一种VHH抗体或其抗原片段的突变体及其应用的制作方法

一种vhh抗体或其抗原片段的突变体及其应用
技术领域
1.本发明涉及纳米抗体技术领域，具体而言，涉及一种抗体或其抗原结合片段、以及所述抗体或其抗原结合片段的制备方法和应用。


背景技术：

2.垂体前叶激素包括人绒毛膜促性腺激素(hcg)、促卵泡激素(fsh)、促卵泡激素ctp融合蛋白(fsh-ctp)、人促黄体生成素(hlh)、垂体前叶分泌的激素(tsh)，均是由α和β二个单位通过离子键和疏水键结合在一起，其中α亚单位是垂体前叶激素所共有的亚基，而β亚单位则存在差异，在免疫活性上可予区别。
3.hcg是由胎盘绒毛膜的合体滋养层产生的一种糖蛋白。血清中的hcg水平检查，可以为早期妊娠的诊断及异位妊娠、葡萄胎、不完全流产、精原细胞睾丸癌等与hcg相关性疾病的诊断、鉴别诊断及判断预后提供临床依据。
4.fsh是由脑垂体前叶释放的促性腺激素，对女性的卵泡发育成熟和男性的精子发育具有重要意义。测定血清促卵泡激素对了解垂体内分泌功能，间接了解下丘脑及卵巢的功能状态、预测排卵时间、对不孕和内分泌疾病的诊断治疗都有重要的意义。fsh-ctp是指fsh的ctp融合蛋白，其作用为延长fsh的体内半衰期。
5.hlh是由腺垂体分泌的一种促性腺激素，它的主要作用于性腺，导致卵泡成熟，以及进一步分泌雄激素，排卵以及黄体的生成和维持。在临床上可以用来鉴别闭经的原因，监测排卵期等。排卵期的监测有助于不孕不育的诊断和研究避孕药物的作用机制。
6.tsh是垂体前叶分泌的激素之一，其主要功能是控制、调节甲状腺的活动。测定血清(浆)中的促甲状腺激素是诊断和治疗甲状腺功能亢进症和甲状腺功能减低症以及研究下丘脑-垂体-甲状腺轴的重要指标之一。在诊断甲状腺功能低下和鉴别诊断原发性和继发(下丘脑性或垂体性)甲状腺功能低下等方面是不可缺少的工具。甲状腺功能亢进症和甲状腺功能减低症治疗时，其tsh可作为疗效的判断指标。此外还可用于观察垂体tsh的储备功能，并可进一步区别下丘脑和垂体的病变。tsh检测是查明甲状腺功能的初筛试验。游离甲状腺浓度的微小变化就会带来tsh浓度向反方向的显著调整。
7.这类激素在血液中的含量低，需要灵敏、高效、稳定性高的检测抗体，以有效检测或者监控血液中激素的含量。现有技术的相关抗体存在结合活性低等缺陷，没有能够高效结合hcg、fsh、hlh、tsh、fsh-ctp等共有α链的抗体。
8.羊驼血清中存在的一种天然缺失轻链的抗体，即重链抗体(heavy-chainantibody，hcab)。而单域重链抗体(single domain antibody，sdab)是指仅由重链抗体可变区(variable region)组成的基因工程抗体，又称为vhh抗体(variable domain of heavychain of heavy-chain antibody，vhh antibody)或纳米抗体(nanobody，nb)或单域抗体。与传统抗体相比，单域抗体具有分子量小，稳定性高，水溶性好等优点。


技术实现要素：

9.本发明实际所要解决的技术问题是为了克服现有技术中抗体与诸如fsh、hcg、tsh、hlh、fsh-ctp等包含α链(seq id no:1)的异二聚体蛋白结合活性差等缺陷，本发明提供了一种抗体或其抗原结合片段以及其制备方法、其在检测上述异二聚体蛋白、或在制备药物中的应用。本发明的抗体对包含如seq id no:1所示序列的蛋白分子(例如fsh、hcg、tsh、hlh、fsh-ctp等)结合活性较好、灵敏度高，检测例如fsh、hcg、tsh、hlh、fsh-ctp等包含如seq id no:1所示序列的蛋白分子时方法便捷、操作简单。
10.本发明第一方面提供一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体包括重链可变区(vhh)，其中，所述重链可变区包括以下根据kabat编号的互补决定区(cdr)或其突变：氨基酸序列如seq id no:9所示的cdr1；氨基酸序列如seq id no:13所示的cdr2；和，氨基酸序列如seq id no:11或14所示的cdr3；其中，所述突变为在所述vhh的cdr1、cdr2、cdr3的氨基酸序列的基础上分别具有5、4、3、2或1个氨基酸的插入、缺失或替换。
