一种快速检测下呼吸道感染致病菌的试剂盒及其检测方法与流程

本发明属于下呼吸道感染检测领域，具体涉及到检测致病菌的检测领域。

背景技术：

1、呼吸道感染通常由病毒、细菌、非典型病原体等引起，除了甲型流感和乙型流感之外，其他多种病原体也能造成呼吸道感染，比如鼻病毒、肠病毒、冠状病毒、腺病毒、副流感病毒、偏肺病毒、呼吸道合胞病毒、肺孢子菌、金黄色葡萄球菌等。呼吸道感染是临床的常见病，不同感染场所(如社区感染、医院感染)、不同季节性、不同年龄、不同基础疾病(如器官移植、糖尿病、艾滋病)患者感染的病原体各不相同，如社区获得性呼吸系统感染的主要病原体为病毒、支原体、衣原体、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌等，而医院获得性呼吸道感染的主要病原体为细菌，尤其是耐药性细菌，如鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌等。一种病原体可引起多种临床表现，同一临床表现又可由多种病原体引起。由于这些非典型性致病原引起的临床症状复杂不明显，患者往往被忽视或误诊，临床上也很难针对病原体进行治疗，使某些患者病情加重或造成抗菌药滥用。因此，呼吸道病原体的快速检测，对临床早期诊断有重要意义。

2、呼吸道病原体检测方法有病原体分离培养，炎性标志物检测、免疫标记检测，核酸检测等。

3、病原体分离培养，是指用人工的方法提供生长繁殖所需的营养和最适条件，目前，大多数临床细菌实验室多借助自动化细菌鉴定与药敏试验系统，可简便、快速、准确地鉴定各种分离培养的细菌，并同时完成抗菌药物的敏感性试验。培养法存在较多缺点已逐渐淘汰：病原体分离培养主要用于存在多种细菌时需要将其中一种细菌分离的情况，多用于痰液、粪便、血液、体液等，由于细菌生长和繁殖的时间比较长，所以该检验方法需要一定的时间，且不可批量处理。另外不能检出厌氧菌及病毒，对检测的范围有很大的局限性。

4、炎性标志物检测，呼吸道感染后，机体应激反应时会释放一系列炎性因子，如肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor-a，tnf-a)、白细胞介素(interleukin，il)-6、il-10、cin press反应蛋白(c-reactionprotein，crp)、血清淀粉样蛋白(serum amyloid a，saa)和降钙素原(procaleitonin，pct)等，这些炎性因子与随着临床进展变化而变化。临床实验室常用的炎性标志物有crp、saa和pct等，检测炎性标志物有利于及时鉴别感染的类型。如crp和saa，一般在呼吸道感染后，crp、saa均升高，如果crp升高较为明显，伴或不伴saa升高，则表明为呼吸道细菌感染，如果crp、saa均升高，但saa升高幅度更明显，则表明为呼吸道病毒感染。

5、免疫标记检测，用免疫荧光或免疫酶等技术检测标本中的特异性病毒抗原。对于呼吸道病原体感染病程超过7～10d以上的患者，可以进行相关病原体的抗体检测。如采用间接荧光免疫法检测血清中的病原体抗体免疫球蛋白m，包括嗜肺军团菌、肺炎支原体、q热立克次体、肺炎衣原体、腺病毒、呼吸道合胞病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒和副流感病毒1型/2型/3型等。有些病原体抗体出现比较早，如新型冠状病毒特异性抗体igm可在起病后3～5d出现，可选择化学发光或胶体金等方法检测。但其缺点在于，免疫标记检测对病原体感染后机体产生的抗体进行检测。由于病原体感染后，抗体产生较晚(窗口期一般为2周至3月)，因此不利于疾病的早期诊断。且存在灵敏度低、特异性差的问题。

