无梗五加叶中的三萜类化合物及其分离、鉴定和应用

1.本发明涉及无梗五加叶中的三萜类化合物及其分离、鉴定和应用。


背景技术：

2.无梗五加(学名：eleutherococcussessiliflorus(rupr.&maxim.)s.y.hu)是五加科五加属植物，灌木或小乔木，高2-5米；树皮暗灰色或灰黑色，有纵裂纹和粒状裂纹；枝灰色；刺粗壮。叶有小叶3-5；叶柄长3-12厘米，无刺或有小刺。头状花序紧密，球形，直径2-3.5厘米，有花多数，5-6个稀多至10个组成顶生圆锥花序或复伞形花序。果实倒卵状椭圆球形，黑色，长1-1.5厘米，稍有棱，宿存花柱长达3毫米。无梗五加根皮在中国东北称“五加皮”，有驱风化湿，健胃利尿之效，也可制“五加皮”药酒。
3.无梗五加的叶含强心甙，挥发油和皂甙。吴高松、王知斌、杨春娟、刘华、王秋红、杨炳友等采用hplc-elsd法同时测定无梗五加果中3种3,4-裂环羽扇豆烷型三萜化合物(2-α-hydroxychiisanogenin(1)、chiisanogenin(2)和(1r,llα)1,4-epoxy-11-hydroxy-3,4-secolupane-20(30)-ene-3,28-dioic acid(3))的含量(《中医药信息》2017年34卷1期36-39页)，然而目前没有对无梗五加叶中所含三萜类化合物进行系统分离、鉴定及其应用研究的相关报道。


技术实现要素：

4.本发明提供一种从无梗五加叶中提取分离三萜类化合物的方法及对得到的三萜类化合物的药学活性研究。
5.本发明所提供的从无梗五加叶中提取分离三萜类化合物的方法，按照图1所示流程图进行，包括如下步骤：
6.1)将无梗五加叶用乙醇提取，得到乙醇粗提物；
7.2)将所得乙醇粗提物加在hp-20型大孔吸附树脂上，依次用水、40％乙醇、95％乙醇梯度洗脱，收集95％乙醇洗脱组分；
8.3)将所得95％乙醇洗脱组分加在正相硅胶上，用ch2cl
2-ch3oh系统洗脱，洗脱液经薄层和hplc检识分别得到fr.a-c、fr.d、fr.e、fr.f、fr.g、fr.h和fr.i；
9.4)fr.d经过ods柱色谱分离得到fr.d1-d45，其中fr.d15析出化合物11；fr.d18经制备型hplc(ch3oh/h2o＝66％,5ml/min)分离得到化合物12；fr.d22析出化合物7；fr.d24经制备型hplc(ch3oh/h2o＝74％,5ml/min)分离得到化合物14；fr.d27经制备型hplc(ch3oh/h2o＝75％,5ml/min)分离得到化合物1；
10.5)fr.e经过ods柱色谱分离得到fr.e1-e46，其中fr.e38析出化合物6；
11.6)fr.f经过ods柱色谱分离得到fr.f1-f43，其中fr.f40析出化合物17；
12.7)fr.g经过ods柱色谱分离得到fr.g1-g46，其中fr.g32析出化合物16；
13.8)fr.h经过ods柱色谱分离得到fr.h1-h42，其中fr.h12析出化合物13；fr.h16经制备型hplc(ch3oh/h2o＝68％,5ml/min)分离得到化合物5、4和3；fr.h19经制备型hplc
(ch3oh/h2o＝73％,5ml/min)分离得到化合物19、2和8；fr.h29经制备型hplc(ch3oh/h2o＝79％,5ml/min)分离得到化合物15和18；fr.h32经制备型hplc(ch3oh/h2o＝79％,5ml/min)分离得到化合物9和10；
14.上述步骤1)中，所述无梗五加叶为无梗五加干燥叶；
15.所述提取包括加入70％-95％浓度乙醇水溶液，回流提取1-2小时，乙醇水溶液的体积与无梗五加叶的质量比为8：1-10：1。
16.优选的，乙醇水溶液的浓度可为70％；本发明中，所述乙醇的浓度均指体积浓度。
17.优选的，乙醇水溶液的体积与无梗五加叶的质量的比可为10：1。
18.所述回流提取可进行多次，具体可为3次；
19.本发明中，但凡涉及到质量与体积的比时，均指单位质量的量与单位体积的量的比，质量的单位为g时，体积的单位为ml；质量的单位为kg时，体积的单位为l；以此类推。
20.步骤2)中，所述hp-20型大孔吸附树脂的体积可为10-20倍无梗五加叶粗提物质量，优选为10倍；
21.洗脱用水量可为2-4bv，优选为2bv；
22.40％乙醇用量可为2-4bv，优选为2bv；
23.95％乙醇用量可为2-4bv，优选为4bv；
24.所述洗脱的流速可为0.5-1bv/h，优选为1bv/h；
25.步骤3)中，所述正相硅胶的体积可为4-7倍95％乙醇洗脱组分质量，优选为7倍；
26.所述ch2cl
2-ch3oh系统中，ch2cl2与ch3oh的体积比为1：0-0：1；
27.所述薄层为正相薄层板，展开剂为ch2cl
2-ch3oh系统，其中ch3oh与ch2cl2体积比为1：15；
28.所述hplc的流动相为ch3oh-h2o系统，梯度洗脱条件:0-30min流动相ch3oh与h2o体积比为5：95-100：0；
29.步骤4)中，所述ods柱色谱的流动相为ch3oh-h2o系统，ch3oh与h2o体积比为1：9-10：0；
30.步骤5)中，所述ods柱色谱的流动相为ch3oh-h2o系统，ch3oh与h2o体积比为1：9-10：0；
31.步骤6)中，所述ods柱色谱的流动相为ch3oh-h2o系统，ch3oh与h2o体积比为1：9-10：0；
32.步骤7)中，所述ods柱色谱的流动相为ch3oh-h2o系统，ch3oh与h2o体积比为1：9-10：0；
33.步骤8)中，所述ods柱色谱的流动相为ch3oh-h2o系统，ch3oh与h2o体积比为1：9-10：0；
34.化合物1、2、3、4、5、6、7、8、9和10也属于本发明的保护范围。
35.化合物1-19在制备具有如下功能中至少一项的产品中的应用也属于本发明的保护范围：
36.1)抗人类风湿关节炎成纤维样滑膜(hfls-ra)细胞增殖的产品；
37.2)预防和/或治疗风湿、类风湿关节炎的产品。
38.所述1)中,所述产品具体可为抑制tnf-α诱导的hfls-ra增殖的产品。
39.所述产品具体可为药品。
40.本发明具有如下优点：
41.本发明综合运用硅胶、ods等柱色谱及hplc、nmr、ms、x-ray等多种技术从无梗五加叶中分离并鉴定出19个三萜类化合物，其中化合物1-10为新化合物，对比以往研究，本发明综合运用多种技术，且化合物的数量和质量都得以提升。活性实验结果表明，在给药浓度为20μmol/l时，其他化合物均能不同程度的抑制tnf-α诱导的hfls-ra增殖，其中化合物7、13、14、19的抑制作用显著，差异具有统计学意义。
附图说明
42.图1为本发明实施例1中无梗五加叶的提取分离流程图；
43.图2为本发明实施例1中从无梗五加叶中分离得到的化合物结构式；
44.图3为本发明实施例1中分离得到的化合物1-10的关键1h-1
h cosy与hmbc相关信号；
45.图4为本发明实施例1中分离得到的化合物1-10的noesy相关信号；
46.图5为本发明实施例1中分离得到的化合物1、6、7、17的晶体学结构。
具体实施方式
47.以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
48.实施例1、无梗五加叶中三萜类化合物的分离和结构鉴定
49.1.1实验材料与仪器
50.1.1.1实验材料
[0051][0052]
1.1.2实验仪器
[0053][0054]
1.1.3实验药材
[0055]
2020年8月，实验用无梗五加叶采摘于辽宁省丹东市凤城市，经黑龙江中医药大学药学院药用植物教研室樊锐锋副教授鉴定为无梗五加e.sessiliflorus(ruprecht&maximowicz)s.y.hu的干燥叶。原植物标本(20200821)保存于中药化学实验室。
[0056]
1.2提取和分离
[0057]
干燥的无梗五加叶30.0kg，经70％乙醇(10bv)回流提取(3
×
2h)，滤过残渣，滤液经减压浓缩得粗提物7.0kg(出膏率为23.3％)。取粗提物3.5kg经hp-20型大孔吸附树脂，分别用水(2bv)、40％乙醇(2bv)和95％乙醇(4bv)以1bv/h流速洗脱，洗脱液经减压浓缩得水洗脱组分1.4kg(40.0％)、40％乙醇洗脱组分1.1kg(31.4％)和95％乙醇洗脱组分0.4kg(11.4％)。
[0058]
95％乙醇洗脱组分(0.4kg)经正相硅胶(7倍95％乙醇洗脱组分质量)柱色谱，以二氯甲烷-甲醇(1:0-0:1,v/v)梯度洗脱，洗脱液经薄层(正相薄层板，展开剂为ch2cl
2-ch3oh系统，其中ch3oh与ch2cl2体积比为1：15)、hplc(流动相为ch3oh-h2o系统，梯度洗脱条件:0-30min流动相ch3oh与h2o体积比为5：95-100：0)分析鉴别，合瓶得9个流分：fr.a-i。分离流程详见图1。
[0059]
fr.d经过ods柱色谱(流动相为ch3oh-h2o系统，ch3oh与h2o体积比为1：9-10：0)分离得到fr.d1-d45，其中fr.d15析出化合物11(50.0mg)；fr.d18经制备型hplc(ch3oh/h2o＝66％,5ml/min)分离得到化合物12(tr＝60.5min,40.0mg)；fr.d22析出化合物7(2.8mg)；fr.d24经制备型hplc(ch3oh/h2o＝74％,5ml/min)分离得到化合物14(tr＝111.5min,25.1mg)；fr.d27经制备型hplc(ch3oh/h2o＝75％,5ml/min)分离得到化合物1(tr＝153.8min,55.6mg)。