11.较佳地，所述cdr1的突变为在如seq id no:9所示的氨基酸序列上具有r2n/g、t3l、f4v/a、s5d、s6v/r/g/n、y7d/h，和/或a8n/d的氨基酸替换，其氨基酸序列优选如seq id no:12、15、18、21、22、25任一所示；所述cdr2的突变为在如seq id no:13所示的氨基酸序列上具有m2t/s/n、w3q、d6g、和/或s7n的氨基酸替换，其氨基酸序列优选如seq id no:10、16、19、23、26任一所示；所述cdr3的突变为在如seq id no:14所示的氨基酸序列上具有l4i/t或缺失、q5d、e6g/v、和/或e7q/s/p的氨基酸替换，或为在如seq id no:11所示的氨基酸序列上具有g9d和/或y14f的氨基酸替换，其氨基酸序列优选如seq id no:17、20、24、27任一所示。
12.在某一较佳实施例中，所述重链可变区包括以下序列：如seq id no:9所示的cdr1氨基酸序列；如seq id no:10所示的cdr2氨基酸序列；和，如seq id no:11所示的cdr3氨基酸序列。
13.在某一较佳实施例中，所述重链可变区包括以下序列：如seq id no:12所示的cdr1氨基酸序列；如seq id no:13所示的cdr2氨基酸序列；和，如seq id no:14所示的cdr3氨基酸序列。
14.在某一较佳实施例中，所述重链可变区包括以下序列：如seq id no:15所示的cdr1氨基酸序列；如seq id no:16所示的cdr2氨基酸序列；和，如seq id no:17所示的cdr3氨基酸序列。
15.在某一较佳实施例中，所述重链可变区包括以下序列：如seq id no:18所示的cdr1氨基酸序列；如seq id no:19所示的cdr2氨基酸序列；和，如seq id no:20所示的cdr3氨基酸序列。
16.在某一较佳实施例中，所述重链可变区包括以下序列：如seq id no:21所示的cdr1氨基酸序列；如seq id no:13所示的cdr2氨基酸序列；和，如seq id no:14所示的cdr3氨基酸序列。
17.在某一较佳实施例中，所述重链可变区包括以下序列：如seq id no:22所示的cdr1氨基酸序列；如seq id no:23所示的cdr2氨基酸序列；和，如seq id no:24所示的cdr3氨基酸序列。
18.在某一较佳实施例中，所述重链可变区包括以下序列：如seq id no:25所示的
cdr1氨基酸序列；如seq id no:26所示的cdr2氨基酸序列；和，如seq id no:27所示的cdr3氨基酸序列。
19.具体可参见表1。
20.表1：不同抗体对应的cdr序列(根据kabat定义规则)
[0021][0022]
本领域人员公知，在本领域中可以通过多种方法来定义抗体的cdr，例如基于序列可变性的kabat定义规则(参见，kabat等人，免疫学的蛋白质序列，第五版，美国国立卫生研究院，贝塞斯达，马里兰州(1991))和基于结构环区域位置的chothia定义规则(参见j mol biol 273:927-48,1997)等。在本技术中，上述所列cdr的氨基酸序列是按照kabat定义规则所示出的，但是本领域技术人员应当理解的是，除非另有规定，否则术语给定抗体或其区(例如可变区)的“cdr”及“互补决定区”应了解为涵盖如通过本领域技术人员已知cdr定义规则的任何一种界定的互补决定区。虽然本发明中请求保护的范围是基于kabat定义规则所示出的序列，但是根据其他cdr的定义规则所对应的氨基酸序列也应当落在本发明的保护范围中。
[0023]
所述重链可变区较佳地还包括羊驼抗体或人抗体的框架区(fwr)。
[0024]
较佳地，所述抗体或其抗原结合片段为vhh、重链抗体、双特异性抗体或多特异性抗体，优选为vhh。
[0025]
更佳地，所述vhh包括如seq id no:2-8任一所示的氨基酸序列。
[0026]
在某一较佳实施例中，所述vhh为如seq id no:2-8所示的任一所示的氨基酸序列。
[0027]
