nagB基因改造的弗式链霉菌重组菌及制备方法和应用与流程

本发明属于基因工程菌改造，尤其是一种nagb基因改造的弗式链霉菌重组菌及制备方法和应用。

背景技术：

1、链霉菌在分类学上属于原核生物界放线菌目链霉菌科，具有多样化的基因组和极高的gc（70～76%）含量。自然界约70％的抗生素是由链霉菌及其近缘放线菌产生。新霉素是由弗氏链霉菌产生的氨基糖苷类抗生素，能够干扰蛋白质合成，是国内外最为常用的兽用抗生素之一。其主要成分为新霉素b和c，以及少量新霉素a。新霉素b相对其他组分而言活性强、毒性低，是发酵过程中需要监测的主要组分。

2、目前，我国生产的新霉素主要用于出口，面向欧洲、美洲等地，且有供不应求之势，然而我国新霉素产量偏低、成本高，工业生产商采用的研究手段仍停留在上世纪80年代所采用的随机诱变或优化培养条件上，缺乏从菌种自身进行理性改造而提高新霉素合成能力的操作，较为落后的菌种改良技术与日益增长的供应需求间形成了新的矛盾。因此，如何理性改造新霉素生产菌株使其产量进一步提高，满足微生物制药市场需求是目前亟待解决的关键问题。

3、葡萄糖胺-6-磷酸脱氨酶（简称“nagb”）在弗氏链霉菌中的udp-glcnac合成途径中存在。弗氏链霉菌中的udp-glcnac合成途径包括以下步骤：由果糖-6-磷酸(fru-6-p)在四个连续的酶促反应中通过三种酶：glcnac激酶(glms)、glcnac磷酸变位酶(glmm)和udp-glcnac焦磷酸化酶（glmu）来合成udp-glcnac，具体为：首先，果糖-6-磷酸（fru-6-p）通过glcnac激酶(glms)转化为葡萄糖胺-6-磷酸(glcn-6-p)，与此同时，葡萄糖胺-6-磷酸(glcn-6-p)在葡萄糖胺-6-磷酸脱氨酶（nagb）的作用下还会逆转化为果糖-6-磷酸(fru-6-p)；接着，在glcnac磷酸变位酶(glmm)处于磷酸化状态下，glcn-6-p催化生成葡萄糖胺-1-磷酸(d-glcn-1p)；最后， d-glcn-1-p在udp-glcnac焦磷酸化酶（glmu）的作用下，乙酰化形成乙酰葡萄糖胺-1-磷酸（glcnac-1-p），glcnac-1-p再在udp-glcnac焦磷酸化酶（glmu）的作用下形成udp-glcnac（如图1所示）。由此可知，nagb是弗氏链霉菌中glcn-6-p转化为fru-6-p的关键酶。但是，调节nagb的表达水平与弗氏链霉菌发酵后产新霉素的联系目前尚未解析，不可预知。

技术实现思路

1、本发明的目的之一在于提供nagb基因改造的弗式链霉菌（ streptomyces  fradiae）重组菌，提高菌株的新霉素生产能力。

2、nagb基因改造的弗式链霉菌重组菌，其菌内含有由psco4503启动子、nagb基因和终止子三者顺序拼接而成的外源融合基因。

3、本发明首次通过在弗式链霉菌中过表达nagb基因，并通过psco4503启动子来调节葡萄糖胺-6-磷酸脱氨酶（nagb）在弗式链霉菌菌体内的表达水平，从而提高重组菌的新霉素合成能力，为提高新霉素产量提供了一种新策略。与原始弗式链霉菌菌株相比，通过本发明构建得到的弗式链霉菌重组菌的新霉素产量提升了15.5%。

4、优选的，所述psco4503启动子选用来源于天蓝色链霉菌（ streptomyces  coelicolor）的psco4503启动子，其核苷酸序列为seq id no.2中所示；所述nagb基因选用来源于弗式链霉菌的nagb基因，其核苷酸序列为seq id no.1中所示。

5、优选的，所述终止子选用来源于弗氏链霉菌的终止子taph，所述终止子的核苷酸序列为seq id no.6中所示。

6、本发明的目的之二在于提供本发明的目的之一所述的nagb基因改造的弗式链霉菌重组菌的构建方法，将psco4503启动子、nagb基因以及终止子三者通过soe-pcr顺序拼接形成外源融合基因，并将所述外源融合基因通过表达质粒导入原始弗式链霉菌中得到弗式链霉菌重组菌，所述原始弗式链霉菌为产新霉素的弗式链霉菌。

7、优选的，所述的原始弗氏链霉菌为弗氏链霉菌sf01（ streptomyces fradiaesf01），所述弗氏链霉菌sf01于2022年01月21日保藏在位于武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no：m 2022111。

8、优选的，所述表达质粒选用质粒pset152。质粒pset152是大肠杆菌-链霉菌穿梭质粒，其中具有接合转移的orit功能区域、链霉菌筛选标记-安普霉素抗性基因acc3(iv)、整合酶基因int(φc31)、链霉菌温和噬菌体φc31的attp位点。因此，质粒pset152可利用简便高效的属间接合转移法导入链霉菌，并可通过特异性重组整合在链霉菌染色体的attb位点上，随着宿主染色体的复制而复制。

9、本发明的目的之二所述的nagb基因改造的弗式链霉菌重组菌的构建方法，具体步骤如下：

10、（1）以弗氏链霉菌sf01的基因组dna为模板，pcr扩增出所述nagb基因以及所述终止子，其中的所述终止子具体为终止子taph；以天蓝色链霉菌m145（streptomycescoelicolor m145）的基因组为模板，pcr扩增出所述psco4503启动子；通过soe-pcr将所述psco4503启动子、所述nagb基因以及所述终止子按顺序拼接起来形成所述外源融合基因；

11、（2）所述表达质粒选用质粒pset152，以pset152质粒为模版，pcr扩增获得pset152线性化载体；引物为g-t5-f和g-t5-r，

12、g-t5-f：atcgaattcgtaatcatgtcatagctgtttcctg、

13、g-t5-r：gcttggcactggccgtcgttttac；

14、（3）将步骤（2）得到的pset152线性化载体与步骤（1）得到的外源融合基因进行重组得到重组产物，并将重组产物转入大肠杆菌dh5α感受态中，将菌体涂布在安普霉素抗性平板上进行筛选，置于37℃培养箱中培养，得到转化子；并经过菌落pcr验证，得到阳性转化子，经过测序确认得到表达载体pset- psco4503 - nagb；

15、（4）通过接合转移法将步骤（3）得到的表达载体pset- psco4503 - nagb转入所述原始弗式链霉菌中，所述原始弗式链霉菌具体选用弗氏链霉菌sf01，筛选得到结合子sf01/pset- psco4503 - nagb，即所述弗式链霉菌重组菌。

16、本发明的目的之三在于所述nagb基因改造的弗式链霉菌重组菌在新霉素生产中的应用。进一步的，所述应用包括发酵培养，所述发酵培养所用的发酵培养基配方为：10-30g/l葡萄糖，50-90g/l玉米淀粉，10-30g/l蛋白胨，3-9g/l酵母粉，20-40g/l花生粕，3-9g/l硫酸铵，2-10g/l 氯化钠，0.1-0.5g/l 磷酸氢二钠，1-8g/l轻质碳酸钙，0.1-0.5g/l淀粉酶，ph 7.2-7.7。