[0060]
fr.e经过ods柱色谱(流动相为ch3oh-h2o系统，ch3oh与h2o体积比为1：9-10：0)分离得到fr.e1-e46，其中fr.e38析出化合物6(9.7mg)。
[0061]
fr.f经过ods柱色谱(流动相为ch3oh-h2o系统，ch3oh与h2o体积比为1：9-10：0)分离得到fr.f1-f43，其中fr.f40析出化合物17(30.0mg)。
[0062]
fr.g经过ods柱色谱(流动相为ch3oh-h2o系统，ch3oh与h2o体积比为1：9-10：0)分离得到fr.g1-g46，其中fr.g32析出化合物16(3.0mg)。
[0063]
fr.h经过ods柱色谱(流动相为ch3oh-h2o系统，ch3oh与h2o体积比为1：9-10：0)分离得到fr.h1-h42，其中fr.h12析出化合物13(50.0mg)；fr.h16经制备型hplc(ch3oh/h2o＝68％,5ml/min)分离得到化合物5(tr＝61.7min,5.0mg)、4(tr＝72.6min,3.0mg)和3(tr＝83.6min,20.0mg)；fr.h19经制备型hplc(ch3oh/h2o＝73％,5ml/min)分离得到化合物19(tr＝84.0min,11.2mg)、2(tr＝91.8min,12.5mg)和8(tr＝101.3min,10.0mg)；fr.h29经制备型hplc(ch3oh/h2o＝79％,5ml/min)分离得到化合物15(tr＝51.5min,21.5mg)和18(tr＝65.3min,42.7mg)；fr.h32经制备型hplc(ch3oh/h2o＝79％,5ml/min)分离得到化合物9(tr＝66.9min,7.0mg)和10(tr＝137.8min,11.0mg)。化合物名称与结构详见表1和图2。
[0064]
表1无梗五加叶中分离得到的化合物结构
[0065][0066]
注：“**”为新化合物；“*”为种首分化合物。
[0067]
1.3新三萜类化合物的结构鉴定
[0068]
1.3.1化合物1的结构鉴定
[0069]
化合物1为透明针状结晶，溶于吡啶，hr-esi-ms中[m+h]
+
峰为m/z471.3462(计算值为c
30h47o4+
,471.3474)，推测其分子式为c
30h46
o4，不饱和度为8。
[0070]
化合物1的1h-nmr(600mhz,c5d5n)谱中可观察到5个甲基氢质子信号：δ
h 0.95，1.10，1.15，1.19，1.78分别是c-24，c-26，c-23，c-27，c-29位三萜母核结构特征甲基峰；在δh3.94(1h,m,h-3)和3.96(1h,m,h-11)处观察到2个连氧次甲基氢质子信号；在δ
h 5.06(1h,brs,h-25a)，5.39(1h,brs,h-25b)和4.71(1h,brs,h-30a)，4.96(1h,brs,h-30b)处观察到2组端烯氢质子信号。
[0071]
在化合物1的
13
c-nmr(150mhz,c5d5n)谱中共显示出30个碳信号，根据dept谱可知在δc15.7(c-27)，15.8(c-26)，16.4(c-24)，19.5(c-29)，27.5(c-23)为5个甲基碳信号；在δ
c 79.3(c-3)和69.2(c-11)处观察到2个连氧次甲基碳信号；在δ
c 110.7(c-25)，149.3(c-10)和110.0(c-30)，151.1(c-20)处观察到2组端烯碳信号；在δ
c 178.8(c-28)处观察到1个羧基碳信号。
[0072]
将化合物1的1d-nmr数据与sachunoside(a novel 3,4-seco-migrated-lupane glycoside with a seven-membered b-ring from acanthopanax divaricatus var.sachunensis[j].park s y,yook c s,noharat.tetrahedron letters,2001,42(15):2825-2828.)比较发现两者的化学位移相近，主要区别存在于化合物1的a环和b环上，这提示我们化合物1的母核结构可能发生改变。根据其1h-1
h cosy相关信号提示存在以下三个结构片段：h-3/h
2-2/h-1/h-5/h
2-6/h
2-7、h-9/h-11/h
2-12/h-13/h-18/h-19/h
2-21/h
2-22和h
2-15/h
2-16。结合1h-1
h cosy相关信号，并根据hmbc中常规的h
2-30(δ
h 4.71,4.96)/c-19(δ
c 47.6)、c-29(δ
c 19.5)，h-18(δ
h 1.94)/c-20(δ
c 151.1)和h
2-16(δ
h 1.56,2.63)、h
2-22(δ
h 1.63,2.30)、h-18(δ
h 1.94)/c-28(δ
c 178.8)相关信号，确定其具有丙烯基和羧基的典型羽扇豆烷型e环。h
3-26(δ
h 1.10)/c-7(δ
c 37.5)、c-9(δ
c 59.1)、c-14(δ
c 41.9)和h
3-27(δ
h 1.19)/c-8(δ
c 42.1)、c-15(δ
c 32.0)、c-13(δ
c 37.3)的hmbc相关信号证实其c环和d环的存在。根据h
2-25(δ
h 5.06,5.39)/c-1(δ
c 46.7)、c-9(δ
c 59.1)和h-1(δ
h 2.69)、h-9(δ
h 2.41)/c-10(δ
c 149.3)相关信号，确定其极为特殊的七元环b的存在。最后，罕见的环a由h
3-24(δ
h 0.95)/c-3(δ
c 79.3)、c-23(δ
c 27.5)和h
3-23(δ
h 1.15)与c-4(δ
c 44.4)、c-5(δ
c 51.5)的关键hmbc相关信号确定(见图3)。
[0073]
在化合物1的noesy谱中(见图4)，h-3/h
3-23和h-1/h-9/h
3-27的相关信号表明h-1，h-3，h-9，ch
3-23和ch
3-27为α构型；h-11/h-13/h
3-26的相关信号表明h-11，h-13和ch
3-26为β构型。该结构中存在多处手性碳，为确定绝对构型，我们尝试培养单晶，最终在24℃下其甲醇溶剂中获得，通过ga kαx-单晶衍射[flack：0.06(9)]确定了其绝对构型分别为1r,3s,5r,8r,9r,11r,13r,14r,17s,18r,19r(见图5)。
[0074]
综合解析化合物1的2d-nmr谱，并详细归属其1d-nmr数据(见表2)，通过scifinder数据库检索表明其为具有新型骨架的化合物，命名为elesesterpene n(化学结构见图2)。
[0075]
表2化合物1的1h-nmr与
13
c-nmr核磁数据归属(600和150mhz,c5d5n)
[0076][0077]
1.3.2化合物2的结构鉴定
[0078]
化合物2为白色无定形粉末，溶于吡啶，hr-esi-ms中[m+h]
+
峰为m/z955.4920(计算值为c
48h75o19+
,955.4903)，推测其分子式为c
48h74o19
，不饱和度为12。
[0079]
化合物2的1h-nmr(600mhz,c5d5n)谱中可观察到5个甲基氢质子信号：δ
h 0.93，1.15，1.66，1.75分别是c-27，c-26，c-29，c-24位羽扇豆烷型三萜母核结构特征甲基峰，δ
h 1.66(3h,overlap,h-6”')为鼠李糖甲基氢质子信号；在δ
h 4.74(1h,overlap,h-23a)，4.77(1h,overlap,h-23b)和4.67(1h,overlap,h-30a)，4.80(1h,overlap,h-30b)处观察到2组端烯氢质子信号。此外，还可观察到2分子葡萄糖和1分子鼠李糖端基氢质子信号：δ
h 6.30(1h,d,j＝8.2hz,h-1')，4.91(1h,overlap,h-1”)，5.80(1h,brs,h-1”')。将其偶合常数和化学位移与已报道文献对比
[55]
，可判断化合物2中葡萄糖的端基氢为β构型，鼠李糖的端基氢为α构型。通过酸水解和气质联用确定了葡萄糖和鼠李糖的绝对构型分别为d和l，详细数据见章节1.5。
[0080]
在化合物2的
13
c-nmr(150mhz,c5d5n)谱中共显示出48个碳信号，根据dept谱可知在δc15.1(c-27)，16.3(c-26)，18.4(c-6”')，19.4(c-29)，22.4(c-24)为5个甲基碳信号；在δ
c 67.9(c-25)处观察到1个连氧亚甲基碳信号；在δ
c 93.4(c-10)处观察到1个连氧季碳信号；在δ
c 110.1(c-23)，149.9(c-4)和109.9(c-30)，150.6(c-20)处观察到2组端烯碳信号；
在δ
c 176.4(c-3)和174.6(c-28)处观察到2个酯基碳信号；此外，在δ
c 95.1(c-1')，104.9(c-1”)，102.5(c-1”')处分别为2分子葡萄糖和1分子鼠李糖端基碳信号。综合以上这些结果分析化合物2可能是羽扇豆烷型三萜皂苷。
[0081]
将化合物2的1d-nmr数据与sachunoside(a novel 3,4-seco-migrated-lupane glycoside with a seven-membered b-ring from acanthopanax divaricatus var.sachunensis[j].park s y,yook c s,noharat.tetrahedron letters,2001,42(15):2825-2828.)比较发现两者母核的化学位移相近，推测其c-3、c-10和c-25位发生改变。化合物2的1h-1
