日本血吸虫虫卵及其分泌排泄蛋白抗肿瘤的作用及制备和用途

1.本发明属于寄生虫学和肿瘤学领域；更具体地，本发明涉及日本血吸虫感染及其虫卵分离和制备、虫卵培养上清制备和采用基因工程技术制备重组虫卵分泌排泄蛋白及其抗肿瘤的用途。


背景技术：

2.血吸虫病(schistosomiasis)是血吸虫寄生于人体或哺乳动物引起的一种人兽共患寄生虫病，其中以日本血吸虫、埃及血吸虫和曼氏血吸虫流行范围广、危害大，我国仅有日本血吸虫病流行。日本血吸虫成虫产生的虫卵可以在肝脏内沉积，沉积的虫卵发育成熟后，卵内毛蚴分泌和排泄虫卵抗原(以下统称为“虫卵分泌排泄蛋白”)渗透到周围肝组织中，引起淋巴细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞等在虫卵周围聚集，形成虫卵肉芽肿，进而引起肝纤维化病变，并导致肝硬化。
3.日本血吸虫感染宿主早期，以肝脏巨噬细胞为代表的天然免疫细胞在初始的炎症反应中发挥重要作用。血吸虫表面分子或分泌因子激活巨噬细胞，促进m1型巨噬细胞表达白细胞介素1(interleukin-1，il-1)、il-12、inos等，同时巨噬细胞将血吸虫抗原提呈给t细胞，进一步促进炎性细胞因子和趋化因子的产生，从而促进对病原体的清除并引起炎症反应和机体损伤。到了感染后期，m2型巨噬细胞被激活，分泌il-13、精氨酸酶1(arginine-1，arg-1)等促纤维化细胞因子，参与炎症消退和组织修复。
4.近年来，寄生虫感染与肿瘤发生发展之间的关系逐渐得到重视和研究。尽管一些寄生虫如华支睾吸虫等已被列为生物致癌因子，但不同的实验室报道部分寄生虫感染与肿瘤之间呈负向关联。流行病学研究显示包虫病发病率与某些类型的实体肿瘤发病率呈负相关；动物模型研究显示刚地弓形虫抑制小鼠黑色素瘤与肺腺癌的发展。这些寄生虫感染介导的抗肿瘤机制仍不清楚，但诱导机体产生抗肿瘤天然免疫是其中的潜在机制。
5.在日本血吸虫感染方面，日本血吸虫虫卵是该病主要的致病因素，大量虫卵沉积在肝脏中可引起肝脏慢性炎性肉芽肿，进一步导致肝纤维化，最终发生肝硬化。慢性炎症和纤维化是导致肝癌的重要风险因素，而肝硬化本身更是一个独立的致癌因素，在基础疾病相同的情况下，有肝硬化的患者可以使肝癌发生率提高30倍。上世纪六、七十年代，在我国一些重度血吸虫病流行区，超过70％的人口感染了日本血吸虫，其中不少患者发展到肝硬化阶段，但日本血吸虫感染与肝癌发生的关联并未证实，也有一些研究认为日本血吸虫感染与肝、肠的恶性肿瘤没有直接关系。虽然目前有少量研究报道日本血吸虫感染可能与肝癌的发生有关，但是这些研究多是临床回顾性研究，另外，可能还存在合并感染丙肝病毒及其致肝癌的作用。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供日本血吸虫感染所产生的虫卵及其分泌排泄产物和重组
虫卵分泌排泄蛋白用于人类肿瘤的预防和治疗。
7.本发明的另外一个目的是通过对虫卵分泌排泄蛋白进行大量筛选和鉴定，发现具有诱导宿主产生抗肿瘤作用的日本血吸虫虫卵分泌排泄蛋白，并制备出重组蛋白，用于肿瘤的治疗和预防。
8.在本发明的第一方面，提供了一种物质的用途，所述物质用于制备一制剂或组合物，所述制剂或组合物用于(a)预防和/或治疗肿瘤；(b)活化肺泡巨噬细胞(am)；和/或(c)活化天然免疫；
9.其中，所述物质选自下组：
10.(z1)血吸虫的虫卵多肽或其编码序列或表达所述虫卵多肽的表达载体，其中所述虫卵多肽包括：sj-sp-19或其活性成分、sj-sp-489或其活性成分、或其组合；
11.(z2)血吸虫的活虫卵培养上清(fes)的f4组分，所述f4组分是采用截留30kd和50kd的millipore超滤离心管制备，基本上是由分子量约30-50kd的多肽构成；
12.(z3)来自血吸虫的活虫卵培养上清(fes)的蛋白组分，所述蛋白组分不含有或基本上不含有除了蛋白之外的其他来源于血吸虫的成分，且不含有或基本上不含有来源于除血吸虫属(schistosoma)物种以外的物种的成分；
13.(z4)血吸虫的活虫卵的培养上清(fes)；
14.(z5)上述z1～z4的任意组合。
15.在另一优选例中，所述血吸虫包括日本血吸虫和曼氏血吸虫。
16.在另一优选例中，所述的虫卵多肽包括野生型和突变型的虫卵多肽。
17.在另一优选例中，所述的虫卵多肽包括虫卵多肽的活性片段。
18.在另一优选例中，所述的虫卵多肽包括虫卵多肽或其活性片段的药学上可接受的盐或酯。
19.在另一优选例中，所述的活化肺泡巨噬细胞是指上调肺泡巨噬细胞的il-1β、tnf-α和il-12等免疫效应分子和/或抗肿瘤相关因子和/或通路的表达。
20.在另一优选例中，所述的天然免疫为哺乳动物体内的天然免疫。
21.在另一优选例中，所述的肿瘤包括：肺癌、肝癌、黑色素瘤、白血病、恶性淋巴瘤、肾癌、口腔上皮癌、头颈癌、脑瘤、胶质细胞瘤、胃癌、食管癌、卵巢癌、结直肠癌、宫颈癌、胰腺癌、前列腺癌、或乳腺癌。
