一种嗜热栖热菌基因编辑质粒及在生产超氧化物歧化酶中的应用

本发明涉及基因工程和应用微生物领域，特别是涉及一种嗜热栖热菌基因编辑质粒及在生产超氧化物歧化酶中的应用。

背景技术：

1、嗜热菌是一类生活在高温环境中的微生物，广泛分布在温泉、堆肥、地热区土壤、火山地区以及海底火山地等，它们被认为是工业相关热稳定酶的来源之一。通常，当酶或蛋白质在极高温度展开结构或在特定的高温下具有较长的半衰期时，被认为是热稳定的。嗜热菌体内的嗜热酶可用于催化常温酶难以实现的高温化学反应，该独特性为其在工业中的广泛应用铺平了道路。嗜热栖热菌(thermus thermophilus)是研究极端嗜热微生物的模式物种之一，它具备高效的自然转化能力及较短的生长周期。科学家们一直尝试能够最大化地利用这些优点对嗜热栖热菌进行遗传改造，进而获得目的菌株应用于科研、工业领域。

2、嗜热栖热菌虽然具备高效的自然转化能力及较短的生长周期，但研究人员一直通过传统的同源重组方法对其进行基因组编辑，该方法具有一定的局限性，其高度依赖筛选标记，通常不能实现无痕的基因编辑；同时其获得正确突变体的效率低，最高仅有1％，因此开发嗜热栖热菌适用的高效基因编辑工具十分必要，这将促进对嗜热菌功能机制以及工业应用的研究。早在2004年，研究人员就解析了嗜热栖热菌hb27的完整基因组序列，随后的2006年godde等人报导了嗜热栖热菌hb27的巨大质粒上存在crispr重复序列及cas基因。上述发现被其他研究者证实并展示了crisprs和cas基因在嗜热栖热菌hb27的巨大质粒和染色体上的分布。根据注释，巨大质粒ptt27编码有ⅰ-b、ⅰ-c、ⅲ-a和ⅲ-b亚型crispr-cas系统，以及9个crispr簇；染色体编码有2个crispr簇。研究人员根据嗜热栖热菌hb27 crispr系统cas蛋白的比对结果，建立系统发育树，将这11个crispr簇分为3类，分别对应于不同类型的crispr-cas系统。ⅱ型crispr-cas9系统作为基因编辑工具已被广泛应用在原核、真核生物中，嗜热栖热菌hb27体内丰富的crispr系统也存在被开发成为基因编辑工具的潜能，通过靶向目标基因或者片段，高效地对其引入靶标链断裂，提高对菌株进行遗传改造的效率，能实现对嗜热栖热菌hb27高效的基因缺失、插入及点突变等编辑，为设计和构建嗜热微生物底盘细胞提供技术支撑。

3、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,sod)广泛存在于各类生物体中，是机体内超氧阴离子自由基的天然消除剂，对机体细胞起保护作用。sod作为一种抗氧化剂，在化妆品中广泛使用，它已被证明可以缓解紫外线对皮肤的损害、愈合伤口、减少面部皱纹和色素沉着。研究表明，经过生物发酵，嗜热栖热菌能产生热稳定性的超氧化物歧化酶和b族维生素，表现出高效的抗氧化和光保护活性，具有强大的细胞修复功效。也有研究发现，嗜热栖热菌的发酵产物中含有多聚氨基酸、烟酰胺单核苷酸等，发酵液经破壁后提取可以得到含有大量皮肤所需的氨基酸、肽、维生素、谷胱甘肽过氧化物酶、超氧化物歧化酶等众多活性成分，具有抗氧化能力，可以有效地清除自由基，抵抗皮肤衰老。其次能刺激皮肤成纤维细胞生长，帮助皮肤修复。还能很好地抑制酪氨酸酶(酪氨酸酶是黑色素生成过程中的一种关键性酶)的活性，减少黑色素的生产，以此达到提亮肤色、美白皮肤的效果。因此，为了获取生物来源的sod，通过基因基因编辑方式改造嗜热栖热菌具有重要意义。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种嗜热栖热菌基因编辑质粒及在生产超氧化物歧化酶中的应用，以解决上述现有技术存在的问题，分别利用了ⅰ-b、ⅰ-c、ⅲ-a和ⅲ-b亚型crispr-cas系统构建嗜热栖热工程菌，该工具构建简单，实验周期短，能够对嗜热栖热菌基因组进行高效的基因编辑，并且所构建的嗜热栖热工程菌能够高产超氧化物歧化酶。

2、为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

3、本发明提供一种嗜热栖热菌基因编辑质粒，所述编辑质粒包括如下基因结构：5’-启动子-重复序列-间隔序列-重复序列-供体dna-3’；其中，所述重复序列源自嗜热栖热菌基因组上ⅰ-b亚型、ⅰ-c亚型或者ⅲ-a/b亚型crispr-cas系统；所述间隔序列为靶标片段。

4、优选的是，源自嗜热栖热菌基因组上ⅰ-b亚型crispr-cas系统的重复序列(seq idno：1)为：5’-gttgcaaacctcgttagcctcgtagaggattgaaac-3’；

5、源自嗜热栖热菌基因组上ⅰ-c亚型crispr-cas系统的重复序列(seq id no：2)为：5’-gttgcaccgg cccgaaaggg ccggtgagga ttgaaac-3’；

6、源自嗜热栖热菌基因组上ⅲ-a和ⅲ-b亚型crispr-cas系统的重复序列(seq idno：3)为：5’-gttgcaaggg attgaacccc gtaaggggat tgcgac-3’。

