一种酵母展示载体及酵母展示双特异Fab的方法与流程

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种展示共用轻链的双特异fab的酵母展示载体及方法。

背景技术：

1、酵母表面展示技术是继噬菌体展示技术发明之后发展起来的蛋白表面展示技术，可用于构建和筛选抗体文库。传统的噬菌体展示技术的主要原理是把目的蛋白质与噬菌体外壳蛋白质融合表达，然后通过固相或液相方法进行抗原筛选，但是其有以下缺点，一是其利用的是原核表达系统，不利于复杂蛋白的表达；二是其筛选抗体的过程近似于黑箱操作。wittrup于1997首次发表了酵母展示的文章，酵母展示技术是利用真核表达系统，具有与哺乳动物细胞类似的蛋白质修饰和折叠机制，且通过与流式细胞分选技术结合，研究人员可实时监控筛选过程，特别是针对抗体的亲和力或者阻断活性等性质进行精细的筛选。

2、通常来说，具有抗体功能活性结构的抗体，除了完整的全抗之外，还包括scfv，scfab，fab片段等。scfv是具有抗体活性的最小功能单位，其结构简单，便于改造和建库。单链fab(scfab)的抗体重链vh-ch1和vl-cl通过一个柔性氨基酸多肽连接子连接并实现scfab的重链vh-ch1和轻链匹配，fab是由重链vh-ch1结构域与轻链通过二硫键匹配组成的抗原结合片段。与scfv相比，scfab和fab的结构和亲和力都更接近于igg型式的全抗。而fab的结构则更加复杂，这导致fab表达系统的改造和建库都相对复杂和麻烦，其中涉及重链和轻链之间的匹配和二硫键形成。目前利用aga1-aga2酵母细胞表面展示系统产生fab片段的方法，主要为在一个表达质粒上利用两个完整的启动子和读码框分别表达fab的重链区和轻链，再将质粒转化到酵母细胞中诱导表达，将完整的fab展示到酵母表面。由于酵母本身对于蛋白质二硫键形成和修饰等能力较弱，因此经常产生稳定性差或低活性的fab或其片段。

3、目前双特异抗体的开发被受关注，而共用轻链的双特异抗体是其中的一个有潜力的发展方向。它的优势之一是，借助于共用轻链，其能在结构上尽量维持igg型式的结构，方便下游的工艺开发。

技术实现思路

1、本发明涉及一个可以用于酵母展示共用轻链的双特异抗体的质粒，其能方便这类双特异抗体的改造优化。共用轻链型式的双特异抗体fab是一种常用的双特异抗体型式，相比于scfv等型式，其结构更类似于天然的igg抗体。由于两个fab是共用一个vl，所以在针对vl的做任何优化或突变时，会导致两个fab的性质都发生改变。酵母展示质粒能够使得共用轻链的两种fab展示在同一个酵母上，因此基于vl突变而导致的两种fab的变化能够在同一个酵母上被检测出来。比如，该质粒可用于基于vl突变的亲和力成熟，筛选能同步提高两种fab亲和力的vl突变。

2、在一个方面，本发明提供了一种用于酵母表面展示共用轻链的双特异fab的重组质粒，其特征在于：包含编码共用轻链vl-cl的第一多核苷酸，编码靶向第一抗原的vh1-ch1a的第二多核苷酸和编码靶向第二抗原的vh2-ch1b的第三多核苷酸，所述第一多核苷酸的3’末端连接有酵母锚定蛋白基因。在一些实施方案中，所述酵母锚定蛋白为aga2p。

3、在一些实施方案中，所述酵母展示载体包含pyd1质粒骨架、编码共用轻链vl-cl的第一多核苷酸，编码靶向第一抗原的vh1-ch1a的第二多核苷酸和编码靶向第二抗原vh2-ch1b基因的第三多核苷酸，所述第一多核苷酸的3’末端连接有酵母锚定蛋白基因。在一些实施方案中，所述酵母锚定蛋白为aga2p。在一些实施方案中，所述酵母锚定蛋白为α-凝集素、flolp蛋白、cwp1p蛋白、cwp2p蛋白、或tip1p等。

4、在一些实施方案中，所述第一多核苷酸、第二多核苷酸或第三多核苷酸之间包含启动子或自剪切多肽基因。在一些实施方案中，所述第二多核苷酸和第三多核苷酸之间、第三多核苷酸和第一多核苷酸之间包含自剪切多肽基因。在一些实施方案中，所述自剪切多肽为p2a。