h cosy相关性显示存在三个结构片段：h
2-2/h-1/h-5/h
2-6/h
2-7、h-9/h
2-11/h
2-12/h-13/h-18/h-19/h
2-21/h
2-22和h
2-15/h
2-16。如化合物1中常规的hmbc相关信号，确定其具有典型的羽扇豆烷型三萜的c、d、e环。根据h-1(δ
h 3.70)/c-10(δ
c 93.4)、c-6(δ
c 24.9)相关信号，解析出特殊的七元环b。根据dept可知c-10为季碳，c-25为仲碳，因此推断c-10位连接羟基且通过c-25与c-3相连构成酯环a(见图3)。
[0082]
在化合物2的noesy谱中(见图4)，h-1/h-5/h-9/h
3-27/h-18的相关信号表明h-1，h-5，h-9，ch
3-27和h-18为α构型；h-13/h
3-26的相关信号表明h-13和ch
3-26为β构型。
[0083]
综合解析化合物2的2d-nmr谱，并详细归属其1d-nmr数据(见表3)，通过scifinder数据库检索表明其为新化合物，命名为elesesterpene o(化学结构见图2)
[0084]
表3化合物2的1h-nmr与
13
c-nmr核磁数据归属(600和150mhz,c5d5n)
[0085]
[0086][0087]
1.3.3化合物3的结构鉴定
[0088]
化合物3为白色无定形粉末，溶于吡啶，hr-esi-ms中[m+nh4]
+
峰为m/z990.5261(计算值为c
48h80
no
20+
,990.5274)，推测其分子式为c
48h76o20
，不饱和度为11。
[0089]
化合物3的1h-nmr(600mhz,c5d5n)谱中可观察到6个甲基氢质子信号：δ
h 0.98，1.21，1.52，1.67，1.70分别是c-27，c-26，c-25，c-24，c-29位羽扇豆烷型三萜母核结构特征甲基峰，δ
h 1.70(3h,s,h-6”')为鼠李糖甲基氢质子信号；在δ
h 4.07(1h,m,h-11)处观察到1个连氧次甲基氢质子信号；在δ
h 4.89(1h,s,h-23a)，5.01(1h,s,h-23b)和4.71(1h,s,h-30a)，4.83(1h,s,h-30b)处观察到2组端烯氢质子信号。此外，还存在2分子葡萄糖和1分子鼠李糖端基氢质子信号：δ
h 6.34(1h,d,j＝7.9hz,h-1')，4.92(1h,s,h-1”)，5.85(1h,s,h-1”')。根据其偶合常数，可判断化合物3中葡萄糖的端基氢为β构型，鼠李糖的端基氢为α构型。通过酸水解和气质联用确定了葡萄糖和鼠李糖的绝对构型分别为d和l，详细数据见章节1.5。
[0090]
在化合物3的
13
c-nmr(150mhz,c5d5n)谱中共显示出48个碳信号，根据dept谱可知在δc14.1(c-27)，17.5(c-26)，18.4(c-6”')，19.5(c-29)，20.1(c-25)，24.8(c-24)为6个甲基碳信号；在δ
c 69.2(c-11)处观察到1个连氧次甲基碳信号；在δ
c 95.2(c-10)处观察到1个连氧季碳信号；在δ
c 114.9(c-23)，145.8(c-4)和110.3(c-30)，150.1(c-20)处观察到2组端烯碳信号；在δ
c 174.3(c-3)和174.9(c-28)处观察到1个羧基和1个酯基碳信号；此外，在δ
c 95.3(c-1')，105.0(c-1”)，102.6(c-1”')处分别为2分子葡萄糖和1分子鼠李糖端基碳信号。综合以上这些结果分析化合物3可能是羽扇豆烷型三萜皂苷。
[0091]
将化合物3的1d-nmr数据与化合物2比较发现两者母核的化学位移相近，推测化合物3的c-11和c-25位发生改变。结合dept可知c-10为季碳，c-11为叔碳，并根据hmbc相关信号：h
3-25(δ
h 1.52)/c-10(δ
c 95.2)、c-1(δ
c 47.7)，确定了c-25位甲基的存在。根据hmbc相关信号：h-9(δ
h 2.10)/c-11(δ
c 69.2)，确定c-11位连接羟基的存在(见图3)。
[0092]
在化合物3的noesy谱中(见图4)，h-1/h-5/h-9/h
3-27/h-18的相关信号表明h-1，h-5，h-9，ch
3-27和h-18为α构型；h-11/h-13/h-19/h
3-26/h
3-25的相关信号表明h-11，h-13，h-19，ch
3-26和ch
3-25为β构型。
[0093]
综合解析化合物3的2d-nmr谱，并详细归属其1d-nmr数据(见表4)，通过scifinder数据库检索表明其为新化合物，命名为elesesterpene p(化学结构见图2)。
[0094]
表4化合物3的1h-nmr与
13
c-nmr核磁数据归属(600和150mhz,c5d5n)
glycoside with a seven-membered b-ring from acanthopanax divaricatus var.sachunensis[j].park s y,yook c s,noharat.tetrahedron letters,2001,42(15):2825-2828.)比较发现两者的化学位移相近，主要区别在于化合物4中c-2位羟基的存在，通过其hmbc相关信号：h-2(δ
h 5.09)/c-3(δ
c 175.8)和h-1(δ
h 2.97)/c-2(δ
c 67.7)得到证实；c-28位连接由两分子葡萄糖组成的双糖，通过hmbc相关信号：h-1'(δ
h 6.35)/c-28(δ
c 175.1)和h
2-6'(δ
h 4.31,4.73)/c-1”(δ
c 105.2)得到了其连接方式(见图3)。
[0101]
在化合物4的noesy谱中(见图4)，h-1/h-2/h-5/h
3-23/h-9/h
3-27/h-18的相关信号表明h-1，h-2，h-5，ch
3-23，h-9，ch
3-27和h-18为α构型；h-13/h
3-26的相关信号表明h-13，ch
3-26为β构型。
[0102]
综合解析化合物4的2d-nmr谱，并详细归属其1d-nmr数据(见表5)，通过scifinder数据库检索表明其为新化合物，命名为elesesterpene q(化学结构见图2)。
[0103]
表5化合物4的1h-nmr与
13
c-nmr核磁数据归属(600和150mhz,c5d5n)
[0104][0105][0106]
1.3.5化合物5的结构鉴定
[0107]
化合物5为白色无定形粉末，溶于吡啶，hr-esi-ms中[m+h]
+
峰为m/z955.4888(计算值为c
48h75o19+
,955.4903)，推测其分子式为c
48h74o19
，不饱和度为12。
[0108]
化合物5的1h-nmr(600mhz,c5d5n)谱中可观察到6个甲基氢质子信号：δ
h 1.00，1.08，1.28，1.30，1.71分别是c-27，c-26，c-23，c-24，c-29位羽扇豆烷型三萜母核结构特征甲基峰，δ
h 1.69(3h,d,j＝5.9hz,h-6”')为鼠李糖甲基氢质子信号；在δ
h 5.11(1h,d,j＝
10.5hz,h-2)处观察到1个连氧次甲基氢质子信号；在δ
h 5.10(1h,s,h-25a)，5.42(1h,s,h-25b)和4.69(1h,brs,h-30a)，4.82(1h,brs,h-30b)处可以观察到2组端烯氢质子信号。此外，还存在2分子葡萄糖和1分子鼠李糖端基氢质子信号：δ
h 6.34(1h,d,j＝8.2hz,h-1')，4.93(1h,d,j＝7.9hz,h-1”)，5.84(1h,brs,h-1”')。根据其偶合常数，可判断化合物5中葡萄糖的端基氢为β构型，鼠李糖的端基氢为α构型。通过酸水解和气质联用确定了葡萄糖和鼠李糖的绝对构型分别为d和l，详细数据见章节1.5。
[0109]
在化合物5的
13
c-nmr(150mhz,c5d5n)谱中共显示出48个碳信号，根据dept谱可知在δc14.6(c-27)，14.6(c-26)，18.4(c-6”')，19.4(c-29)，22.8(c-23)，30.6(c-24)为6个甲基碳信号；在δ
c 67.7(c-2)处观察到1个连氧次甲基碳信号；在δ
c 112.1(c-25)，150.2(c-10)和109.9(c-30)，150.6(c-20)处观察到2组端烯碳信号；在δ
c 175.8(c-3)和175.0(c-28)处观察到2个酯基碳信号；此外，在δ
c 95.2(c-1')，105.0(c-1”)，102.6(c-1”')处分别为2分子葡萄糖和1分子鼠李糖端基碳信号。综合以上这些结果分析化合物5可能是羽扇豆烷型三萜皂苷。
[0110]
将化合物5的1d-nmr数据与化合物4比较发现两者的化学位移非常相似，主要区别在于化合物5中c-28位的糖链变为鼠李糖(1
→
4)葡萄糖(1
→
6)葡萄糖，并且通过其hmbc相关信号：h-4”(δ
h 4.40)/c-1”'(δ
c 102.6)确定了鼠李糖的连接方式(见图3)。
[0111]
在化合物5的noesy谱中(见图4)，h-1/h-2/h-5/h
3-23/h-9/h
3-27/h-18的相关信号表明h-1，h-2，h-5，ch
3-23，h-9，ch
3-27和h-18为α构型；h-13/h
