枯草芽孢杆菌yc1-10及其在疏松砂岩油藏固砂修复中的应用

1.本发明属于微生物修复领域，具体涉及枯草芽孢杆菌yc1-10及其在疏松砂岩油藏固砂修复中的应用。


背景技术：

2.目前我国大多数油田属于砂岩油藏，其中一部分砂岩油藏是疏松砂岩，出砂严重。这类油藏地层岩石的胶结强度不够，在油气田开采过程中，容易出现油井出砂的情况。同时如果该油藏为稠油油藏，开采过程中容易出现严重的出砂现象，易造成油井出现砂卡或砂埋现象，严重时会造成油井报废，给油井的安全高效生产带来极大的危害。
3.目前油井防砂方法主要包括：机械防砂法、化学防砂法、焦化防砂法。其中机械防砂法不适用于粉细砂岩，且后期处理复杂。其中化学防砂法不适用于裸眼井，化学药剂有毒，易造成污染，且不宜多层长井段和严重出砂。其中焦化防砂法不宜用于多油层和长井段作业，且施工复杂，难度大，费用高。上述的防砂方法只能暂时性的减缓或控制油藏出砂，不能从本质上解决出砂状况。而微生物修复技术是一项新型的修复技术，微生物修复是向油藏注入筛选的采油功能菌或激活剂，生成具有粘结作用且难溶的碳酸盐晶体，从而将弱胶结的颗粒粘结在一起，形成具有一定强度的整体，能够从本质上解决出砂状况，对疏松砂岩固砂具有一定的重要意义。
4.在进行微生物修复过程中，不同的环境对菌种有着不同的要求，目前报道的正常大气环境下能够产生微生物水泥矿化物及沉淀的微生物较多，但关于在储层条件下分离自油藏的微生物对疏松砂岩进行修复的相关报道较少。
5.申请号为“cn202110576781.9”的中国专利公开了一种高产脲酶的枯草芽孢杆菌及其应用方法，所述所述菌株为枯草芽孢杆菌，在好氧条件下，其菌浓为1.6
×
10
11
cfu/ml，产脲酶量为0.22μg/h/104cell，可应用于治理被重金属污染的土壤。该发明虽然在好氧条件下脲酶的产量较高，但是该技术只是针对好氧条件下脲酶的产生，并未对地层厌氧兼性条件进行考虑，因此，该技术并未涉及到微生物地层固砂。


