技术特征：
1.一种鱼类嗅觉神经元的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：1)取团头鲂嗅囊组织置于pbs缓冲液中，剥离嗅囊边缘黏膜，用pbs缓冲液重复清洗；2)向清洗的嗅囊组织中加入aim消毒液，密封后置于冰上消毒、离心、弃上清；3)向沉淀组织中加入胰蛋白酶-edta消化液消化后，加入中和培养基终止消化、离心、弃上清；4)加入胶原酶工作液，缓慢吹打，用中和培养基终止消化，离心收集细胞上清液，置于冰上；5)重复步骤4)三次及以上；6)将收集的细胞上清液用细胞筛过滤、离心、收集细胞沉淀，用中和培养基清洗多次，离心、弃上清，加入生长培养基重悬浮，得到细胞悬液；7)将细胞悬液接种于六孔板中，密封后置于细胞培养箱中进行培养，后弃生长培养基，加入神经细胞培养基继续培养5～7d，得到鱼类嗅觉神经元，期间每3d换液一次。2.根据权利要求1所述鱼类嗅觉神经元的培养方法，其特征在于：所述步骤2)中，aim消毒液由以下方法制备而成：在超净工作台内，取2ml青链霉素双抗、2.5ml两性霉素b、0.5ml硫酸庆大霉素加入50ml无菌离心管内，最后加dmem/f12培养基至50ml，0.22μm过滤器过滤，封装后于4℃冰箱保存备用。3.根据权利要求1所述鱼类嗅觉神经元的培养方法，其特征在于：所述步骤4)中，胶原酶工作液由以下方法制备而成：在超净工作台内，取2ml青链霉素双抗、0.5ml硫酸庆大霉素、0.5ml dnaseⅰ、2ml胶原酶ⅰ+ⅳ母液加入50ml无菌离心管内，加dmem/f12培养基至46ml，0.22μm过滤器过滤后，转移至新的无菌管内，再加4ml胰蛋白酶-edta消化液，封装后于4℃冰箱保存备用。4.根据权利要求3所述鱼类嗅觉神经元的培养方法，其特征在于：所述胶原酶ⅰ+ⅳ母液由以下方法制备而成：在超净工作台内，将100mg胶原酶ⅰ和100mg胶原酶ⅳ溶于40ml pbs溶液中，0.22μm过滤器过滤后分装2ml/管，于-20℃保存备用。5.根据权利要求1所述鱼类嗅觉神经元的培养方法，其特征在于：所述步骤2)和步骤3)中，离心转速为500r/min，时间为1min；所述步骤3)中，胶原酶工作液消化时间为6min。6.根据权利要求3所述鱼类嗅觉神经元的培养方法，其特征在于：所述步骤3)和步骤4)中，中和培养基由以下方法制备而成：在超净工作台内，取2ml青链霉素双抗、2.5ml两性霉素b、0.25ml硫酸庆大霉素、10ml胎牛血清加入50ml无菌离心管内，加dmem/f12培养基至50ml，0.22μm过滤器过滤后转移至新的无菌管内，封装，4℃冰箱保存备用。7.根据权利要求1所述鱼类嗅觉神经元的培养方法，其特征在于：所述步骤6)中，生长培养基由以下方法制备而成：在超净工作台内，取2ml青链霉素双抗、0.5ml hepes、1ml b-27plus、0.5ml n-2添加剂、5ml fbs加入50ml无菌离心管内，加dmem/f12培养基至50ml，0.22μm过滤器过滤后转移至新的无菌管内，封装后于4℃冰箱保存备用。8.根据权利要求1所述鱼类嗅觉神经元的培养方法，其特征在于：所述步骤7)中，接种
密度为1
×
106个细胞。9.根据权利要求1所述鱼类嗅觉神经元的培养方法，其特征在于：所述步骤7)中，细胞培养箱条件为：温度为27℃、co2浓度为5％、培养时间为24～48h。10.根据权利要求1所述鱼类嗅觉神经元的培养方法，其特征在于：所述步骤7)中，神经细胞培养基由以下方法制备而成：在超净工作台内，取1ml青链霉素双抗、0.5ml hepes、1ml b-27plus、0.5ml n-2添加剂加入50ml无菌离心管内，最后加neurobasal plus a基础培养基至50ml，0.22μm过滤器过滤后转移至新的无菌管内，封装后于4℃冰箱保存备用。
技术总结
本发明公开了一种鱼类嗅觉神经元的培养方法，该方法将获取的团头鲂嗅囊组织置于PBS缓冲液中剥离边缘黏膜、清洗；向嗅囊组织中加入AIM消毒液，密封后放入冰上消毒，离心后向沉淀组织中加入胰蛋白酶-EDTA消化液消化，之后加入中和培养基、离心；加入胶原酶工作液，缓慢吹打，再加入中和培养基，离心收集细胞上清液；将收集的细胞液过滤、离心、收集细胞沉淀，然后用中和培养基清洗、离心，加入生长培养基重悬浮，得到细胞悬液；将细胞悬液接种在六孔板中，密封后置于细胞培养箱中进行培养，加入神经细胞培养基继续培养，得到鱼类嗅觉神经元。本发明操作简单，重复性好，为在体外实验节约实验成本和时间，减少实验的繁琐性。减少实验的繁琐性。减少实验的繁琐性。
技术研发人员：刘寒 关素华 黄欣 祝东梅 高泽霞 王卫民
受保护的技术使用者：华中农业大学
技术研发日：2022.07.13
技术公布日：2022/11/1