3-26的相关信号表明h-13，ch
3-26为β构型。
[0112]
综合解析化合物5的2d-nmr谱，并详细归属其1d-nmr数据(见表6)，通过scifinder数据库检索表明其为新化合物，命名为elesesterpene r(化学结构见图2)。
[0113]
表6化合物5的1h-nmr与
13
c-nmr核磁数据归属(600和150mhz,c5d5n)
al.korean journal of pharmacognosy,2003,34(4):269-273.)比较发现两者的化学位移非常相似，主要区别在于化合物6中c-29位羟基的存在，并且通过其hmbc相关信号：h
2-30(δ
h 5.14,5.39)/c-29(δ
c 64.6)和h
2-29(δ
h 4.52)/c-20(δ
c 156.5)得到了证实(见图3)。
[0120]
在化合物6的noesy谱中(见图4)，h-5/h
3-27/h-9/h-18的相关信号表明h-5，ch
3-27，h-9和h-18为α构型；h-1/h
3-25，h-11/h
3-26/h-13/h-19的相关信号表明h-1，ch
3-25，h-11，ch
3-26，h-13和h-19为β构型。该结构中存在多处手性碳，为确定绝对构型，我们尝试培养单晶，最终在24℃下化合物6的甲醇溶剂中获得，通过ga kαx-单晶衍射[flack：0.07(8)]确定了其绝对构型分别为1r,5s,8r,9s,10s,11r,13r,14r,17s,18s,19r(见图5)。
[0121]
综合解析化合物6的2d-nmr谱，并详细归属其1d-nmr数据(见表7)，通过scifinder数据库检索表明其为新化合物，命名为elesesterpene l(化学结构见图2)。
[0122]
表7化合物6的1h-nmr与
13
c-nmr核磁数据归属(600和150mhz,c5d5n)
[0123][0124][0125]
1.3.7化合物7的结构鉴定
[0126]
化合物7为透明针状结晶，溶于吡啶，hr-esi-ms中[m+h]
+
峰为m/z503.3370(计算值为c
30h47o6+
,503.3373)，推测其分子式为c
30h46
o6，不饱和度为8。
[0127]
化合物7的1h-nmr(600mhz,c5d5n)谱中可观察到6个甲基氢质子信号：δ
h 0.98，1.06，1.11，1.32，1.39，1.70分别是c-26，c-27，c-25，c-24，c-23，c-29位羽扇豆烷型三萜母核结构特征甲基峰；在δ
h 4.62(1h,t,j＝8.3hz,h-1)和4.59(1h,m,h-11)处观察到2个连氧次甲基氢质子信号；在δ
h 4.64(1h,s,h-30a)，4.93(1h,s,h-30b)处观察到1组端烯氢质子信号。
[0128]
在化合物7的
13
c-nmr(150mhz,c5d5n)谱中共显示出30个碳信号，根据dept谱可知在δ
c 13.6(c-27)，18.4(c-26)，18.8(c-29)，20.0(c-25)，26.3(c-24)，34.8(c-23)为6个甲基碳信号；在δ
c 75.0(c-4)处观察到1个连氧季碳信号；在δ
c 72.1(c-1)和74.9(c-11)处观察到2个连氧次甲基碳信号；在δ
c 110.6(c-30)，150.4(c-20)处观察到1组端烯碳信号；在δ
c 173.0(c-3)和178.7(c-28)处观察到1个酯基和1个羧基碳信号。综合以上这些结果分析化
合物7可能是羽扇豆烷型三萜。
[0129]
将化合物7的1d-nmr数据与chiisanogenin(triterpene components from the leaves of acanthopanax sessiliflorus seem[j].ryoo h s,chang s y,yook c s,et al.korean journal of pharmacognosy,2003,34(4):269-273.)比较发现两者的化学位移相近，主要区别在于化合物7中c-4位羟基和双甲基的存在，并且通过其hmbc相关信号：h-5(δ
h 1.99)、h
3-24(δh1.32)/c-4(δ
c 75.0)和h
3-23(δ
h 1.39)/c-5(δ
c 53.7)、c-24(δ
c 26.3)得到了证实(见图3)。
[0130]
在化合物7的noesy谱中(见图4)，h-5/h
3-27/h-9/h-18的相关信号峰表明h-5，ch
3-27，h-9和h-18为α构型；h-1/h
3-25，h-11/h
3-26/h-13/h-19的相关信号峰表明h-1，ch
3-25，h-11，ch
3-26，h-13和h-19为β构型。该结构中存在多处手性碳，为确定绝对构型，我们尝试培养单晶，最终在24℃下化合物7的甲醇溶剂中获得，并通过ga kαx-单晶衍射[flack：0.14(5)]确定了其绝对构型分别为1r,5r,8r,9s,10r,11r,13r,14r,17s,18r,19r(见图5)。
[0131]
综合解析化合物7的2d-nmr谱，并详细归属其1d-nmr数据(见表8)，通过scifinder数据库检索表明其为新化合物，命名为elesesterpene m(化学结构见图2)。
[0132]
表8化合物7的1h-nmr与
13
c-nmr核磁数据归属(600和150mhz,c5d5n)
[0133][0134][0135]
1.3.8化合物8的结构鉴定
[0136]
化合物8为白色无定形粉末，溶于吡啶，hr-esi-ms中[m+h]
+
峰为m/z 939.4956(计算值为c
48h75o18+
,939.4953)，推测其分子式为c
48h74o18
，不饱和度为12。
[0137]
化合物8在1h-nmr(600mhz,c5d5n)谱中可观察到7个甲基氢质子信号：δ
h 0.81，1.06，1.06，1.06，1.13，1.68分别是c-25，c-23，c-24，c-27，c-26，c-29位羽扇豆烷型三萜母核结构特征甲基峰；δ
h 1.71(3h,d,j＝6.2hz,h-6”')为鼠李糖甲基氢质子信号。在δ
h 3.74(1h,dd,7.1,12.5,h-1)和3.99(1h,td,4.6,11.0,h-11)处观察到2个连氧次甲基氢质子信号；在δh4.68(1h,overlap,h-30a)，4.81(1h,br s,h-30b)处观察到1组端烯氢质子信号。此外，还存在2分子葡萄糖和1分子鼠李糖端基氢质子信号：δ
h 6.34(1h,d,j＝8.2hz,h-1')，
4.94(1h,overlap,h-1”)，5.86(1h,brs,h-1”')。根据其偶合常数，可判断化合物8中葡萄糖的端基氢为β构型，鼠李糖的端基氢为α构型。通过酸水解和气质联用确定了葡萄糖和鼠李糖的绝对构型分别为d和l，详细数据见章节1.5。
[0138]
在化合物8的
13
c-nmr(150mhz,c5d5n)谱中共显示出48个碳信号，在δ
c 11.2(c-25)，15.9(c-27)，16.0(c-26)，18.5(c-6”')，19.7(c-29)，23.3(c-24)，29.3(c-23)处观察到7个甲基碳信号；在δ
c 85.1(c-1)和77.5(c-11)处观察到2个连氧次甲基碳信号；δ
c 109.9(c-30)，150.7(c-20)处观察到1组端烯碳信号；在δ
c 174.8(c-28)处观察到1个酯基碳信号。在δc216.0(c-3)处观察到1个羰基碳信号；此外，在δ
c 95.3(c-1')，105.1(c-1”)，102.7(c-1”')处分别为2分子葡萄糖和1分子鼠李糖端基碳信号。综合以上这些结果分析化合物8可能是羽扇豆烷型三萜皂苷。
[0139]
将化合物8的1d-nmr数据与elesesterpene b(elesesterpenes a
–
k:lupane-type triterpenoids from the leaves of eleutherococcussessiliflorus[j].han d,liu y,li x m,et al.frontiers in chemistry,2021,9:813764.)比较发现两者的化学位移相近，主要区别在于化合物8中c-24位羟基的缺失，通过其hmbc相关信号：h
3-24(δ
h 1.06)/c-3(δ
c 216.0)和h
3-23(δ
h 1.06)/c-24(δ
c 23.3)得到证实；c-28位糖链的存在，通过hmbc信号：h-1'(δ
h 6.34)/c-28(δ
c 174.8)、h
2-6'(δh4.29,4.70)/c-1”(δ
c 105.1)、h-4”(δh4.42)/c-1”'(δ
c 102.7)得到了其连接方式。(见图3)。
[0140]
在化合物8的noesy谱中(见图4)，h-1/h-5/h-9/h
3-27/h-18的相关信号表明h-1，h-5，h-9，ch
3-27和h-18为α构型；h-11/h
3-25/h
3-26/h-13/h-19的相关信号表明h-11，ch
3-25，ch
3-26，h-13和h-19为β构型。
[0141]
综合解析化合物8的2d-nmr谱，并详细归属其1d-nmr数据(见表9)，通过scifinder数据库检索表明其为新化合物，命名为elesesterpene u(化学结构见图2)。
[0142]
表9化合物8的1h-nmr与
13
c-nmr核磁数据归属(600和150mhz,c5d5n)
[0143][0144]
1.3.9化合物9的结构鉴定
[0145]
