一种低氧促进人脐带间充质干细胞外囊泡生成的实验方法

1.本发明属于生物细胞技术领域，具体涉及到一种低氧促进人脐带间充质干细胞外囊泡生成的实验方法。


背景技术：

2.间充质干细胞(mesenchymal stem cells，mscs)是一群具有自我更新能力和多向分化潜能的成体干细胞，可通过内分泌及旁分泌方式参与各种组织的损伤修复。mscs移植治疗在再生医学领域中已经被证实具有良好的临床应用前景。但是，由于移植后细胞存活时间较短导致长期治疗效果欠佳等问题，mscs移植治疗效率的发展受到一定限制。近年来越来越多的研究提示，mscs生成的细胞外囊泡(extracellular vesicles，evs)在mscs发挥免疫调节、促进组织修复等多种生物学效应中起重要的媒介作用。
3.evs是由细胞分泌或从细胞膜上脱落的具有双层膜结构的囊泡状小体，普遍存在于多种体液及绝大多数细胞的培养基中。evs可携带细胞内部产生的一些活性物质如蛋白质、脂质、mrna、microrna等介导细胞通讯，调控相应的靶细胞或组织。近年来不少研究显示，mscs来源的evs在心肌梗死和急性肾损伤等组织损伤模型中具有减轻损伤，促进组织修复作用，也可进一步减轻败血症引起的肾损伤及促进骨关节炎的软骨修复。然而目前对于evs的获取及生成研究仍处于探索阶段，尚且缺乏一套完整调控mscs和evs生成的方法。


技术实现要素：

4.本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本技术的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。
5.evs的生成受细胞培养环境的改变而发生变化。研究证实低氧处理mscs可使其产生短期缺氧应激，同时改变mscs-evs的内在成分。近年来的研究表明低氧处理的mscs可以增强组织损伤后血管新生和组织再生修复能力。此外，低氧处理mscs生成的evs也可进一步减轻败血症引起的肾损伤及促进骨关节炎的软骨修复。以上研究表明低氧处理对mscs-evs具有一定的调控作用，但是目前低氧对mscs以及生成evs的影响相关机制尚不清楚，调控的结果也并不理想。而mscs对低氧处理产生的适应性应激反应，很有可能是造成evs生物特性改变的关键机制。因此本技术结合细胞转录组测序数据及相关信号通路检测，提出一种低氧促进人脐带间充质干细胞外囊泡生成的实验方法，通过调控低氧浓度完成mscs的evs的生成情况。
6.因此，本发明的目的是，克服现有技术中的不足，提供一种低氧促进人脐带间充质干细胞外囊泡生成的实验方法。
7.为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种低氧促进人脐带间充质干细胞外囊泡生成的实验方法，其特征在于：包括，
8.1)通过低氧处理mscs促进mscs的增殖及其evs生成；
9.2)通过低氧处理mscs激活hif-1α和pi3k/akt信号通路促进细胞增殖；
10.3)通过低氧处理mscs上调p-pras40的磷酸化表达水平促进evs生成及调控。
11.作为本发明所述的低氧促进人脐带间充质干细胞外囊泡生成的实验方法一种优选方案，其中：还包括，
12.低氧处理后mscs内pi3k/akt信号通路激活，pras40进一步磷酸化，促进mtor信号通路依赖性的evs生成。
13.作为本发明所述的低氧促进人脐带间充质干细胞外囊泡生成的实验方法一种优选方案，其中：还包括，
14.通过低氧处理mscs提高evs颗粒浓度、总蛋白浓度及膜性标志蛋白cd9、cd63的表达水平。
15.作为本发明所述的低氧促进人脐带间充质干细胞外囊泡生成的实验方法一种优选方案，其中：所述mscs为人脐带间充质干细胞。
16.作为本发明所述的低氧促进人脐带间充质干细胞外囊泡生成的实验方法一种优选方案，其中：所述步骤1)包括，
17.将mscs先至于常氧培养箱培养，待mscs处于对数生长期时，用0.25％胰蛋白酶消化传代，再将mscs置于低氧培养箱中培养24h。
18.作为本发明所述的低氧促进人脐带间充质干细胞外囊泡生成的实验方法一种优选方案，其中：所述常氧培养箱培养，氧气浓度为21％，培养液为5％helios添加剂与1％青霉素-链霉素混合溶液的mem alpha modified培养基，每2天更换培养液，培养温度为37℃，培养气体浓度为5％co2。
19.作为本发明所述的低氧促进人脐带间充质干细胞外囊泡生成的实验方法一种优选方案，其中：所述低氧培养箱中培养，培养温度为35-39℃，培养气体浓度为2％-20％o2。
