆抗体对不同浓度噻虫嗪的抑制率，以抑制率b/b0(b是噻虫嗪不同浓度的od
450
值，b0是噻虫嗪0标准浓度的od
450
值)为纵坐标，以不同浓度噻虫嗪的对数值为横坐标，绘制标准抑制曲线，进行相关回归分析，计算噻虫嗪单克隆抗体对噻虫嗪的ic
50
。
60.(3)特异性测定，用噻虫嗪及其同系啶虫脒、噻虫胺、吡虫啉作为抑制剂，用阻断elisa测定各抑制物的ic
50
，以噻虫嗪单克隆抗体对噻虫嗪的ic
50
与各抑制物的ic
50
之比的百分数为其交叉反应率(cr％)，取平均值。
61.(4)亲和性测定，采用非竞争elisa法测定亲和常数(ka)。
62.表1试验样品1-19和对照样品1-7的测试结果
63.结合实施例1-4和对比例1-7并结合表1可以看出，将聚乙二醇、芝麻酚、甜菊糖苷和羊脂按一定比例范围混合作为融合剂使用时，不仅能够起到优异的细胞融合效果，还能够降低对细胞的毒性作用，有利于得到效价高、敏感性好、亲和力以及特异性优异的噻虫嗪单克隆抗体，且聚乙二醇、芝麻酚、甜菊糖苷和羊脂的质量混合比为1000：110：55：3时，整体所起到的效果最为优异。而将芝麻酚、甜菊糖苷和羊脂的任意一种和聚乙二醇混合使用，起到的效果均不如三者共同使用复配的效果优异。
64.结合实施例5-8并结合表1可以看出，融合剂的滴加操作选用，先以0.03ml/s滴加融合剂总量的30-40％，再以0.015ml/s滴加融合剂总量的40-50％，最后再以0.03ml/s滴加融合剂剩余部分，能够发挥出优异的细胞融合效果。
65.结合实施例17-19并结合表1可以看出，在加入融合剂反应一段时间后，加入gnk溶液进行终止反应，并控制gnk溶液滴加速度，能够发挥出优异的细胞融合效果。
66.本具体实施例仅仅是对本技术的解释，其并不是对本技术的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本技术的权利要求范围内都受到专利法的保护。