5、在一些实施方案中，所述第一多核苷酸，第二多核苷酸和/或第三多核苷酸的3’末端连接有蛋白检测标签基因。在一些实施方案中，所述蛋白检测标签选自his标签、myc标签、ha标签、v5标签、arg标签、avi标签、flag标签、3xflag标签、strep标签、nano标签、sbp标签、s标签、钙调蛋白结合肽、纤维素结合结构域、几丁质结合结构域、gst标签和mbp标签。在一些实施方案中，所述蛋白检测标签选自myc标签，v5标签和ha标签。

6、在一些实施方案中，所述酵母展示载体包含编码任选的信号肽-vh1-ch1a-任选的连接子和/或标签-p2a-任选的信号肽-vh2-ch1b-任选的连接子和/或标签-p2a-任选的信号肽-vl-cl-3gs-酵母锚定蛋白-任选的标签的多核苷酸。

7、在一些实施方案中，所述酵母展示载体包含编码sp1-vh1-ch1a-gs-myc-p2a-sp2-vh2-ch1b-gs-ha-p2a-sp3-vl-cl-3gs-aga2p-v5的多核苷酸。

8、在一些实施方案中，所述酵母展示载体为pyd-fab-bicl(载体图谱如图1所示)。

9、在另一方面，本发明提供一种宿主细胞，其包含上述酵母展示载体。在一些实施方案中，所述宿主细胞为酵母。在一些实施方案中，所述酵母细胞选自：酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)、毕赤酵母(pichia pastoris)、巴氏酵母(saccharomycespastorianus)、贝酵母(saccharomyces bayanus)、乳酸克鲁维酵母(kluyveromyceslactis)、马克斯克鲁维酵母(kluyveromyces marxianus)、粟酒裂殖酵母(schizosaccharomyces pombe)、白色假丝酵母(candida albicans)、树干毕赤酵母(pichia stipitis)、解脂耶氏酵母(yarrowia lipolytica)、多形汉逊酵母(hansenulapolymorpha)、红法夫酵母(phaffia rhodozyma)、产朊假丝酵母(candida utilis)、耐盐酵母(arxula adeninivorans)、汉逊德巴利酵母(debaryomyces hansenii)、多形德巴利酵母(debaryomyces polymorphus)、、西方许旺酵母(schwanniomyces occidentalis)或其衍生物。在一些实施方案中，所述酵母为酿酒酵母。在一些实施方案中，所述酵母为表达a-凝集素的aga1p亚基的酿酒酵母。在一些实施方案中，所述酵母为酿酒酵母eby100。

10、在另一方面，本发明提供一种酵母展示双特异fab的方法，包括将上述酵母展示载体转入酵母细胞，获得含有酵母展示载体的酵母，然后进行培养和诱导。在一些实施方案中，所述酵母为表达a-凝集素的aga1p亚基的酿酒酵母。在一些实施方案中，所述酵母为酿酒酵母eby100。

11、在一些实施方案中，所述第一抗原和第二抗原可以为不同的靶点或同一靶点的不同表位；例如，所述第一抗原和/或第二抗原独立选自tigit、4-1bb、ox40、pd-1、pd-l1、angpt2、aplp2、baff、bcma、ccr2、cd123、cd16、cd19、cd20、cd22、cd28、cd3、cd30、cd40、cd47、cd73、cdh17、cmet、csf1r、ctla-4、claudin18.2、dll4、egfr、fgfr1、gitr、her2、hgf、il-13、il-17、il-17a、il-1α、il-1β、il-4、il-4ra、il-5、il-6、il-6r、klb、lag-3、msln、psma、tfr、tgfβ、tim-3、trailr2、vegf、vista、icos，病毒抗原如新冠病毒抗原。

12、在一些实施方案中，所述第一抗原和第二抗原独立选自于：细胞因子包括il-1α(白介素il-1α)、il-1β(白介素il-1β)、il-13(白介素il-13)、tnf-α(肿瘤坏死因子α)、tnf-β(肿瘤坏死因子β)、tim-3(t cell immunoglobin domain and mucin domain-3)、lag3(淋巴细胞活化基因-3分子)、ctla-4(细胞毒性t淋巴细胞相关抗原)、tigit(t cell ig anditim domain)、cd27(分化簇27)、ox40(肿瘤坏死因子受体超家族成员4)、icos(induciblecostimulator)、btla(b和t淋巴细胞弱化因子)、pd-1(程序性死亡受体1)和cd137(分化簇137)、pd-l1(程序性死亡配体1)、半乳糖凝集素9、cd48(分化簇48)、cd40(分化簇40)、cd70(分化簇70)、b7h3(cd276，分化簇276)、hvem(herpesvirus entry mediator)、和cc趋化因子亚组中的ccl1、ccl3、ccl5、ccl7、ccl8等。