化合物9为白色无定形粉末，溶于吡啶，hr-esi-ms中[m+h]
+
峰为m/z925.5156(计算值为c
48h77o17+
,925.5161)，推测其分子式为c
48h76o17
，不饱和度为11。
[0146]
化合物9的1h-nmr(600mhz,c5d5n)谱中可观察到7个甲基氢质子信号：δh0.81，0.99，1.00，1.10，1.11，1.72分别是c-25，c-27，c-24，c-23，c-26，c-29位羽扇豆烷型三萜母核结构特征甲基峰，δ
h 1.70(3h,d,j＝6.2hz,h-6”')为鼠李糖甲基氢质子信号；在δ
h 4.73(1h,br s,h-30a)和4.87(1h,brs,h-30b)处观察到1组端烯氢质子信号。此外，还存在2分子葡萄糖和1分子鼠李糖端基氢质子信号：δ
h 6.35(1h,d,j＝8.2hz,h-1')，4.93(1h,d,j＝8.3hz,h-1”)，5.85(1h,brs,h-1”')。根据其偶合常数，可判断化合物9中葡萄糖的端基氢为β构型，鼠李糖的端基氢为α构型。通过酸水解和气质联用确定了葡萄糖和鼠李糖的绝对构型分别为d和l，详细数据见章节1.5。
[0147]
在化合物9的
13
c-nmr(150mhz,c5d5n)谱中共显示出48个碳信号，根据dept谱可知在δ
c 14.7(c-27)，15.9(c-25)，16.0(c-26)，18.5(c-6”')，19.3(c-29)，21.1(c-24)，26.6(c-23)为7个甲基碳信号；在δ
c 110.0(c-30)，150.8(c-20)处观察到1组端烯碳信号；在δ
c 174.9(c-28)处观察到1个酯基碳信号；在δ
c 216.5(c-3)处观察到1个羰基碳信号；此外，在δ
c 95.2(c-1')，105.1(c-1”)，102.7(c-1”')处分别为2分子葡萄糖和1分子鼠李糖端基碳信号。综合以上这些结果分析化合物9可能是羽扇豆烷型三萜皂苷。
[0148]
将化合物9的1d-nmr数据与protochiisanoside(lupane triterpenoid glycosyl esters from leaves of acanthopanax divaricatus[j].shirasuna k,miyakoshi m,mimoto s,et al.phytochemistry,1997,45(3):579-584.)比较发现两者c化学位移相近，主要区别在于化合物9中c-1和c-11位两个羟基的缺失，并且通过其1h-1
h cosy相关信号：h
2-1(δ
h 1.29,1.73)/h
2-2(δ
h 2.44,2.48)和h-9(δ
h 1.35)/h
2-11(δ
h 1.31)/h
2-12(δ
h 1.13,1.84)，以及hmbc相关信号：h
2-2(δ
h 2.44,2.48)/c-3(δ
c 216.5)和h
3-25(δ
h 0.81)/c-1(δ
c 39.6)，h
2-11(δh1.31)/c-8(δ
c 40.9)和h-12b(δ
h 1.84)/c-14(δ
c 42.7)得到了证实(见图3)。
[0149]
在化合物9的noesy谱中(见图4)，h
3-23/h-5和h-9/h
3-27/h-18的相关信号表明h
3-23，h-5，h-9，ch
3-27和h-18为α构型；h
3-25/h
3-26/h-13/h-19的相关信号表明ch
3-25，ch
3-26，h-13和h-19为β构型。
[0150]
综合解析化合物9的2d-nmr谱，并详细归属其1d-nmr数据(见表10)，通过scifinder数据库检索表明其为新化合物，命名为elesesterpene s(化学结构见图2)。
[0151]
表10化合物9的1h-nmr与
13
c-nmr核磁数据归属(600和150mhz,c5d5n)
[0152][0153][0154]
1.3.10化合物10的结构鉴定
[0155]
化合物10为白色无定形粉末，溶于吡啶，hr-esi-ms中[m+h]
+
峰为m/z967.5269(计算值为c
50h79o18+
,967.5266)，推测其分子式为c
50h78o18
，不饱和度为12。
[0156]
化合物10的1h-nmr(600mhz,c5d5n)谱中可观察到7个甲基氢质子信号：δh0.85，0.87，1.11，1.12，1.36，1.75分别是c-30，c-29，c-25，c-27，c-26，c-24位三萜母核结构特征甲基峰，δ
h 1.69(3h,d,j＝5.7hz,h-6”')为鼠李糖甲基氢质子信号；在δh4.13(2h,overlap,h-1
””
)和1.12(3h,overlap,h-2
””
)处观察到1组连氧乙基氢质子信号；在δ
h 4.84(1h,br s,h-23a)和4.97(1h,overlap,h-23b)处观察到1组端烯氢质子信号，δ
h 5.84(1h,overlap,h-11)和5.69(1h,d,j＝5.3hz,h-12)处观察到2组非端烯氢质子信号。此外，还存在2分子葡萄糖和1分子鼠李糖端基氢质子信号：δ
h 6.22(1h,d,j＝8.0hz,h-1')，4.96(1h,overlap,h-1”)，5.84(1h,overlap,h-1”')。根据其偶合常数，可判断化合物10中葡萄糖的端基氢为β构型，鼠李糖的端基氢为α构型。通过酸水解和气质联用确定了葡萄糖和鼠李糖的绝对构型分别为d和l，详细数据见章节1.5。
[0157]
在化合物10的
13
c-nmr(150mhz,c5d5n)谱中共显示出48个碳信号，根据dept谱可知在δ
c 18.5(c-6”')，20.0(c-26)，20.6(c-27)，23.1(c-24)，23.5(c-30)，30.3(c-25)，32.9(c-29)为7个甲基碳信号；在δ
c 60.2(c-1
””
)和14.3(c-2
””
)处观察到1组连氧乙基碳信号；在δ
c 114.4(c-23)，147.4(c-4)处观察到1组端烯碳信号，δ
c 119.2(c-11)，148.5(c-9)和120.8(c-12)，146.1(c-13)处观察到2组非端烯碳信号；在δ
c 174.0(c-3)和176.8(c-28)处观察到2个酯基碳信号；此外，在δ
c 95.6(c-1')，104.8(c-1”)，102.7(c-1”')处分别为2分子葡萄糖和1分子鼠李糖端基碳信号。综合以上这些结果分析化合物10可能是齐墩果烷型三萜皂苷。
[0158]
将化合物10的1d-nmr数据与buddlintriterpene a(two new 3,4-secooleanane triterpenoids from buddlejalindleyana fort.fruits[j].ren y s,xu f q,zhang w,et al.phytochemistry letters,2016,18:172-175.)比较发现两者的化学位移相近，主要区别在于化合物10中侧链发生改变，即c-3位所连乙基、c-23位端烯基和c-28位及所连糖链的变化。
[0159]
根据其1h-1
h cosy相关信号提示存在以下结构片段：h
3-2
””
/h
2-1
””
、h
2-1/h
2-2、h-5/h
2-6/h
2-7、h-11/h-12、h
2-15/h
2-16、h-18/h
2-19和h
2-21/h
2-22。结合1h-1
h cosy相关信号，并根据hmbc中h
3-29(δ
h 0.87)/c-19(δ
c 46.0)、c-30(δ
c 23.5)，h
3-30(δ
h 0.85)/c-20(δ
c 30.6)、c-21(δ
c 33.8)，h-18(δ
h 3.29)/c-28(δ
c 176.8)相关信号，确定其连有双甲基和酯基的典型齐墩果烷型皂苷e环。h
3-27(δ
h 1.12)/c-15(δ
c 27.7)、c-13(δ
c 146.1)和h-18(δ
h 3.29)/c-13(δ
c 146.1)、c-16(δ
c 23.7)的hmbc相关信号证实其d环的存在。h
3-26(δ
h 1.36)/c-9(δ
c 148.5)、c-14(δ
c 42.1)，h-12(δ
h 5.69)/c-9(δ
c 148.5)和h-11(δ
h 5.84)/c-13(δ
c 146.1)的hmbc相关信号证实含两组双键的c环的存在。根据h
3-25(δ
h 1.11)/c-5(δ
c 47.5)、c-9(δ
c 148.5)和h
3-26(δ
h 1.36)/c-7(δ
c 30.0)相关信号确定其b环的存在。最后，由hmbc中h
2-1
””
(δ
h 4.13)/c-3(δ
c 174.0)相关信号确定c-3位为乙基连接位置，c-5位异丙烯基与c-28位糖链的存在均由常规的hmbc相关信号确定(见图3)。
[0160]
在化合物10的noesy谱中(见图4)，h-5/h
3-27的相关信号表明h-5和ch
3-27为α构型；h
3-25/h-11/h-12/h-18/h
3-30的相关信号表明ch
3-25，h-11，h-12，h-18和ch
3-30为β构型。
[0161]
综合解析化合物10的2d-nmr谱，并详细归属其1d-nmr数据(见表11)，通过scifinder数据库检索表明其为新化合物，命名为elesesterpene t(化学结构见图2)。
[0162]
表11化合物10的1h-nmr与
13
c-nmr核磁数据归属(600和150mhz,c5d5n)
[0163][0164][0165]
1.4已知三萜类化合物的结构鉴定