在某一较佳实施例中，所述抗体或其抗原结合片段靶向含有如seq id no:1所示的氨基酸序列的蛋白，所述含有如seq id no:1所示的氨基酸序列的蛋白优选自fsh、hcg、tsh、fsh-ctp和hlh中的一种或多种。
[0028]
本发明第二方面提供一种分离的核酸，其编码如本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段。
[0029]
所述核酸的制备方法为本领域常规的制备方法，较佳地，包括以下的步骤：通过基因克隆技术获得编码上述抗体的核酸分子，或者通过人工全序列合成的方法得到编码上述抗体的核酸分子。
[0030]
本领域技术人员知晓，编码上述抗体的氨基酸序列的碱基序列可以适当引入替换、缺失、改变、插入或增加来提供一个多聚核苷酸的同系物。本发明中多聚核苷酸的同系物可以通过对编码该抗体序列基因的一个或多个碱基在保持抗体活性范围内进行替换、缺失或增加来制得。
[0031]
本发明第三方面提供一种重组表达载体，其包含如本发明第二方面所述的分离的核酸。
[0032]
所述重组表达载体可通过本领域常规方法获得，即：将本技术所述的核酸分子连接于各种表达载体上构建而成。所述的表达载体为本领域常规的各种载体，只要其能够容载前述核酸分子即可。较佳地，所述重组表达载体为质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体，所述病毒载体优选逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体或腺相关病毒载体。
[0033]
本发明第四方面提供一种转化体，其为在宿主细胞中包含如本发明第三方面所述的重组表达载体。
[0034]
所述转化体的制备方法可为本领域常规的制备方法，例如为：将上述重组表达载体转化至宿主细胞中制得。所述转化体的宿主细胞为本领域常规的各种宿主细胞，只要能满足使上述重组表达载体稳定地自行复制，且所携带所述的核酸可被有效表达即可。将前述重组表达质粒转化至宿主细胞中，即可得本发明优选的重组表达转化体。其中所述转化方法为本领域常规转化方法，较佳地为化学转化法，热激法或电转法。
[0035]
较佳地，所述宿主细胞为酵母例如酿酒酵母、霉菌、细菌或细胞表达系统。
[0036]
本发明第五方面提供一种嵌合抗原受体，其包含如本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段。
[0037]
本发明第六方面提供一种基因修饰的细胞，其包含如本发明第五方面所述的嵌合抗原受体。
[0038]
优选地，所述基因修饰的细胞为真核细胞，优选分离的人细胞；更优选免疫细胞如t细胞，或nk细胞。
[0039]
本发明第七方面提供一种如本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段的制备方法，其包含以下步骤：培养如本发明第四方面所述的转化体，从培养物中获得所述抗体或其抗原结合片段。
[0040]
本发明第八方面提供一种抗体药物偶联物，包括抗体部分和偶联部分，所述抗体部分包含如本发明第一方面所述抗体或其抗原结合片段。
[0041]
优选地，所述偶联部分包括可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、酶、或其组合，所述抗体部分和偶联部分通过化学键或接头进行偶联。
[0042]
本发明第九方面提供一种药物组合物，其包含如本发明第一方面所述抗体或其抗原结合片段、如本发明第五方面所述的嵌合抗原受体、如本发明第六方面所述的基因修饰的细胞和/或如本发明第八方面所述的抗体药物偶联物。
[0043]
优选地：
[0044]
所述药物组合物还包括药学上可接受的载体；和/或，所述药物组合物为液体剂型、气体剂型、固体剂型和半固体剂型，和/或，所述药物组合物可通过口服给药、注射给药、经鼻给药、经皮给药或粘膜给药。
[0045]
本发明第十方面提供一种套装药盒，其包含药盒a和药盒b，其中：
[0046]
所述药盒a含有如本发明第一方面所述抗体或其抗原结合片段、如本发明第五方面所述的嵌合抗原受体、如本发明第六方面所述的基因修饰的细胞、如本发明第八方面所述的抗体药物偶联物和/或如本发明第九方面所述的药物组合物；