6、针对呼吸道病原体的检测，核酸检测具有灵敏、准确的优点。常见的检测方法有荧光定量pcr(qpcr)、基于宏基因组新一代测序技术(metagenomics next generationsequencing,mngs)等。qpcr方法可以对已知的单个类型的病原体进行检测，也能对多个类型进行检测，目前市场上已有多种成熟的检测试剂盒满足不同检测要求。mngs方法不依赖于传统的微生物培养，直接对临床样本中的核酸进行高通量测序，能够快速、准确地检测临床样本中的已知及未知的病原微生物，包括但不限于病毒、真菌、细菌、寄生虫等，对于疑难病症的诊断有着非常重要的意义。但其缺点在于，核酸检测多数是以rt-pcr方法进行，一次检测的病原体较少。荷兰pathofinder基于多重连接的方法，一次可检测22中呼吸道病原体，但是操作复杂，样品转录后，取转录产物进行pcr扩增，取pcr产物进行下一步杂交反应，取杂交产物进行pcr扩增。期间多次开盖，容易污染，整个扩增检测时间大约是2.5-4小时。mngs方法虽然可以一次性获得大多数病原体的信息，但操作复杂、对检测人员的要求非常高。且周期较长，报告一般需要5～7天，一方面不利于病人的快速用药，另一方面检测费用较高，限制了临床上的应用。具体的检测流程如图1所示。

技术实现思路

1、发明目的：提供一种操作简单、方便快捷、特异性灵敏度高、假阳性低的呼吸道常见病原体检测试剂盒。

2、技术方案：一种快速检测下呼吸道感染致病菌的试剂盒，包含转录及扩增引物、buffer mix、depc水、酶mix、外源质粒及阳性对照模板，其特征在于，所述的转录及扩增引物包括16种rna病毒、4种dna病毒及24种呼吸道致病菌共44种呼吸道病原体的扩增序列，其引物序列见序列表3。

3、进一步优选，所述的buffer mix包括ph＝8.8的tris·cl，mkcl，m(nh4)2so4，mgcl2，dntps，dtt，bsa，甜菜碱，tween 20。

4、进一步优选，酶mix为taq、klenow fragment、vent dna聚合酶、t7 dna聚合酶、bstdna聚合酶大片段、t4 dna聚合酶、dna聚合酶i，klenow大片段、e.coli dna聚合酶i、therminator dna聚合酶、sulfolobus dna聚合酶iv、phi29 dna聚合酶、bst2.0 warmstartdna聚合酶、bst 2.0dna聚合酶、bst dna聚合酶，全长、bst dna聚合酶，deep ventr exo–dna聚合酶、deep ventr dna聚合酶、ventr exo–dna聚合酶、ventr dna聚合酶、epimark热启动taq dna聚合酶、longamp热启动taq dna聚合酶、longamp taq dna聚合酶、热启动taqdna聚合酶、taq dna聚合酶大片段、onetaq热启动dna聚合酶、onetaq dna聚合酶、phusion热启动flex dna聚合酶、phusion超保真dna聚合酶、q5热启动超保真dna聚合酶、q5超保真dna聚合酶中一种或几种酶的组合。

5、进一步优选，所述外源质粒为常见质粒或自制带有特殊序列的质粒中一种或几种的组合。

6、进一步优选，所述的外源质粒为pcdna3.1、puc57、pmd18t、pbr322中的一种或几种质粒的组合。

7、一种快速检测下呼吸道感染致病菌的试剂盒的检测方法：

8、①采集样本并提取核酸：采集呼吸道感染者的鼻咽拭子或痰液，提取核酸，

9、②配制反应mix，

10、③反应同时设置阴性对照：模板为无核酸水；阳性对照：阳性对照引物及模板，

11、④根据说明书设置反应条件，

12、⑤结果鉴定：使用荧光仪对每份产物进行鉴定，根据样本荧光值、阴性对照荧光值及阳性对照荧光值判断呼吸道病原体的种类，获得检测结果。

13、有益效果：本试剂盒可对16种rna病毒、4种dna病毒及24种呼吸道致病菌共44种呼吸道病原体进行检测：

14、1、本试剂盒采用特殊的引物设计方案，提高检测特异性，减少假阳性的问题。

15、2、本试剂盒采用优化的扩增酶体系，提高检测灵敏度，可达5个拷贝。

16、3、检测快速，核酸分离后半小时左右即可获得结果。qpcr方法一般需要1.5～2h左右时间。

17、4、对仪器要求低，通量高。qpcr方法中扩增仪全程占用，一般通量为96孔/2h，考虑到每个孔只能检测4-6个菌种，实际通量为20个左右样本/2h。本试剂盒只需常规pcr仪即可完成扩增，使用荧光检测仪批量检测即可，通量大大增加。