[0166]
1.4.1化合物11的结构鉴定
[0167]
化合物11为白色无定形粉末，溶于吡啶，hr-esi-ms中[m+h]
+
峰为m/z 501.3216(计算值为c
30h45o6+
,501.3216)，推测其分子式为c
30h44
o6，不饱和度为9。
[0168]
化合物11在1h-nmr(600mhz,c5d5n)谱中可观察到5个甲基氢质子信号：δ
h 1.01，1.07，1.20，1.87，1.97分别是c-25，c-26，c-27，c-24，c-29位羽扇豆烷型三萜母核结构特征甲基峰。在δ
h 3.73(1h,d,j＝8.0hz,h-1)，4.68(1h,q,j＝9.8hz,h-11)和4.80(1h,d,j＝5.3hz,h-22)处观察到3个连氧次甲基氢质子信号；在δ
h 5.02(1h,brs,h-23a)，5.13(1h,brs,h-23b)，4.71(1h,brs,h-30a)，5.06(1h,brd,j＝2.2hz,h-30b)处观察到2组端烯氢质子信号。
[0169]
在化合物11的
13
c-nmr(150mhz,c5d5n)谱中共显示出30个碳信号，在δ
c 13.7(c-27)，17.8(c-26)，18.7(c-29)，19.0(c-25)，23.5(c-24)处观察到5个甲基碳信号；在δ
c 70.5(c-1)，75.3(c-11)和75.4(c-22)处观察到3个连氧次甲基碳信号；δ
c 113.8(c-23)，147.7(c-4)，110.9(c-30)，151.0(c-20)处观察到2组端烯碳信号；在δ
c 173.0(c-3)，178.4
(c-28)处观察到1个酯基和1个羧基碳信号。
[0170]
综上所述，对比化合物11与22α-hydroxychiisanogenin(lupane triterpenoid glycosyl esters from leaves of acanthopanax divaricatus[j].shirasuna k,miyakoshi m,mimoto s,et al.phytochemistry,1997,45(3):579-584.)的1h-nmr和
13
c-nmr数据，两者极其吻合。因此，详细归属其1d-nmr数据(见表12)，并确定化合物11为22α-hydroxychiisanogenin(化学结构见图2)。
[0171]
表12化合物11的1h-nmr与
13
c-nmr核磁数据归属(600和150mhz,c5d5n)
[0172][0173]
1.4.2化合物12的结构鉴定
[0174]
化合物12为白色无定形粉末，溶于吡啶，hr-esi-ms中[m+h]
+
峰为m/z 501.3215(计算值为c
30h45o6+
,501.3216)，推测其分子式为c
30h44
o6，不饱和度为9。
[0175]
化合物12在1h-nmr(600mhz,c5d5n)谱中可观察到4个甲基氢质子信号：δ
h 1.01，1.04，1.06，1.68分别是c-26，c-27，c-25，c-29位羽扇豆烷型三萜母核结构特征甲基峰。在δ
h 4.42(1h,d,j＝14.3hz,h-24a)，4.63(1h,overlap,h-24b)处观察到1组连氧亚甲基氢质子信号；在δ
h 3.68(1h,d,j＝8.1hz,h-1)和4.63(1h,overlap,h-11)处观察到2个连氧次甲基氢质子信号；在δ
h 5.13(1h,brs,h-23a)，5.57(1h,brs,h-23b)，4.63(1h,overlap,h-30a)，4.91(1h,br s,h-30b)处观察到2组端烯氢质子信号。
[0176]
在化合物12的
13
c-nmr(150mhz,c5d5n)谱中共显示出30个碳信号，在δ
c 13.7(c-27)，17.9(c-26)，18.5(c-25)，18.8(c-29)处观察到4个甲基碳信号；在δ
c 67.1(c-24)处观察到1个连氧亚甲基碳信号；在δ
c 70.8(c-1)和75.4(c-11)处观察到2个连氧次甲基碳信号；δ
c 111.0(c-23)，152.8(c-4)，110.5(c-30)，150.4(c-20)处观察到2组端烯碳信号；在δ
c 172.8(c-3)，178.7(c-28)处观察到1个酯基和1个羧基碳信号。
[0177]
综上所述，对比化合物12与24-hydroxychiisanogenin(two 3,4-seco-lupane triterpenes from leaves of acanthopanax divaricatus var.albeofructus[j].oh,o j,chang s y,yook c s,et al.chemical and pharmaceutical bulletin,2000,48(6):879-881.)的1h-nmr和
13
c-nmr数据，两者极其吻合。因此，详细归属其1d-nmr数据(见表13)，
并确定化合物12为24-hydroxychiisanogenin(化学结构见图2)。
[0178]
表13化合物12的1h-nmr与
13
c-nmr核磁数据归属(600和150mhz,c5d5n)
[0179][0180]
1.4.3化合物13的结构鉴定
[0181]
化合物13为白色无定形粉末，溶于吡啶，hr-esi-ms中[m+h]
+
峰为m/z 955.4919(计算值为c
48h75o19+
,955.4903)，推测其分子式为c
48h74o19
，不饱和度为12。
[0182]
化合物13在1h-nmr(600mhz,c5d5n)谱中可观察到6个甲基氢质子信号：δ
h 1.01，1.01，1.10，1.63，1.88分别是c-25，c-27，c-26，c-29，c-24位羽扇豆烷型三萜母核结构特征甲基峰，δ
h 1.70(3h,d,j＝5.9hz,h-6”')为鼠李糖甲基氢质子信号。在δ
h 3.70(1h,d,j＝7.7hz,h-1)和4.49(1h,q,j＝9.7hz,h-11)处观察到2个连氧次甲基氢质子信号；在δ
h 5.01(1h,brs,h-23a)，5.14(1h,brs,h-23b)，4.59(1h,brs,h-30a)，4.85(1h,br s,h-30b)处观察到2组端烯氢质子信号。此外，还存在2分子葡萄糖和1分子鼠李糖端基氢质子信号：δ
h 6.35(1h,dd,j＝1.2,8.2hz,h-1')，4.94(1h,d,j＝7.6hz,h-1”)，5.85(1h,brs,h-1”')。
[0183]
在化合物13的
13
c-nmr(150mhz,c5d5n)谱中共显示出48个碳信号，在δ
c 13.7(c-27)，17.9(c-26)，18.4(c-6”')，18.8(c-29)，19.0(c-25)，23.5(c-24)处观察到6个甲基碳信号；在δ
c 70.4(c-1)和75.2(c-11)处观察到2个连氧次甲基碳信号；δ
c 113.8(c-23)，147.6(c-4)，110.6(c-30)，150.1(c-20)处观察到2组端烯碳信号；在δ
c 173.0(c-3)，175.0(c-28)处观察到2个酯基碳信号。此外，在δ
c 95.3(c-1')，105.0(c-1”)，102.7(c-1”')处分别为2分子葡萄糖和1分子鼠李糖端基碳信号。
[0184]
综上所述，对比化合物13与chiisanoside(lupane-type saponins from leaves of acanthopanax sessiliflorus and their inhibitory activity on pancreatic lipase[j].yoshizumi k,hirano k,ando h,et al.journal of agricultural and food chemistry,2006,54(2):335-341.)的1h-nmr和
13
c-nmr数据，两者极其吻合。因此，详细归属其1d-nmr数据(见表14)，并确定化合物13为chiisanoside(化学结构见图2)。
[0185]
表14化合物13的1h-nmr与
13
c-nmr核磁数据归属(600和150mhz,c5d5n)
[0186][0187]
1.4.4化合物14的结构鉴定
[0188]
化合物14为白色无定形粉末，溶于吡啶，hr-esi-ms中[m+h]
+
峰为m/z 485.3269(计算值为c
30h45o5+
,485.3267)，推测其分子式为c
30h44
o5，不饱和度为9。
[0189]
化合物14在1h-nmr(600mhz,c5d5n)谱中观察到5个甲基氢质子信号：δ
h 0.98，1.00，1.06，1.69，1.86分别是c-25，c-26，c-27，c-29，c-24位羽扇豆烷型三萜母核结构特征甲基峰。在δ
h 3.72(1h,d,j＝8.2hz,h-1)和4.61(1h,q,j＝9.7hz,h-11)处观察到2个连氧次甲基氢质子信号；在δ
h 5.01(1h,brs,h-23a)，5.12(1h,brs,h-23b)，4.64(1h,brs,h-30a)，4.93(1h,brd,j＝1.2hz,h-30b)处观察到2组端烯氢质子信号。
[0190]
在化合物14的
13
c-nmr(150mhz,c5d5n)谱中共显示出30个碳信号，在δ
c 13.7(c-27)，17.7(c-26)，18.8(c-29)，18.9(c-25)，23.4(c-24)处观察到5个甲基碳信号；在δ