[0047]
所述药盒b含有选自由激素制剂、靶向小分子制剂、蛋白酶体抑制剂、成像剂、诊断剂、化疗剂、放射治疗剂、免疫抑制剂、溶瘤药物、细胞毒性剂、细胞因子、共刺激分子的激活剂、抑制性分子的抑制剂以及疫苗组成的群组中的一种或多种。
[0048]
本发明第十一方面提供一种试剂盒，其包括如本发明第一方面所述抗体或其抗原结合片段、如第五方面所述的嵌合抗原受体、如第六方面所述的基因修饰的细胞、如第八方面所述的抗体药物偶联物和/或如第九方面所述的药物组合物。
[0049]
优选地，所述试剂盒还包括(i)施用抗体或其抗原结合片段或嵌合抗原受体或基因修饰的细胞或抗体药物偶联物或药物组合物的装置；和/或(ii)使用说明。
[0050]
本发明第十二方面提供一种如本发明第一方面所述抗体或其抗原结合片段、如本发明第五方面所述的嵌合抗原受体、如本发明第六方面所述的基因修饰的细胞、如本发明第八方面所述的抗体药物偶联物、如本发明第九方面所述的药物组合物、如本发明第十方面所述的套装药盒和/或如本发明第十一方面所述的试剂盒在制备治疗和/或预防含有如seq id no:1所示的氨基酸序列的蛋白介导的疾病或病症的药物中的应用。
[0051]
较佳地，所述含有如seq id no:1所示的氨基酸序列的蛋白选自fsh、hcg、tsh、fsh-ctp和hlh中的一种或多种。
[0052]
本发明第十三方面提供一种如本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段在检测含有如seq id no:1所示氨基酸序列的蛋白中的应用。
[0053]
较佳地，所述蛋白选自fsh、hcg、tsh、fsh-ctp和hlh中的一种或多种。
[0054]
本发明第十四方面提供一种检测含有如seq id no:1所示氨基酸序列的蛋白的方法，其包括使用如本发明第一方面所述抗体或其抗原结合片段、如本发明第五方面所述的嵌合抗原受体、如本发明第六方面所述的基因修饰的细胞、如本发明第八方面所述的抗体药物偶联物、如本发明第九方面所述的药物组合物、如本发明第十方面所述的套装药盒和/或如本发明第十一方面所述的试剂盒进行检测的步骤。
[0055]
本技术中，术语“多特异性抗体”按其最广义使用，涵盖具有多表位特异性的抗体。这些多特异性抗体包括但不限于：包含重链可变区(vh)的抗体，其中该vh单元具有多表位特异性；具有两个或多个vh区的抗体，每个vh单元与不同的靶点或同一个靶点的不同表位结合；具有两个或更多个单可变区的抗体，每个单可变区与不同的靶点或同一个靶点的不同的表位结合；全长抗体、抗体片段、双特异性抗体(diabodies)、和三抗体(triabodies)、共价或非共价连接在一起的抗体片段等。
[0056]
本技术中，所述的“重链抗体”指的是只包含一个重链可变区(vhh)和两个常规的ch2与ch3区的抗体，又称为hcabs。
[0057]
本技术中，所述的“vhh(单域抗体)”，又称为“纳米抗体”，指的是从重链抗体中克隆出来的vhh结构，是已知的可结合目标抗原的最小单位。
[0058]
本发明的积极进步效果在于：
[0059]
本发明的抗体对包含如seq id no:1所示序列的蛋白分子(例如fsh、hcg、tsh、hlh、fsh-ctp等)的结合活性好、灵敏度高。该抗体在检测例如fsh、hcg、tsh、hlh、fsh-ctp等包含如seq id no:1所示序列的蛋白分子时方法便捷、操作简单。
附图说明
[0060]
图1为vhh提取rna反转录后一轮扩增电泳图，其中m代表marker，泳道1-5分别代表5组rna抽提。
[0061]
图2为vhh提取rna反转录后二轮扩增电泳图，其中m代表marker，泳道1-2分别代表
图1中泳道1和2切胶回收后的第二轮pcr扩增电泳图。
[0062]
图3为vhh提取rna建库库容滴度平板图。
[0063]
图4为菌落pcr鉴定文库目的基因插入率。
[0064]
图5为不同结合α亚基的vhh表达，泳道1-7分别对应蛋白2-8的结果。
具体实施方式
[0065]