20.作为本发明所述的低氧促进人脐带间充质干细胞外囊泡生成的实验方法一种优选方案，其中：所述低氧培养箱中培养，培养气体浓度为5％o2。
21.本发明有益效果：
22.本发明通过低氧处理促进mscs的增殖及其evs生成，同时使细胞表达谱发生明显改变。低氧处理可通过激活hif-1α和pi3k/akt信号通路促进细胞增殖，并上调p-pras40的表达水平参与低氧应激环境下evs生成及调控。本发明通过探究低氧处理对hucmscs及其evs生成的影响，初步阐明了其内在机制，为将来低氧处理获取的evs的潜在应用价值提供一定的理论依据，具有重要的临床意义。
附图说明
23.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：
24.图1为本发明实施例1中5％o2低氧处理组和常氧处理组细胞的形态观察结果示意图。
25.图2为本发明实施例2中5％o2低氧处理组和常氧处理组细胞的cck-8增殖实验结
果示意图。
26.图3为本发明实施例4中5％o2低氧处理组和常氧处理组evs的透射电子显微镜效果示意图。
27.图4为本发明实施例5中5％o2低氧处理组和常氧处理组evs的nta检测e径粒大小-浓度以及总蛋白结果示意图。
28.图5为本发明实施例6中5％o2低氧处理组和常氧处理组细胞的western blot检测evs膜性标志蛋白结果示意图,其中，从左往右分别为条带和蛋白浓度统计的柱状图。
29.图6为本发明实施例7中5％o2低氧处理组和常氧处理组细胞的显著差异表达基因的火山分布图。
30.图7为本发明实施例7中5％o2低氧处理组和常氧处理组细胞的差异表达基因的热图。
31.图8为本发明实施例8中5％o2低氧处理组和常氧处理组细胞的western blot检测hif-1α、p-akt/akt蛋白表达水平示意图。
32.图9为本发明实施例8中5％o2低氧处理组和常氧处理组细胞的western blot检测hif-1α、p-pras40蛋白表达水平示意图。(图中*代表差异有统计学意义，p《0.05)
具体实施方式
33.为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
34.在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
35.其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
36.应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
37.本发明实施例中所使用细胞mscs均由上海交通大学附属上海儿童医学中心泌尿外科课题组进行原代细胞分离、扩增培养以及保存。
38.实施例中hif-1α表示western blot检测细胞内缺氧诱导因子、akt表示丝氨酸/苏氨酸激酶、p-akt表示磷酸化丝氨酸/苏氨酸激酶以及p-pras40表示磷酸化akt底物蛋白。
39.下述实施例中涉及的试剂名称及其购买途径信息见表1。
40.表1
41.[0042][0043]
实施例1
[0044]
细胞常氧培养和低氧处理mscs：
[0045]
用含有5％helios添加剂、1％双抗(青霉素-链霉素混合液，penicillin-streptomycin solution)的mem alpha modified培养基，在37℃，5％co2细胞常氧培养箱培养mscs，每2天更换培养液，待细胞融合度90％时，用0.25％胰蛋白酶消化传代，得到常氧处理组细胞。
[0046]
同样用含有5％helios添加剂、1％双抗的mem alpha modified培养基，在37℃，5％co2细胞常氧培养箱培养mscs，每2天更换培养液，待细胞融合度70％时，置于37℃，5％o2的低氧培养箱中培养24h，得到低氧处理组mscs。将低氧和常氧条件下的mscs培养24h后，置于显微镜下观察两组细胞的形态。细胞形态观察结果如图1所示，可发现低氧处理组细胞和常氧组细胞形态均未发生明显变化，mscs形态均呈梭形，放射状分布，低氧组细胞融合度略高于常氧组。
[0047]
实施例2
[0048]
常氧组和低氧组mscs活力检测；
[0049]
将实施例1中处于对数生长期的常氧组和低氧组mscs制备成细胞悬液，接种到96孔板，细胞数量在每孔4
×
103个左右。分别置于常氧培养箱和低氧培养箱中进行孵育，常氧处理和低氧处理组的孵育条件与实施例1相同，24h后根据cck-8试剂盒操作说明书进行细胞增殖速率检测，使用多功能酶标仪在450nm测量吸光度(a)，并计算细胞增殖速率，实验结果如图2所示。