c 70.4(c-1)和75.3(c-11)处观察到2个连氧次甲基碳信号；δ
c 113.8(c-23)，147.6(c-4)，110.5(c-30)，150.5(c-20)处观察到2组端烯碳信号；在δ
c 172.9(c-3)，178.7(c-28)处观察到1个酯基和1个羧基碳信号。
[0191]
综上所述，对比化合物14与chiisanogenin(triterpene components from the leaves of acanthopanax sessiliflorus seem[j].ryoo h s,chang s y,yook c s,et al.korean journal of pharmacognosy,2003,34(4):269-273.)的1h-nmr和
13
c-nmr谱数据，两者极其吻合，因此，详细归属其1d-nmr数据(见表15)，并确定化合物14为
chiisanogenin(化学结构见图2)。
[0192]
表15化合物14的1h-nmr与
13
c-nmr核磁数据归属(600和150mhz,c5d5n)
[0193][0194]
1.4.5化合物15的结构鉴定
[0195]
化合物15为白色无定形粉末，溶于吡啶，hr-esi-ms中[m+h]
+
峰为m/z 939.4953(计算值为c
48h75o18+
,939.4953)，推测其分子式为c
48h74o18
，不饱和度为12。
[0196]
化合物15在1h-nmr(600mhz,c5d5n)谱中可观察到6个甲基氢质子信号：δ
h 0.99，1.01，1.01，1.63，1.67分别是c-27，c-25，c-26，c-29，c-24位羽扇豆烷型三萜母核结构特征甲基峰，δ
h 1.69(3h,d,j＝6.1hz,h-6”')为鼠李糖甲基氢质子信号。在δ
h 4.72(1h,brs,h-23a)，4.88(1h,brs,h-23b)，4.59(1h,brs,h-30a)，4.85(1h,brd,j＝1.5hz,h-30b)处观察到2组端烯氢质子信号。此外，还存在2分子葡萄糖和1分子鼠李糖端基氢质子信号：δ
h 6.33(1h,d,j＝8.2hz,h-1')，4.92(1h,d,j＝7.7hz,h-1”)，5.83(1h,s,h-1”')。
[0197]
在化合物15的
13
c-nmr(150mhz,c5d5n)谱中共显示出48个碳信号，在δ
c 13.7(c-27)，17.6(c-26)，18.4(c-6”')，18.8(c-29)，18.8(c-25)，23.6(c-24)处观察到6个甲基碳信号；δc114.1(c-23)，147.2(c-4)，110.7(c-30)，150.0(c-20)处观察到2组端烯碳信号；在δ
c 175.7(c-3)，174.9(c-28)处观察到2个酯基碳信号。此外，在δ
c 95.3(c-1')，104.9(c-1”)，102.6(c-1”')处分别为2分子葡萄糖和1分子鼠李糖端基碳信号。
[0198]
综上所述，对比化合物15与1-deoxychiisanoside(new 3,4-seco-lupane-type triterpene glycosides from acanthopanax senticosus forma inermis[j].park s y,chang s y,yook c s,et al.journal of natural products,2000,63(12):1630-1633.)的1h-nmr和
13
c-nmr数据，两者极其吻合。但由于仅有的文献中1h-nmr数据归属较少，故进行nmr测试，通过hsqc谱详细归属其1d-nmr数据(见表16)，并确定化合物15为1-deoxychiisanoside(化学结构见图2)。
[0199]
表16化合物15的1h-nmr与
13
c-nmr核磁数据归属(600和150mhz,c5d5n)
[0200][0201][0202]
1.4.6化合物16的结构鉴定
[0203]
化合物16为白色无定形粉末，溶于吡啶，hr-esi-ms中[m+h]
+
峰为m/z 647.3798(计算值为c
36h55o10+
,647.3795)，推测其分子式为c
36h54o10
，不饱和度为10。
[0204]
化合物16在1h-nmr(600mhz,c5d5n)谱中可观察到5个甲基氢质子信号：δ
h 0.97，1.03，1.09，1.65，1.86分别是c-25，c-27，c-26，c-29，c-24位羽扇豆烷型三萜母核结构特征甲基峰；在δ
h 3.71(1h,br dd,j＝1.6,7.4hz,h-1)和4.52(1h,q,j＝9.7hz,h-11)处观察到2个连氧次甲基氢质子信号；在δ
h 5.01(1h,brs,h-23a)，5.11(1h,br s,h-23b)，4.61(1h,brs,h-30a)，4.87(1h,br s,h-30b)处观察到2组端烯氢质子信号。此外，还存在1分子葡萄糖端基氢质子信号：δ
h 6.43(1h,d,j＝8.2hz,h-1')。
[0205]
在化合物16的
13
c-nmr(150mhz,c5d5n)谱中共显示出36个碳信号，在δ
c 13.7(c-27)，17.8(c-26)，18.8(c-29)，18.9(c-25)，23.4(c-24)处观察到5个甲基碳信号；在δ
c 70.4(c-1)和75.2(c-11)处观察到2个连氧次甲基碳信号；δ
c 113.8(c-23)，147.7(c-4)，110.7(c-30)，150.1(c-20)处观察到2组端烯碳信号；在δ
c 172.9(c-3)，174.9(c-28)处观察到2个酯基碳信号。此外，在δ
c 95.4(c-1')处为1分子葡萄糖端基碳信号。
[0206]
综上所述，对比化合物16与sessiloside-a1(a new 3,4-seco-lupane triterpenene glycosyl ester from the leaves of eleutherococcussessiliflorus
letters,2001,42(15):2825-2828.)的
13
c-nmr数据，两者极其吻合。但仅有的文献缺乏1h-nmr数据，因此我们对其进行2d-nmr测试，并详细归属其1d-nmr数据(见表18)。此外，我们还在24℃下其甲醇溶剂中获得单晶，通过ga kαx-单晶衍射[flack：0.03(5)]确定了化合物17的绝对构型分别为1r、5r、8r、9r、13r、14r、17s、18r、19r、1's、2'r、3's、4's、5'r(图5)。综合各种分析结果，确定化合物17为sachunogenin 3-o-glucoside(化学结构见图2)。
[0215]
表18化合物17的1h-nmr与
13
c-nmr核磁数据归属(600和150mhz,c5d5n)
[0216][0217][0218]
1.4.8化合物18的结构鉴定
[0219]
化合物18为白色无定形粉末，溶于吡啶，hr-esi-ms中[m+h]
+
峰为m/z 971.5216(计算值为c
49h79o19+
,971.5216)，推测其分子式为c
49h78o19
，不饱和度为11。
[0220]
化合物18在1h-nmr(600mhz,c5d5n)谱中可观察到7个甲基氢质子信号：δ
h 1.10，1.17，1.18，1.66，1.78分别是c-27，c-25，c-26，c-29，c-24位羽扇豆烷型三萜母核结构特征甲基峰，δ
h 1.67(3h,d,j＝6.3hz,h-6”')为鼠李糖甲基氢质子信号，δ
h 3.57(3h,d,j＝1.1hz,h-1
””
)处为连氧甲基氢质子信号。在δ
h 4.12(1h,overlap,h-11)处观察到1个连氧次甲基氢质子信号；在δ
h 4.85(1h,brs,h-23a)，4.94(1h,brs,h-23b)，4.60(1h,brs,h-30a)，4.78(1h,br s,h-30b)处观察到2组端烯氢质子信号。此外，还存在2分子葡萄糖和1分子鼠李糖端基氢质子信号：δ
h 6.29(1h,d,j＝7.9hz,h-1')，4.92(1h,d,j＝8.2hz,h-1”)，5.82(1h,s,h-1”')。
[0221]
在化合物18的
13
c-nmr(150mhz,c5d5n)谱中共显示出49个碳信号，在δ
c 14.6(c-27)，17.2(c-26)，18.4(c-6”')，19.4(c-29)，20.8(c-25)，23.6(c-24)，51.0(c-1
””
)处观察到7个甲基碳信号；且δc51.0(c-1
””
)处为1个连氧甲基碳信号；在δ
c 69.5(c-11)处观察到1个连氧次甲基碳信号；δ
c 113.8(c-23)，148.2(c-4)，110.1(c-30)，150.3(c-20)处观察到2组端烯碳信号；在δ
c 174.8(c-3)，175.2(c-28)处观察到2个酯基碳信号。此外，在δ
c 95.1
(c-1')，104.9(c-1”)，102.6(c-1”')处分别为2分子葡萄糖和1分子鼠李糖端基碳信号。
[0222]
综上所述，对比化合物18与inermoside(new 3,4-seco-lupane-type triterpene glycosides from acanthopanax senticosus forma inermis[j].park s y,chang s y,yook c s,et al.journal of natural products,2000,63(12):1630-1633.)的1h-nmr和