本发明使用hcg免疫双峰驼，随后利用该骆驼外周血淋巴细胞建立了针对hcg重链抗体vhh噬菌体文库。随后试验中分别将hcg和hlh包被在酶标板上，利用噬菌体展示技术筛选免疫性的纳米抗体噬菌体文库，从而获得了针对hcg和hlh共有α链的特异性纳米抗体基因，将此基因转至大肠杆菌中，从而建立了能在大肠杆菌中高效表达的纳米抗体株，并进行基因序列鉴定。
[0066]
实施例1：免疫动物及噬菌体文库构建
[0067]
1、免疫动物
[0068]
取健康成年羊驼，将hcg与佐剂混合，采取皮下注射方式进行免疫，免疫程序如表2所示，第三次加强免疫后第七天，采集羊驼外周血，用于构建噬菌体展示文库。
[0069]
表2免疫程序
[0070] 初次免疫加强免疫1加强免疫2加强免疫3免疫时间第0天第21天第42天第63天免疫剂量(mg)0.50.250.250.25佐剂弗氏不完全佐剂弗氏不完全佐剂弗氏不完全佐剂弗氏不完全佐剂免疫方式皮下皮下皮下皮下
[0071]
2、羊驼淋巴细胞分离：
[0072]
在15ml离心管中加入6ml淋巴细胞分离液，再加入等体积的全血样品，800g常温离心20min；小心吸取中间层悬浮的白细胞至一新的离心管中，加入2倍体积的pbs，800g常温离心15min；小心弃上清，加入红细胞裂解液，裂解红细胞；450g常温离心15min，去上清并计数，按107个淋巴细胞加入2ml trizol充分裂解，备用。
[0073]
3、总共rna抽提
[0074]
向上述裂解液中加入1/5体积的氯仿，剧烈震荡20s充分乳化，冰上静止10min；4℃、12000g离心10min，取上清转移至另一新鲜离心管中；加入等体积的异丙醇，充分混匀后冰上静止10min；4℃、12000g离心10min，弃上清，加入75％的乙醇，充分混匀；4℃、12000g离心10min，去上清；室温干燥5min，加入适量rnase-free水溶解沉淀，待rna沉淀完全溶解后于-80℃保存。
[0075]
4、抗体基因扩增
[0076]
巢氏第一轮pcr体系如下表3所示：
[0077]
表3
[0078][0079]
反应程序：94℃、5min；98℃、10s，50℃、15s，72℃、1min，共30循环；反应结束后，凝胶电泳，割胶回收700bp左右的目的片段。其中，alpvh-ld序列(5
’‑3’
)如下：cttggtggtcctggctgc(seq id no:28)；ch
2-r序列(5
’‑3’
)如下：ggtacgtgctgttgaactgttcc(seq id no:29)。结果如图1所示。
[0080]
巢氏第二轮pcr如下表4所示：94℃、5min；98℃、10s，57℃、15s，72℃、45s，共30循环。
[0081]
表4
[0082][0083][0084]
其中，alpvh-f1序列(5
’‑3’
)(seq id no:30)如下：
[0085]
catgccatgactgtggcccaggcggcccagktgcagctcgtggagtc；
[0086]
alpvhh-r1(5
’‑3’
)序列(seq id no:31)如下：
[0087]
catgccatgactcgcggccggcctggccatgggggtcttcgctgtggtgcg；
[0088]
alpvhh-r2(5
’‑3’
)序列(seq id no:32)如下：
[0089]
catgccatgactcgcggccggcctggccgtcttgtggttttggtgtcttggg。
[0090]
第二轮反应结束后，凝胶电泳(如图2所示)后，割胶回收目的片段，进行双酶切。
[0091]
5、文库构建
[0092]
5.1载体和目的片段酶切
[0093]
目的片段双酶切体系(160μl体系)如表5所示：
[0094]
表5
[0095][0096]
载体双酶切体系(160μl)如表6所示：
[0097]
表6
[0098][0099]
5.2载体与目的片段的连接的体系如表7所示：
[0100]
表7
[0101][0102][0103]
16℃连接过夜，加入5μl(1/10量)的3m ch3coona(ph 5.2)和125μl(2.5倍量)的冷无水乙醇，-20℃静置30-60min，12000g离心回收沉淀，用70％的冷乙醇清洗沉淀，室温干燥，溶于15μl去离子水中。
[0104]