[0050]
低氧处理mscs 24小时后，cck-8结果显示低氧处理组吸光度值(2.151
±
0.120)高于常氧对照组吸光度值(1.929
±
0.15)，差异有统计学意义(t＝2.659，p《0.05)。由此可见，低氧处理可促进mscs增殖速率。
[0051]
实施例3
[0052]
evs分离与提取：
[0053]
用无helios添加剂的培养基过夜培养细胞，收集低氧处理组和常氧对照组细胞的上清液，2000
×
g 4℃离心20min，去除上清液中的细胞碎片；转入超滤离心管内，100000
×
g 4℃超速离心1h，冷pbs重悬浓缩液进行清洗，再次100000
×
g 4℃超速离心1h，收集低氧处理组和常氧对照组离心管内的浓缩液，并分别重复实验三次分别得到低氧处理组evs-1～3和常氧对照组evs-4～6。
[0054]
实施例4
[0055]
evs的电镜检测：
[0056]
将实施例3收集的低氧处理组evs和常氧对照组evs分别用2.5％的戊二醛固定2小时。清洗后进行超高速离心，用pbs 100ul重悬。取20μlevs悬液置于铜网上，用无菌蒸馏水冲洗，然后从滤纸吸收多余液体，然后滴3％磷钨酸溶液30μl室温负染1min，晾干后在透射电子显微镜下观察并拍摄，低氧evs与常氧evs的拍摄结果如图3所示，结果显示两组ev均呈圆形或椭圆形囊泡状，结构完整，无明显区别。
[0057]
实施例5
[0058]
evs的nta检测：
[0059]
将实施例3中超速离心后的evs沉淀加入pbs稀释混匀，ev:pbs的体积比为1：25，取1ml稀释后的evs悬液加入比色皿中，使用nta仪进行检测，低氧组evs与常氧组evs的检测结果如图4所示。低氧处理组和常氧对照组的mscs产生的evs直径均在30-500nm之间。检测常氧evs与低氧evs的颗粒浓度结果显示低氧处理组evs内部颗粒浓度((13.714
±
1.20)*109个/ml))高于常氧对照组((1.271
±
0.57)*109g个/ml)),差异有统计学意义(t＝18.31，p《0.05)。此外，通过对两组分泌的evs进行bca蛋白定量分析，结果显示低氧处理组分泌的evs总蛋白浓度(2.804
±
0.31)明显高于常氧对照组(0.291
±
0.03),差异有统计学意义(t＝13.89，p《0.05)。
[0060]
实施例6
[0061]
western blot检测evs膜标志蛋白：
[0062]
将实施例3中收集的evs常规ripa裂解液裂解后用bca蛋白测定试剂盒检测总蛋白浓度。变性蛋白样品经10％sds-page分离后转pvdf膜。用1
×
pbst洗涤后，5％bsa室温封闭1h。用1
×
pbst洗涤后，分别加入一抗(cd9、cd63及cd81抗体)孵育4℃过夜，用1
×
pbst洗涤3次后，hrp标记的二抗室温孵育1h。ecl显影曝光后化学发光仪检测并分析。各重复三次，分别得到低氧组evs-1～3和常氧组evs-4～6，结果数据如图5及表2所示。
[0063]
表2
[0064] evs-1evs-2evs-3evs-4evs-5evs-6cd920100087226126418504091680534112cd633822233569401243701828697cd8132395577923358943757152492117827
[0065]
由实施例6及表2可知，对低氧处理组和常氧对照组的hucmscs生成的evs蛋白标志物进行wb检测，结果显示，在两组细胞的培养上清提取的evs中均可检测到evs膜性标志蛋白cd9、cd63和cd81表达，低氧处理组cd9和cd63表达水平(4.092
±
1.71，1162.225
±
573.9)
均高于常氧对照组(1
±
0)，差异有统计学意义(t＝3.005，3.505，p《0.05)，而cd81表达水平(3.882
±
2.34)无显著差异(t＝1.990，p》0.05)。
[0066]
实施例7
[0067]
细胞高通量转录组测序及分析：
[0068]
将低氧处理组和常氧对照组的mscs经trizol法提取总rna后交由华大基因生物技术有限公司进行mrna文库构建及高通量测序，检测两组细胞的mrna的表达谱差异。
[0069]
转录组基因差异表达和聚类分析对低氧处理组和常氧对照组的mscs转录组进行表达谱差异分析，以校正的显著性p值(q value≤0.05)和差异倍数差异基因(fc≥2或fc≤-2)作为显著差异表达的判断标准。如图6、图7所示，分析结果筛选出显著差异表达基因共1429个，其中374个基因表达显著下调，1055个基因表达显著上调。