7、优选的是，所述间隔序列为pam序列紧邻的38-40bp长度的序列。

8、优选的是，ⅰ-b亚型和ⅰ-c亚型的pam序列为5’-ttc-3’。

9、优选的是，当靶标位点3’端侧翼序列与crrna的5’端重复序列不匹配时，ⅲ-a和ⅲ-b亚型的cas蛋白具有dna切割活性。

10、优选的是，所述启动子为嗜热栖热菌的组成型启动子。更优选的是启动子为源自嗜热栖热菌的组成型启动子p31，能持续性高表达基因。

11、所述供体dna为嗜热栖热菌hb27的基因组dna序列或者片段。

12、本发明还提供一种工程菌株，包括所述的嗜热栖热菌基因编辑质粒。

13、本发明还提供所述的嗜热栖热菌基因编辑质粒，或者所述的工程菌株在生产超氧化物歧化酶中的应用。

14、本发明还提供一种生产超氧化物歧化酶的方法，包括将所述的编辑质粒转入嗜热栖热菌中，敲除嗜热栖热菌crtb基因的同时插入编码sod的基因(sod基因序列如seq idno：4，sod蛋白序列如seq id no：5所示)，待多次传代使其成为纯合菌株后，在无抗的培养基中继续传代，使编辑质粒丢失，得到无需添加抗生素即可培养的高产超氧化物歧化酶的嗜热栖热工程菌。然后再通过液体发酵培养所述嗜热栖热工程菌，培养至所述嗜热栖热工程菌的od600为0.8-1.2时结束发酵，获取超氧化物歧化酶。

15、sod基因序列(seq id no：4)：

16、atgccgtacccgttcaagcttcctgacctaggctacccctacgaggccctcgagccccacattgacgccaagaccatggagatccaccaccagaagcaccacggggcctacgtgacgaacctcaacgccgccctggagaagtacccctacctccacggggtggaggtggaggtcctcctgaggcacctcgccgcccttccccaggacatccagaccgccgtgcgcaacaacgggggcgggcacctgaaccacagcctcttctggaggctcctcacccccgggggggccaaggagcccgtgggggagctgaagaaggccattgacgagcagttcgggggcttccaggccctcaaggagaagctcacccaggcggccatgggccggttcggctcgggctgggcctggctcgtgaaggaccccttcggcaagctccacgtcctctccacccccaaccaagacaaccccgtgatggagggcttcacccccatcgtgggcattgacgtctgggagcacgcctactacctcaagtaccagaaccgccgggccgattacctccaggccatctggaacgtcctcaactgggacgtggccgaggagttcttcaagaaggcctga。

17、sod蛋白序列(seq id no：5)：

18、met pro tyr pro phe lys leu pro asp leu gly tyr pro tyr glu ala leuglu pro his ile asp ala lys thr met glu ile his his gln lys his his gly alatyr val thr asn leu asn ala ala leu glu lys tyr pro tyr leu his gly val gluval glu val leu leu arg his leu ala ala leu pro gln asp ile gln thr ala valarg asn asn gly gly gly his leu asn his ser leu phe trp arg leu leu thr progly gly ala lys glu pro val gly glu leu lys lys ala ile asp glu gln phe glygly phe gln ala leu lys glu lys leu thr gln ala ala met gly arg phe gly sergly trp ala trp leu val lys asp pro phe gly lys leu his val leu ser thr proasn gln asp asn pro val met glu gly phe thr pro ile val gly ile asp val trpglu his ala tyr tyr leu lys tyr gln asn arg arg ala asp tyr leu gln ala iletrp asn val leu asn trp asp val ala glu glu phe phe lys lys ala。

19、优选的是，液体发酵培养时，所用的液体发酵培养基包括以下浓度的组分：8g/l蛋白胨，4g/l酵母提取物，3g/l氯化钠，367mg/l碳酸氢钠，31.34mg/l硫酸镁，0.95mg/l氯化钾，36.75mg/l二水合氯化钙以及150.44mg/l六水合氯化镁，ph值为7.5。

20、本发明公开了以下技术效果：

21、(1)本发明在进行基因组编辑时，只需要构建一个同时携带启动子、两个重复序列、引导靶向目标位点的spacer序列和供体dna的编辑质粒，在内源cas蛋白对靶标dna链进行干涉之后，供体dna为细菌提供了同源重组修复模板达到对基因组的编辑。本发明的基因编辑技术过程简单且具有更高的编辑效率，时间周期短，为嗜热栖热菌基因功能的挖掘和高性能工程菌株的构建提供了工具。

22、(2)本发明在嗜热栖热菌(thermus thermophilus)菌株hb27中利用上述基因编辑技术敲除了crtb基因，同时在该基因位点上插入了sod编码基因，由此增加了嗜热栖热菌体内sod基因的拷贝数；该基因编辑技术利用嗜热栖热菌内源的ⅰ-c型crispr-cas系统实现，进而成功构建了嗜热栖热工程菌，通过实验证明，本发明构建的嗜热栖热菌发酵液的超氧化物歧化酶含量显著增加2.2倍，可以作为原料添加到膏霜、乳液、眼部精华素、化妆水以及精华液等化妆品中。

23、(3)本发明的嗜热栖热菌在高温环境中生长，其产生的超氧化物歧化酶作为嗜热酶，它的稳定性高，因而可以在室温下分离提纯和包装运输，并且能长久地保持活性。

24、(4)本发明的嗜热栖热菌发酵过程对反应器冷却系统的要求标准降低，因而减少了能耗。

25、(5)本发明的嗜热栖热菌发酵温度高，很少有杂菌生存，从而减少了细菌代谢对产物的污染。