芒萁DlNREET1蛋白及其编码基因和应用

芒萁dlnreet1蛋白及其编码基因和应用
技术领域
1.本发明属于基因工程技术领域。更具体地，涉及一种芒萁dlnreet1蛋白及其编码基因和应用。


背景技术：

2.稀土元素(rare earth elements，rees)是镧系和包括钪、钇在内的17个元素的统称，可分为轻稀土和重稀土元素，是重要的战略资源。中国是稀土资源大国，储量和开采量均居世界首位，但大量的采矿活动不仅导致我国稀土储量不断下降，同时也遗留了大面积的稀土尾砂地。这些尾砂地中还残留有大量的稀土元素，不仅威胁生态系统安全，也造成大量稀土资源的流失。此外，不合理的开采方式也导致了大量的稀土元素进入周边河流，进而导致矿区周边农田被稀土污染。因此，对这些稀土尾矿和污染土壤进行修复，降低其环境风险，并回收其中的稀土资源具有重要意义。
3.植物采矿技术是一种绿色友好的植物修复技术，通过在被稀土污染的场地种植超富集植物，收获其地上部生物量以实现回收污染土壤中目标元素的目的，为矿区污染土壤的生态修复和稀土资源化回收提供了一种解决途径。截至目前，仅有21种稀土超富集植物被学术界报道；其中，芒萁(dicranopteris linearis)是稀土富集能力最强的植物，其地上部稀土含量可达植物干重的0.7％，是发展稀土植物采矿技术的潜在材料。尽管芒萁有很多优点，但其生物量较小，且不易人工繁殖，极大限制了直接利用芒萁开展稀土植物采矿的可行性。而芒萁超强的稀土富集能力，表明芒萁根系中存在高效的稀土吸收系统。因此，探索芒萁根系吸收稀土元素的分子机制，挖掘其超富集稀土元素相关的分子资源，可为培育生物量大且稀土富集能力强的植物采矿材料奠定良好基础。但目前尚未有研究报道植物体内具有与稀土转运相关的蛋白或基因。