[0070]
分别对差异基因进行go功能注释分析和kegg通路富集分析。分析结果显示在生物过程(bp)分析中差异基因主要富集于细胞因子介导的信号通路、细胞因子生成的正向调控等；细胞组分(cc)分析显示差异基因主要富集于细胞基础成分、细胞质膜基础成分等；分子功能(mf)分析显示差异基因主要富集于受体配体活动、信号受体激活活动等。kegg通路富集分析结果显示差异基因主要富集于细胞因子与细胞因子受体相互作用、胆固醇合成等信号通路。同时也发现差异基因在经典信号通路tnf信号通路、nf-κb信号通路以及il-17等炎症相关信号通路上均有较高富集。
[0071]
实施例8
[0072]
western blot检测结果：
[0073]
用含有10％pmsf的ripa裂解液裂解细胞后，用bca法测定总蛋白浓度。变性蛋白样品，经10％sds-page胶电泳分离后，转pvdf膜。用1
×
pbst洗涤，5％bsa室温封闭1h。用1
×
pbst洗涤后，加入一抗hif-1α、p-akt、akt、p-pras40、β-actin抗体，孵育4℃过夜，用1
×
pbst洗涤后，hrp标记的二抗室温孵育1h。ecl显影曝光后化学发光仪检测并分析。
[0074]
如图8所示，将hucmscs低氧处理24h后，hucmscs内hif-1α、akt、p-akt、以及p-akt/akt的表达水平(2.593
±
0.56,1.395
±
0.04,2.586
±
0.13，1.953
±
0.10)均高于常氧对照组(0.230
±
0.13，0.137
±
0.09，0.391
±
0.06，0.332
±
0.17)。此外，hif-1α及p-pras40的表达水平(3.143
±
0.4，2.131
±
0.57)也高于常氧对照组(0.170
±
0.13，0.227
±
0.09)，且二者表达水平呈一定的相关性。
[0075]
本技术通过对mscs进行低氧处理，检测其对细胞增殖及其evs生成的影响，同时对细胞转录组及相关信号通路进行检测，进一步阐述其内在调控机制。上述实验发现低氧处理可促进mscs增殖速率及其evs生成，同时造成细胞转录组表达谱的改变。此外，进一步对相关信号通路进行检测，结果证明低氧处理可通过hif-1α和pi3k/akt信号通路促进细胞增殖；同时通过上调pras40磷酸化水平促进evs生成。
[0076]
低氧处理可促进mscs增殖速率。现有研究表明低氧可促进多种来源的mscs增殖。上述实验结果证实低氧处理mscs后，细胞形态未发生明显变化，但细胞增殖能力增强。低氧处理可引起mscs发生短暂的氧化应激，诱导hif-1α的表达。此外，上述结果显示低氧处理后mscs胞内的hif-1α表达水平明显增高，增殖相关的信号通路pi3k/akt信号通路在低氧条件下被激活，低氧处理后细胞内p-akt/akt的蛋白表达水平也相应增高。以上结果表明，低氧处理mscs可通过hif-1α和pi3k/akt信号通路促进细胞增殖。
[0077]
evs的生成与细胞所处的微环境有密切的关系。低氧处理mscs-evs的形态无明显变化，但是evs内部颗粒及总蛋白浓度明显高于常氧对照组。检测低氧应激下hif-1α和p-pras40的表达水平，实验结果显示低氧处理后hif-1α和p-pras40蛋白表达均增加且呈一定的相关性。pras40大小为40kda的是富含脯氨酸的akt磷酸化底物蛋白，主要通过结合mtor1的raptor蛋白亚基，抑制mtor信号通路激活，低氧处理后mscs内pi3k/akt信号通路激活，pras40作为akt磷酸化底物，可被进一步磷酸化，从而促进mtor信号通路依赖性的evs生成。综上，上述实验结果进一步证实了mscs内pras40磷酸化可促进低氧应激引起的evs的生成。
[0078]
由于目前低氧处理后引起mscs-evs生物特性改变的具体机制仍不明确。因此，本技术进一步对mscs进行转录组高通量测序分析。数据结果显示低氧处理使细胞表达谱明显发生改变，且差异基因主要富集于细胞因子介导的信号相关通路如tnf、nf-κb等炎症相关信号通路。
[0079]
综上所述，低氧处理促进hucmscs的增殖及其evs生成，同时使细胞表达谱发生明显改变。低氧处理可通过激活hif-1α和pi3k/akt信号通路促进细胞增殖，并上调p-pras40的表达水平参与低氧应激环境下evs生成及调控。本技术通过探究低氧处理对mscs及其evs生成的影响，初步阐明了其内在机制，为将来低氧处理获取的evs的潜在应用价值提供一定的理论依据，具有重要的应用价值。