13
c-nmr数据，两者极其吻合。但由于仅有的文献中1h-nmr数据归属较少，故参考结构类似的elesesterpene c(elesesterpenes a
–
k:lupane-type triterpenoids from the leaves of eleutherococcussessiliflorus[j].han d,liu y,li x m,et al.frontiers in chemistry,2021,9:813764.)，详细归属其1d-nmr数据(见表19)，并确定化合物18为inermoside(化学结构见图2)。
[0223]
表19化合物18的1h-nmr与
13
c-nmr核磁数据归属(600和150mhz,c5d5n)
[0224][0225]
1.4.9化合物19的结构鉴定
[0226]
化合物19为白色无定形粉末，溶于吡啶，hr-esi-ms中[m+h]
+
峰为m/z 987.5174(计算值为c
49h79o20+
,987.5165)，推测其分子式为c
49h78o20
，不饱和度为11。
[0227]
化合物19在1h-nmr(600mhz,c5d5n)谱中可观察到8个甲基氢质子信号：δ
h 1.12，
1.15，1.17，1.31，1.38，1.69分别是c-27，c-23，c-26，c-25，c-24，c-29位羽扇豆烷型三萜母核结构特征甲基峰，δ
h 1.70(3h,d,j＝6.2hz,h-6”')为鼠李糖甲基氢质子信号，δ
h 3.62(3h,s,h-1
””
)为1个连氧甲基氢质子信号。在δ
h 4.86(1h,dd,j＝2.6,11.5hz,h-1)和4.15(1h,m,h-11)处观察到2个连氧次甲基氢质子信号；在δ
h 4.63(1h,brs,h-30a)，4.80(1h,br s,h-30b)处观察到1组端烯氢质子信号。此外，还存在2分子葡萄糖和1分子鼠李糖端基氢质子信号：δ
h 6.33(1h,d,j＝8.2hz,h-1')，4.94(1h,d,j＝8.3hz,h-1”)，5.84(1h,s,h-1”')。
[0228]
在化合物19的
13
c-nmr(150mhz,c5d5n)谱中共显示出49个碳信号，在δ
c 15.1(c-27)，17.8(c-26)，18.4(c-6”')，19.1(c-25)，19.4(c-29)，24.8(c-23)，32.5(c-24)，51.0(c-1
””
)处观察到8个甲基碳信号；且δc51.0(c-1
””
)为1个连氧甲基碳信号；在δ
c 87.1(c-1)和67.5(c-11)处观察到2个连氧次甲基碳信号；在δ
c 79.2(c-4)处观察到1个连氧季碳信号；δ
c 110.1(c-30)，150.4(c-20)处观察到1组端烯碳信号；在δ
c 173.4(c-3)，174.8(c-28)处观察到2个酯基碳信号。此外，在δ
c 95.2(c-1')，105.0(c-1”)，102.6(c-1”')处分别为2分子葡萄糖和1分子鼠李糖端基碳信号。
[0229]
综上所述，对比化合物19与文献中化合物2(3,4-seco-lupane type triterpene glycosyl esters from a korean medicinal plant,acanthopanax chiisanensis(araliaceae)[j].kasai r,matsumoto k,taniyasu s,et al.chemical and pharmaceutical bulletin,2008,34(8):3284-3289.)的1h-nmr和
13
c-nmr数据，两者极其吻合。但由于仅有的文献缺少氢谱数据归属及化合物命名，故参考结构类似的elesesterpene k(elesesterpenes a
–
k:lupane-type triterpenoids from the leaves of eleutherococcussessiliflorus[j].han d,liu y,li x m,et al.frontiers in chemistry,2021,9:813764.)，详细归属其1d-nmr数据(见表20)，并将化合物19命名为3-methylisochiisanoside(化学结构见图2)。
[0230]
表20化合物19的1h-nmr与
13
c-nmr核磁数据归属(600和150mhz,c5d5n)
[0231]
2111728.1.6.2 elesesterpene l(6)
[0238]
empirical formula:c
30h44
o6,m＝500.65,t＝173k,v＝2572.91(19),d
calcd
＝1.292g/cm3,z＝4,orthorhombic,p212121,α＝β＝γ＝90
°
,f(000)＝1088,gof＝1.060,2.993
°
≤θ≤60.319
°
,-8≤h≤8,-20≤k≤19,-33≤l≤31,data/restraints/parameters 5728/0/332,final r indices r1＝0.0339(wr2＝0.0856)[i＞2σ(i)]for 5728 independent reflections[r
int
＝0.0548],r indices(all data)r1＝0.0379(wr2＝0.0879)for reflections collected.flack parameter:0.07(8).the deposited number ccdc of 6in the cambridgecrystallographic data centre is 2128246.
[0239]
1.6.3elesesterpene m(7)
[0240]
empirical formula:2(c
30h46
o6),5.5(h2o),m＝1104.42,t＝173 k,v＝6039.7(8),d
calcd
＝1.215 g/cm3,z＝4,orthorhombic,p212121,,α＝β＝γ＝90
°
,f(000)＝2412,gof＝1.033,2.909
°
≤θ≤60.345
°
,-16≤h≤16,-18≤k≤18,-40≤l≤42,data/restraints/parameters 13564/25/772,final r indices r1＝0.0395(wr2＝0.1060)[i＞2σ(i)]for 13564 independent reflections[r
int
＝0.0567],r indices(all data)r1＝0.0447(wr2＝0.1101)for reflections collected.flack parameter:0.14(5).the deposited number ccdc of 7in the cambridgecrystallographic data centre is 2128214.
[0241]
1.6.4sachunogenin 3-o-glucoside(17)
[0242]
empirical formula:c
36h54
o9,1.5(h2o),m＝657.81,t＝173k,v＝3516.3(3),d
calcd
＝1.243g/cm3,z＝4,tetragonal,p41,,α＝β＝γ＝90
°
,f(000)＝1428,gof＝1.028,2.343
°
≤θ≤60.28
°
,-29≤h≤28,-28≤k≤29,-8≤l≤8,data/restraints/parameters 7852/13/453,final r indices r1＝0.0481(wr2＝0.1220)[i＞2σ(i)]for 7852 independent reflections[r
int
＝0.0473],r indices(all data)r1＝0.0516(wr2＝0.1252)for reflections collected.flack parameter:0.03(5).the deposited number ccdc of 17in the cambridgecrystallographic data centre is 2128244.
[0243]
实施例2、无梗五加叶化学成分体外抗hfls-ra增殖活性研究
[0244]
2.1实验仪器与材料
[0245]
2.1.1仪器
[0246][0247]
2.1.2材料
空白组)
×
100％
[0264]
2.2.4统计分析
[0265]
实验数据以表示，采用spss 25.0统计软件进行分析。
[0266]
2.3实验结果
[0267]
2.3.1化合物对tnf-α诱导hfls-ra增殖的影响
[0268]
通过与正常对照组比较，诱导组的hfls-ra增殖活力显著升高，tnf-α能促进hfls-ra的增殖；与诱导组相比，在给药浓度为20μmol/l时，各化合物均能不同程度的抑制tnf-α诱导的hfls-ra增殖。其中，化合物7、13-14、19的抑制作用显著，差异具有统计学意义。详见表21
[0269]
表21化合物1-19(20μmol/l)对hfls-ra增殖的影响(均数
±
标准差)
[0270][0271]
注：a：与正常对照组比，p＜0.05；b：与诱导组比，p＜0.01；c：与诱导组比，p＜0.05；d：与诱导组比，p＞0.05；1：测试批次1；2：测试批次2。
[0272]
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。