6.电转化
[0105]
共进行了10次电击转化，电击之后立即向电击杯中加入1ml 2yt培养基(37℃预热)复苏，吸出电击产物并用2yt培养基洗净电击杯，共计获得100ml复苏产物，37℃、180rpm复苏45min，取100μl梯度稀释至10-3
和10-4
测定库转化子数目，涂布于90mm的平板上，其余离心，加入8ml 2yt重悬，涂布于8块200mm的平板上。第二天在测定库转化子数目的平板上f混引物文库10-4
共有132个克隆，库容为1.32
×
109(132
×
1000
×
104)；fnew引物文库10-4
共有110个克隆，1.1
×
109(110
×
1000
×
104)，如图3所示。
[0106]
7.菌落pcr验证插入率
[0107]
随机从测库容滴度平板上挑取48个克隆进行鉴定，结果表明插入率均为100％，如图4所示，其中目的基因条带为700bp，marker条带大小一次为5000、3000、2000、1500、1000、750、500、250、100bp。
[0108]
实施例2：抗体筛选
[0109]
1、亲和淘选
[0110]
1)将hcg抗原用ph值为9.6的碳酸盐缓冲液稀释至终浓度为5μg/ml，按100μl/孔加入酶标孔中，每个靶分子包被8孔(第二轮筛选包被4孔)，4℃包被过夜；
[0111]
2)弃包被液，pbs洗涤3次，每孔加入300μl 3％bsa-pbs封闭液，37℃封闭1h；
[0112]
3)pbs洗涤3次，加入100μl噬菌体文库，37℃孵育1h；
[0113]
5)吸出未结合的噬菌体，用pbst洗涤6次，pbs洗涤2次；
[0114]
6)加入100μl gly-hcl洗脱液，37℃孵育8min，洗脱特异性结合的噬菌体；将该洗脱液转移至1.5ml无菌离心管中，迅速用10μl tris-hcl中和缓冲液中和；
[0115]
7)取10μl进行梯度稀释，测定滴度，计算淘选回收率，其余洗脱物混合后进行扩增和纯化，用于下一轮亲和淘选，改变淘选条件，每一轮淘选条件如表8。
[0116]
表8亲和淘选条件
[0117][0118]
表9以hcg为靶蛋白的酸洗脱二轮筛选回收量
[0119][0120]
回收率＝回收量/文库投入量；富集度＝后一轮回收率/上一轮回收率。
[0121]
2、淘选后文库的扩增
[0122]
1)将淘选洗脱物与处于对数生长前期的e.coli 2738培养物(new england biolabs)5ml混匀，37℃，静置15min，220r/min振荡培养45min；1000g离心15min，去上清，用500μl 2
×
yt重悬涂布于200mm 2
×
yt-ga平板；
[0123]
2)用10ml 2
×
yt液体培养基刮菌，取500μl悬液加入50ml 2
×
yt液体培养基中，37℃振摇30min；按cell:phage＝1:20的比例加入m13k07辅助噬菌体(addgene，货号：#119819)，37℃静置30min，220r/min振摇培养30min；将培养物分装于离心管中，25℃、5000r/min离心10min，细胞沉淀以50ml 2
×
yt-ak液体培养基重悬，30℃、230r/min振荡培养过夜；
[0124]
3)将过夜培养物4℃，10000r/min离心20min，将上清转移至新离心管，加入1/5体积的peg-nacl，混匀后置于4℃培养2h以上；
[0125]
4)4℃、10000r/min离心20min，去除上清，将沉淀重悬于1ml pbs中，加入1/5体积的peg/nacl，混匀后置于4℃培养1h以上；
[0126]
5)4℃、12000r/min离心2min，去除上清，将沉淀悬浮于200μl pbs中，即为扩增产物，测定滴度，用于下一轮淘选或者分析。
[0127]
3、特异性噬菌体克隆的鉴定及分析
[0128]
3.1、噬菌粒的鉴定
[0129]
1)从第二轮淘选洗脱物滴度的平板上，用灭菌牙签随机挑取96个单克隆接种于1ml 2
×
yt-a中，37℃，220r/min振荡培养8h。
[0130]
2)取200μl上述培养物，按cell：phage＝1：20的比例加入m13k07噬菌体，37℃，静置15min，220r/min振荡培养45min。