技术实现要素：

4.本发明要解决的技术问题是克服现有稀土植物采矿技术的缺陷和不足，提供一种具有稀土元素转运能力的芒萁dlnreet1蛋白及其编码基因和应用。
5.本发明的第一个目的是提供一种芒萁dlnreet1蛋白。
6.本发明的第二个目的是提供所述芒萁dlnreet1蛋白的编码基因。
7.本发明的第三个目的是提供一种重组表达载体。
8.本发明的第四个目的是提供一种重组工程菌。
9.本发明的第五个目的是提供所述芒萁dlnreet1蛋白、所述编码基因或所述重组表达载体在提高真菌富集稀土元素的能力中的应用。
10.本发明的第六个目的是提供所述芒萁dlnreet1蛋白、所述编码基因、所述重组表达载体或所述重组工程菌在提高植物富集稀土元素的能力中的应用。
11.本发明的第七个目的是提供所述芒萁dlnreet1蛋白、所述编码基因、所述重组表达载体或所述重组工程菌在培育具有稀土修复功能的转基因植物中的应用。
12.本发明上述目的通过以下技术方案实现：
13.本发明从稀土超富集植物芒萁中筛选鉴定得到了一个具有稀土转运能力的蛋白，命名为dlnreet1(dicranopteris linearis nramp rare earth element transporter 1)，其氨基酸序列如seq id no.2所示。本发明同时还得到了编码芒萁dlnreet1蛋白的基因，该基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。通过在真菌和植物中过表达芒萁dlnreet1蛋白，本发明发现其可以提高真菌和植物对稀土元素的转运能力，对稀土元素进行富集。因此，可将芒萁dlnreet1蛋白用于提高真菌或植物对稀土元素的富集能力或培育具有稀土修复功能的转基因植物等。
14.本发明提供了一种芒萁dlnreet1蛋白，所述蛋白的氨基酸序列如seq id no.2所示。
15.本发明还提供了所述芒萁dlnreet1蛋白的编码基因。
16.具体地，所述编码基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。
17.本发明还提供了一种重组表达载体，所述载体中含有芒萁dlnreet1蛋白的编码基因。
18.本发明还提供了一种重组工程菌，所述工程菌中含有上述重组表达载体。
19.本发明利用酵母和模式植物拟南芥证实了过表达芒萁dlnreet1蛋白可以提高酵母和植物富集稀土元素的能力。因此，本发明申请保护所述芒萁dlnreet1蛋白、所述编码基因、所述重组表达载体在提高真菌富集稀土元素能力中的应用。
20.本发明还申请保护所述芒萁dlnreet1蛋白、所述编码基因、所述重组表达载体或所述重组工程菌在提高植物富集稀土元素能力中的应用。
21.具体地，所述提高植物富集稀土元素能力是通过在植物中表达芒萁dlnreet1蛋白实现的。
22.本发明还申请保护所述芒萁dlnreet1蛋白、所述编码基因、所述重组表达载体或所述重组工程菌在培育具有稀土修复功能的转基因植物中的应用。
23.作为一种可选择的实施方式，所述植物为拟南芥。
24.本发明具有以下有益效果：
25.本发明从植物芒萁中筛选鉴定得到了一个具有稀土转运能力的蛋白，将其命名为dlnreet1，并克隆得到了编码该蛋白的基因序列。本发明通过在真菌或植物中过表达该蛋白发现其可以提高真菌或植物对稀土元素的富集能力，可将其用于培育具有稀土修复功能的转基因植物，进而用于稀土元素污染土壤的修复治理等。本发明所述芒萁dlnreet1蛋白及其编码基因对稀土污染土壤的修复和资源化回收具有重要意义。
附图说明
26.图1为利用酿酒酵母by4741对芒萁dlnreet1蛋白的稀土元素转运功能的验证结果；其中，图a为含有dlnreet1基因和不含dlnreet1基因的酵母对稀土元素的敏感性测试结果；图b为在含稀土元素的培养基中培养后，含有dlnreet1基因和不含dlnreet1基因的酵母体内的稀土元素含量测定结果；图中*表示差异显著，p＜0.05。
27.图2为过表达dlnreet1的拟南芥和野生型拟南芥的地上部和根系中的稀土元素含量的测定结果；图中*表示差异显著，p＜0.05。
具体实施方式
28.以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
29.除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
30.实施例1芒萁dlnreet1基因的克隆
31.本发明从稀土超富集植物芒萁的三代全长转录组数据库中筛选鉴定得到了一个具有稀土转运能力的蛋白，将该蛋白命名为dlnreet1(dicranopteris linearis nramp rare earth element transporter 1)，其氨基酸序列如下(seq id no.2)所示：
[0032][0033]
基于该序列，本发明克隆得到了编码芒萁dlnreet1蛋白的基因，即芒萁dlnreet1基因，其克隆方法如下所示：
[0034]
1、rna的提取与逆转录：
[0035]
取水培培养的新鲜芒萁根系组织，借助rna提取试剂盒(sigma-aldrich)提取芒萁组织中的总rna，使用hiscriptii onestep rt-pcr试剂盒(vazyme biotech)逆转录得到cdna；具体步骤参照试剂盒说明书进行。
[0036]
2、克隆引物：
[0037]
芒萁dlnreet1基因的克隆引物如下所示：
[0038]
前端引物f：ggatgcaaaacgatgcttta
[0039]
末端引物r：accattacaatggcatcact
[0040]
3、pcr扩增：
[0041]
以逆转录得到的芒萁cdna为模板，利用高保真酶i-5
tm 2
×
high-fidelity master mix(mclab，i5hm-200)进行pcr扩增。pcr扩增反应体系的总体积为50μl，其中，i5 mix 25μl，cdna模板1μl，前端引物f 2μl，末端引物r2μl，ddh2o补足余量。pcr扩增反应程序为：98℃预变性2min；98℃变性10s；58℃退火15s；72℃延伸30s；35个循环；72℃延伸5min；4℃保温。
[0042]
4、pcr产物验证：
[0043]
利用胶回收试剂盒对pcr产物进行纯化，随后连入topo克隆载体得到重组克隆载体，将连接产物回转大肠杆菌dh5α感受态细胞；在含有氨苄青霉素的培养基上筛选阳性转化子，并将阳性单克隆菌株送到生物公司进行测序，测序结果显示芒萁dlnreet1基因的核苷酸序列如下(seq id no.1)所示：