技术实现要素：

6.本发明旨在解决现有技术中存在的技术问题，为此：
7.本发明的第一个方面，提供枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)yc1-10，其保藏编号为cgmcc no.24777。
8.本发明的第二个方面，提供含有所述枯草芽孢杆菌yc1-10的微生物制剂。
9.本发明的第三个方面，提供所述枯草芽孢杆菌yc1-10所述微生物制剂在产脲酶中的应用。
10.本发明的第四个方面，提供一种产脲酶的方法，将所述的枯草芽孢杆菌yc1-10接种于含尿素的培养基发酵至少48h，发酵温度27-67℃。
11.本发明的第五个方面，提供一种生物固砂菌剂，包括所述的枯草芽孢杆菌yc1-10
和含尿素的营养培养基。
12.进一步的，每l所述营养培养基包含蛋白胨2-3g，氯化钠4-5g，尿素18-22g，葡萄糖2-3g，余量为水，ph值为6.8-7.2。
13.本发明的第六个方面，提供所述的生物固砂菌剂的制备方法，包括如下步骤：
14.取od
600
值为0.05的枯草芽孢杆菌yc1-10菌液接种于所述营养培养基，所述菌液与所述营养培养基的体积比为10-12ml：1l。
15.本发明的第七个方面，提供所述枯草芽孢杆菌yc1-10或所述的生物固砂菌剂在疏松砂岩油藏固砂修复中的应用。
16.与现有技术相比，本发明的有益效果是：
17.本发明从油藏环境中分离筛选得到了一株产脲酶的枯草芽孢杆菌，通过脲酶活性评价，其能够有效高产脲酶；同时岩心实验表明，该生物固砂菌剂能够降低渗透率，胶结疏松的砂岩。
18.本发明的附加方面和优点将在具体实施部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
19.保藏说明：
20.菌种名称：枯草芽孢杆菌；
21.拉丁名：bacillus subtilis；
22.菌株编号：yc1-10；
23.保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称gmcc)；
24.保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；
25.保藏日期：2022年04月26日。
26.保藏编号：cgmcc no.24777。
附图说明
27.图1为本发明实例中枯草芽孢杆菌yc1-10的形态图。
28.图2为本发明实例中枯草芽孢杆菌yc1-10的耐温曲线图。
具体实施方式
29.下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。如未特殊说明，下述实施例中所用的技术手段(如培养基制备方法)为本领域技术人员所熟知的常规手段，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
30.实施例1：菌株富集筛选与分离纯化
31.1、环境样品采集
32.延长油田长8储层采集的岩屑样品。
33.2、菌株初筛
34.将上述样品加入到无菌水中，快速搅拌并自然沉降，然后取上述清夜适当稀释后在厌氧箱中涂布在加入了酚红的lb固体培养基上，在40℃的恒温箱中进行培养，将培养基中变红的菌落在厌氧操作台中挑出，转至尿素液体培养基中进行培养，分离单菌，将分离的
单菌继续涂平板，直至平板上只有一种形态的菌落为止。
35.所述的lb固体培养基包括：蛋白胨10g/l，氯化钠10g/l，酵母浸粉5g/l，琼脂20g/l，调节ph值为7。
36.3、菌株复筛
37.将上述实验得到的纯的菌株，分别接种到含有酚红的营养培养基中，在恒温回旋摇床中，40℃培养48h后，观察菌液是否变红。
38.经过复筛，在长8储层的岩屑样品中发现了一株能产生脲酶并能使含有酚红的营养培养基变红的菌株，并将该菌株命名为yc1-10。
39.实施例2：菌株鉴定
40.将实施例1得到的枯草芽孢杆菌yc1-10进行检验，其革兰氏染色为阳性，细胞形态(图1)为杆状；40℃条件下，采用lb固体培养基进行培养，可得到表面有褶皱的白色菌落。本发明的枯草芽孢杆菌yc1-10可在27℃-67℃范围内进行生长。
41.通过对本发明菌株的16srdna进行测序，将该菌株的16srdna序列与枯草芽孢杆菌bacillus subtilis菌株16srdna序列进行同源性比对，发现该菌株的16srdna(seq id no.1所示)序列与枯草芽孢杆菌bacillus subtilis菌株16srdna序列的同源性大于99％，因此将该菌株鉴定为枯草芽孢杆菌bacillus subtilis。
42.实施例3：枯草芽孢杆菌yc1-10的生长能力实验
43.将枯草芽孢杆菌yc1-10在lb液体培养基中培养12h，取1ml od
600
值为0.05的菌液加入装有100ml尿素液体培养基的厌氧瓶中，分别置于20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃恒温回旋摇床中120r/min震荡培养48h。
44.所述的lb液体培养基包括：蛋白胨10g/l，氯化钠10g/l，酵母浸粉5g/l。调节ph值为7。
45.使用紫外分光光度计测量48h后菌液的吸光光度值，绘制菌液生长曲线。
46.结果如图2所示，在40℃条件下，枯草芽孢杆菌yc1-10的生长能力达到最高。
47.实施例4：枯草芽孢杆菌yc1-10产脲酶能力检测
48.取1ml枯草芽孢杆菌yc1-10的菌液(od
600
值为0.05)，与0.1l尿素液体培养基混合，40℃条件下培养48h，每l所述的尿素液体培养基包括：蛋白胨2g/l，氯化钠5g/l，尿素20g/l，葡萄糖2g/l，余量为水，调节ph值为7.0。
49.用电导率仪测量5min溶液电导率的变化，其中初始电导率记为σ1，最终电导率记为σ2，稀释倍数记作n。计算脲酶活性的公式如下：
50.ure＝(σ
2-σ1)
×n51.其中：ure为脲酶活性，μmol/(l
·
min)；σ
1-σ2为电导率变化值，μs/(cm
·
min)；n为菌液的稀释倍数。
52.枯草芽孢杆菌yc1-10生长情况及脲酶活性如表1所示。
53.表1枯草芽孢杆菌生长情况及脲酶活性
54.55.实施例5：枯草芽孢杆菌yc1-10物理模拟疏松砂岩修复实验
56.1、初始渗透率测量
57.将干岩心放入岩心夹持器中、加环压，利用煤油法测量岩心的孔隙度，利用模拟地层水测量岩心的初始渗透率，记初始渗透率为k1。
58.2、固砂修复过程
59.(1)制备生物固砂菌剂
60.取od
600
值为0.05的枯草芽孢杆菌yc1-10菌液接种于尿素液体培养基(同实施例4)，所述菌液与所述尿素液体培养基的体积比为10ml：1l。
61.(2)在孔隙中注入上述生物固砂菌剂，流速为0.3ml/min，注入体积为2pv，然后关闭进口、出口，40℃培养2周。
62.3、修复后渗透率测量
63.注入模拟地层水，流速为0.5ml/min，记录数据并计算修复后的渗透率，记修复后的渗透率为k2。
64.4、固砂修复效率
65.计算固砂修复效率的公式如下：
[0066][0067]
其中，η为固砂修复效率；k1为初始渗透率，
×
10-3
μm2；k2为固砂修复后渗透率，
×
10-3
μm2。
[0068]
结果如表2所示，枯草芽孢杆菌yc1-10能够降低渗透率，胶结疏松的砂岩，达到疏松砂岩油藏固砂修复的效果。
[0069]
表2疏松砂岩修复前后渗透率及修复效率
[0070][0071]
需要说明的是，本发明权利要求书中涉及数值范围时，应理解为每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用，为了防止赘述，本发明描述了优选的实施例。
[0072]
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
[0073]
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。