13、在一些实施方案中，所述第一抗原和第二抗原选自于：tigit和ctla-4，ox40和ctla-4，tigit和pd-1，pd-l1和cd47，tigit和ox40，vegf和cmet，vegf和dll4，vegf和hgf，vegf和angpt2，tfr和cd20，pd-l1和4-1bb，psma和cd28，pd-1和pd-l1，her2和4-1bb，pd-1和tim-3，pd-1和cd47，gitr和ctla-4，cd40和4-1bb，ox40和4-1bb，lag-3和tim-3，egfr和ctla-4，cd19和cd22，cd16和cd30，cd3和cd123，bcma和cd47，msln和cd47，egfr和cmet，cd73和tgfβ，egfr和tgfβ，ccr2和csf1r，cd20和cd3，cd19和cd47，cdh17和trailr2，aplp2和her2，il-1α和il-1β，il-17和il-13，il-4和il-13，baff和il-17a，cd3和pd-1，il-4ra和il-5，vegf和il-6，fgfr1和klb。

14、在一些实施方案中，所述靶向的第一抗原为pd-l1，第二抗原为tigit。在一些实施方案中，所述共用轻链vl-cl氨基酸序列如seq id no:3所示，所述靶向的第一抗原的vh1-ch1a的氨基酸序列如seq id no:1所示，所述靶向第二抗原的vh2-ch1b的氨基酸序列如seqid no:2所示。

15、在一些实施方案中，所述第一多核苷酸、第二多核苷酸和第三多核苷酸任选的包含信号肽基因。在一个实施方案中，所述信号肽的氨基酸序列如seq id no:7所示。

16、在一些实施方案中，所述酵母展示载体的骨架质粒为其他适于在酵母中表达抗体或抗原结合片段的载体，例如pesc-leu、pesc-leu2d、p4x3、p4x4、p4x5、p4x6，pctcon2，pyd1。在一些实施方案中，所述酵母展示载体的骨架质粒为pyd1。

17、可以使用本领域已知的任何方法构建本发明的酵母展示载体。例如，合成编码目的蛋白(如

18、sp1-vh1-ch1a-myc-p2a1-sp2-vh2-ch1b-ha-p2a2-sp3-vl-cl-3gs-aga2p-v5)的多核苷酸并在两端设计合适的酶切位点，通过酶切连接将合成的目的核酸片段连接到载体如pyd1载体。在一些实施方案中，可通过在vl两端设计酶切位点bamhi和bsiwi，和/或在vh1两端设计酶切位点ncoi和afei，和/或在vh1两端设计酶切位点saci和sali在pyd-fab-bicl上插入任意抗体的vl或vh。

19、不限定所述第一多核苷酸、第二多核苷酸和第三多核苷酸在酵母展示载体中的相对位置，只要所述第一多核苷酸、第二多核苷酸和第三多核苷酸在导入酵母细胞后均能表达即可。可使用本领域已知的任何方法将酵母展示载体转化到酵母细胞中。

20、在一些实施方案中，所述酵母展示载体为pyd-fab-bicl(载体图谱如图1所示)。

21、在一些实施方案中，在构建共用轻链的双特异抗体库时，通过使设计的双特异抗体库的多核苷酸文库或基因文库具有合适的限制性酶切位点，以将双特异抗体库的多核苷酸文库或基因文库与本发明的酵母展示载体连接。在一些实施方案中，用编码目的共用轻链的双特异抗体的第一多核苷酸、第二多核苷酸和/或第三多核苷酸替换本文所述酵母展示载体中的对应的第一多核苷酸、第二多核苷酸和/或第三多核苷酸以构成表达目的抗体的酵母展示载体。在一些实施方案中，用编码目的共用轻链的双特异抗体可变区的第一多核苷酸、第二多核苷酸和/或第三多核苷酸替换本文所述酵母展示载体中的对应的编码双特异抗体可变区的第一多核苷酸、第二多核苷酸和/或第三多核苷酸以构成表达目的抗体的酵母展示载体。这种用于展示共用轻链的双特异fab的酵母展示载体可应用于基于vl突变的亲和力成熟，筛选能同时提高两种fab亲和力的vl突变。

22、除非另外限定，否则本文中所用的全部技术与科学术语具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。本文所提及的全部出版物、专利申请、专利和其他参考文献通过引用的方式完整地并入作为参考。此外，本文中所述的材料、方法和例子仅是说明性的并且非意在是限制性的。