[0044]
[0045][0046]
实施例2
[0047]
本发明利用酿酒酵母by4741对实施例1所述芒萁dlnreet1蛋白的功能进行了验证，过程如下所示：
[0048]
1、dlnreet1酵母表达载体的构建：
[0049]
以实施例1中构建的芒萁dlnreet1基因的克隆载体为模板，利用诺维赞公司ce design软件设计带有同源臂序列的克隆引物，并借助pcr扩增克隆到带有同源臂序列的同源臂dlnreet1序列；pcr产物经过凝胶回收纯化后，通过一步法快速克隆试剂盒同源重组到pyes2表达载体的kpn i和bamh i两个限制性酶切位点之间，获得含有dlnreet1的重组表达载体pyes2::dlnreet1；将构建的重组表达载体重新转化到大肠杆菌dh5α感受态，按照实施案1所述方法对载体中的序列进行验证，确保将dlnreet1正确的连接到了重组表达载体pyes2::dlnreet1中。
[0050]
2、酵母感受态细胞转化及鉴定：
[0051]
利用酵母快速转化试剂盒，将经过验证的pyes2::dlnreet1重组酵母表达载体与
空载体pyes2分别转入到酿酒酵母by4741株系中，将转化后的酵母在sd-u选择培养基上培养筛选阳性菌落，提取阳性单克隆酵母菌株的质粒并回转大肠杆菌dh5α进行二次测序验证。
[0052]
3、酵母敏感性实验：
[0053]
将验证通过的含有pyes2::dlnreet1重组表达载体和pyes2空载体的单克隆酵母(即含有dlnreet1基因的酵母和空白对照)放入sd-u液体培养基中过夜培养(30℃，200rpm)；待od
600
为0.8～1.0时，按照10-1
、10-2
、10-3
、10-4
进行梯度稀释，在分别含有0μm和20μm稀土元素镧(la)的固体培养基上进行打点；将培养基倒置培养3～7天后，观察拍照。
[0054]
含有dlnreet1基因和不含dlnreet1基因的酵母对稀土元素的敏感性测试结果如图1a所示，由图1a可知，含有dlnreet1基因和不含dlnreet1基因的酵母在不含稀土元素的培养基上的生长状态一致，而将当两种酵母接种至含有la的培养基上生长时，含有dlnreet1基因的酵母的生长明显受到抑制，表明其可能因吸收了更多的稀土元素la而中毒。
[0055]
4、酵母稀土富集实验：
[0056]
为了进一步验证dlnreet1基因的功能，将含有dlnreet1基因和不含dlnreet1基因的酵母分别转移到sd-u液体培养基中培养，待酵母生长到od
600
为1.0时，将酵母离心重悬，分别转入含有轻稀土元素(10μm lacl3，10μm ndcl3)和重稀土元素(10μm ybcl3)的酵母培养基中(培养基不含p，ph为4.2)，在30℃摇床培养富集稀土2h后收集酵母；将收集的酵母先用20mm mes-10mm edta清洗剂去除酵母表面吸附的稀土元素3遍，再用无菌水清洗3遍，放入60℃烘箱烘干3天；称量烘干后的酵母细胞，消解后用icp-ms测定其体内的稀土含量。
[0057]
含有dlnreet1基因和不含dlnreet1基因的酵母体内的稀土元素含量的测定结果如图1b所示，由图1b可知，表达了芒萁dlnreet1基因的酵母(含有dlnreet1基因的酵母)对三种稀土元素(la、nd、yb)的富集能力均显著高于对照酵母pyes2株系(不含dlnreet1基因)，表明dlnreet1基因编码的dlnreet1蛋白具有稀土的转运能力，且其对轻稀土元素的转运能力更强，可用于稀土元素的富集。
[0058]
实施例3
[0059]
本发明利用模式植物拟南芥对实施例1所述芒萁dlnreet1蛋白的功能进行了验证，过程如下所示：
[0060]
1、dlnreet1植物表达载体的构建：
[0061]
以实施例1中构建的芒萁dlnreet1基因的克隆载体为模板，利用诺维赞公司ce design软件设计带有同源臂序列的克隆引物，并借助pcr扩增克隆到带有同源臂序列的同源臂dlnreet1序列；pcr产物经过凝胶回收纯化后，通过一步法快速克隆试剂盒将dlnreet1同源重组到植物过表达载体psn1305(pcambia1305)上，该载体带有camv 35s强启动子，能够将目标基因在植物体内大量表达；将重组的载体重新转化到大肠杆菌dh5α感受态，按照实施案例1所述方法进行序列验证。
[0062]
2、农杆菌侵染转化拟南芥：
[0063]
将含有dlnreet1基因的psn1305载体转化农杆菌gv3101，提取质粒回转大肠进行二次序列验证。将验证通过的农杆菌在含有利福平和卡那霉素抗性的lb液体培养基中培养活性最佳状态(od
600
＝1.0)，离心获得农杆菌并用侵染液重悬农杆菌；将开花期的健康拟南
芥花蕊浸泡在含有农杆菌的侵染液中45s；每棵拟南芥花蕊需要连续三周侵染，每周侵染一次；侵染后收获拟南芥种子(t0代)，在t0代种子中筛选阳性苗并在土壤中培育至t1代；收获t1代种子后继续筛选阳性苗，培育至t2代，筛选鉴定出t2代纯合子阳性苗，进行稀土富集能力的实验。
[0064]
3、拟南芥dlnreet1超表达株系功能验证：
[0065]
为了验证芒萁体内稀土转运基因dlnreet1能否在其他植物中发挥功能，本发明挑选鉴定过的t2代纯合拟南芥株系ex2和ex10，与野生型拟南芥wt一同在1/2ms培养基上无菌发苗。挑选钕(nd)代表稀土元素，将长势一致的拟南芥植物分别转到含有1μm nd和5μm nd的培养基上，在相同条件下培养7天后收获植物；将植物分为地上部和根系，其中根系用5mm cacl2解析15min后用超纯水清洗三遍，地上部用超纯水清洗三遍后称量植物鲜重并进行消解，测量植物不同组织体内的稀土含量。
[0066]
过表达dlnreet1的拟南芥和野生型拟南芥的地上部和根系中的稀土元素含量的测定结果如图2所示，由图2可知，过表达dlnreet1基因的拟南芥株系ex2和ex10的根系和地上部中，稀土nd的富集浓度均显著高于野生型拟南芥wt；且随着稀土处理浓度的增加，ex2和ex10株系地上部中的稀土元素的浓度显著提高，而wt株系地上部的浓度提升不明显。当稀土元素含量升高至5μm时，过表达dlnreet1基因的拟南芥株系地上部的稀土元素含量为野生型拟南芥的3倍，表明利用dlnreet1基因构建的转基因植物材料具有很强的稀土富集能力。
[0067]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。