[0131]
3)补加800μl体积的2
×
yt-ak，30℃，剧烈振荡培养过夜。
[0132]
4)第二天12000rpm离心2min，取上清，用于单克隆elisa鉴定。
[0133]
3.2阳性噬菌体克隆的鉴定
[0134]
1)将hcg或hlh抗原分别用ph值为9.6的碳酸盐缓冲液稀释至终浓度为2μg/ml，按100μl/孔加入酶标孔中，4℃包被过夜；
[0135]
2)弃包被液，pbst洗涤3次，每孔加入200μl 5％脱脂牛奶，37℃封闭1h；
[0136]
3)pbst洗涤3次，每孔加入50μl噬菌体培养菌液上清和50μl 5％脱脂牛奶，37℃孵
育1h；
[0137]
4)pbst洗涤6次，100μl/孔加入辣根过氧化物酶标记的抗m13抗体(abcam，货号：ab235228)，37℃作用1h；
[0138]
5)pbst洗板6次。加入tmb显色液显色，100μl/孔，37℃培养7min，50μl/孔加入终止液终止反应，于450nm下测od值。
[0139]
最终得到1号、13号、24号、25号、48号、62号、70号共7个亲和力较高的序列(表10)。对这7个阳性克隆进行测序，所得序列对应的氨基酸序列具体如下表10所示。
[0140]
表10 hcg和hlh抗原phage elisa鉴定及对应序列
[0141][0142]
实施例3：抗体表达及结合鉴定
[0143]
1、序列合成及表达
[0144]
表达筛选所得序列，检测其与含有α亚基抗原的亲和，另外选择vhh序列1g9e【pmid:24739391】作为阳性对照。委托南京金斯瑞生物科技有限公司进行大肠杆菌偏好的密码子优化，并加入n末端甲硫氨酸和c末端6
×
组氨酸标签(vhh-sgs-hhhhhh)，合成编码seq id no:2-8及1g9e的多核苷酸序列，插入到pet32a表达载体中，测序正确后获得用于多肽表达的重组质粒。将制备的重组质粒电转化到大肠杆菌bl21 star(de3)中，并接种至含100μg/ml氨苄青霉素的lb琼脂糖平板上。37℃培养过夜至菌落长出，挑取单个菌落，接种至3ml含100μg/ml氨苄青霉素的lb培养基中，37℃、250rpm培养过夜。过夜培养物接种至50ml含100μg/ml氨苄青霉素的lb培养基中，37℃培养至od600达到0.4～0.6时，加入0.1mm iptg，继续培养过夜。最终培养物离心收集菌体沉淀，用pbs重悬至100g/l后进行超声破胞处理，破胞后离心收集上清。上清用镍柱纯化。纯化得到的蛋白使用超滤离心管换液至pbs(ph 7.0)中。使用sds-page评价所得蛋白质纯度，如图5所示，结果显示8条序列对应的纯度均≥97％。
[0145]
2、纯化蛋白结合活性评估
[0146]
将酶标板用2μg/ml的hcg在2～8℃包被过夜；然后用pbst(含0.05％tween 20的pbs、ph7.4)洗涤3次，洗涤后的酶标板用300μl封闭液(含1％bsa的pbst)
在37℃封闭2h，封闭后用pbst洗涤。
[0147]
样品稀释：将分别样品稀释至200ng/ml起始，2倍比稀释10个点，以100μl/孔复孔加样至96孔板中。
[0148]
将酶标板放在37℃振荡孵育1h，用pbst洗涤后再将40ng/ml的anti-6
×
his tag抗体(hrp)(abcam，货号：ab1187)加入孔板中，在37℃振荡孵育1h，用pbst洗涤后加入tmb(tetramethylbenzidine)作为hrp的显色底物孵育15min，用2n h2so4终止。用酶标仪检测在450nm处的吸光度。采用4参数方程计算ec50值。
[0149]
表11.elisa检测ec50值
[0150]
seq id no:ec50(ng/ml)seq id no:ec50(ng/ml)210.28613.75325.90714.0145.05823.4659.461g9en/a*
[0151]
*注：1g9e样品elisa检测未成完整4参数曲线，高浓度点od值远低于其他vhh、未达饱和，无ec50数据。
[0152]
结果如表11所示，显示seq id no:2-8的vhh对于fsh和hcg有不同的结合活性，且结合活性均远大于1g9e。