22.在另一优选例中，所述的肿瘤选自下组：肺癌、肝癌、黑色素瘤、白血病、恶性淋巴瘤、乳腺癌、脑癌、前列腺癌、卵巢癌、子宫癌、结直肠癌、骨肉瘤、胰腺癌。
23.在另一优选例中，所述的肿瘤选自下组：肺癌、肝癌、黑色素瘤、白血病、恶性淋巴瘤。
24.在另一优选例中，所述的制剂或组合物用于抑制转移瘤形成。
25.在另一优选例中，所述的转移瘤包括肺转移瘤、肝转移瘤、骨转移瘤、脑转移瘤、或其组合。
26.在另一优选例中，所述的转移包括肝癌的肺转移、乳腺癌的肺转移、黑色素瘤肺转移、胃癌和结直肠癌肺转移、肺癌的脑转移、肺癌的骨转移、或其组合。
27.在另一优选例中，所述的血吸虫虫卵多肽包括重组的、人工合成的或天然的sj-sp-19和sj-sp-489多肽。
28.在另一优选例中，所述的血吸虫虫卵多肽sj-sp-19的氨基酸序列如seq id no:1所示。
29.在另一优选例中，所述的血吸虫虫卵多肽sj-sp-489的氨基酸序列如seq id no:2所示。
30.在另一优选例中，所述的虫卵多肽包括含有标签序列的重组多肽。
31.在另一优选例中，所述含有标签序列的重组多肽如seq id no:3、seq id no:4所示。
32.在另一优选例中，所述的sj-sp-19的含有his tag的sjhis-sp-19的氨基酸序列如seq id no:3所示。
33.在另一优选例中，所述的sj-sp-489的含有his tag的sjhis-sp-489的氨基酸序列如seq id no:4所示。
34.在另一优选例中，所述血吸虫虫卵多肽包括在保持其多肽活性范围内，在序列seq id no:1、seq id no:2的基础上进行一个或多个氨基酸的替换、缺失、或插入所得到的氨基酸序列。
35.在另一优选例中，所述血吸虫虫卵多肽包括在保持其多肽活性范围内，在序列seq id no:1、seq id no:2的n末端或c末端进行一个或多个氨基酸的插入所得到的氨基酸序列；所述插入的氨基酸残基个数包括1-35个，较佳地1-15个，更佳地1-10个。
36.在另一优选例中，所述血吸虫虫卵多肽包括在保持其多肽活性范围内，在序列seq id no:1、seq id no:2的n端或c端带有一个或多个蛋白标签的重组蛋白。
37.在另一优选例中，所述蛋白标签选自下组：mbp标签、his标签、gst标签、sumo标签、trx标签、ha标签、flag标签，或其组合。
38.在另一优选例中，所述的血吸虫的虫卵多肽的编码序列如seq id no:5、seq id no:6所示。
39.在本发明的第二方面，提供了一种药物组合物，含有(a)药学上可接受的载体和(b)活性成分，其中，所述活性成分选自下组：
40.(z1)血吸虫的虫卵多肽或其编码序列或表达所述虫卵多肽的表达载体，其中所述虫卵多肽包括：sj-sp-19、sj-sp-489或其组合；
41.(z2)血吸虫的活虫卵培养上清(fes)的f4组分，所述f4组分是采用截留30kd和50kd的millipore超滤离心管制备，基本上是由分子量约30-50kd的多肽构成；
42.(z3)来自血吸虫的活虫卵培养上清(fes)的蛋白组分，所述蛋白组分不含有或基本上不含有除了蛋白之外的其他来源于血吸虫的成分，且不含有或基本上不含有来源于除血吸虫属(schistosoma)物种以外的物种的成分；
43.(z4)血吸虫的活虫卵的培养上清(fes)；
44.(z5)上述z1～z4的任意组合。
45.在另一优选例中，所述组分(b)占所述药物组合物总重量的0.1-99.9wt％，较佳地10-99.9wt％，更佳地70％-99.9wt％。
46.在另一优选例中，所述制剂或组合物可单独使用，或联合使用。
47.在另一优选例中，所述的药物组合物还含有：(c)第二活性成分，所述的第二活性成分选自下组的额外的肿瘤治疗药物：化疗药物、抗体药物、或其组合。
48.在另一优选例中，所述的药物组合物的剂型为液体剂型。
49.在另一优选例中，药物组合物的剂型为脂质体制剂。
50.在另一优选例中，所述药物组合物为液态、固体、或半固体组合物。
51.在另一优选例中，所述药物组合物为液态组合物。
52.在另一优选例中，所述药物组合物的剂型为注射剂、或外用药物剂型。
53.在另一优选例中，所述药物组合物的剂型包括注射剂或冻干制剂。
54.在另一优选例中，所述药物组合物的剂型为注射剂。
55.在另一优选例中，所述药学上可接受的载体选自下组：输液剂载体和/或注射剂载体，较佳地，所述的载体是选自下组的一种或多种载体：生理盐水、葡萄糖盐水、或其组合。
56.在另一优选例中，所述的第一活性成分为具有seq id no:1和/或seq id no:2所示核心序列的多肽，或为保持其多肽活性范围内的突变体。
57.在另一优选例中，所述的第一活性成分为表达具有seq id no:1和/或seq id no:2所示核心序列的多肽、或保持其多肽活性范围内的突变体的表达载体。
58.在另一优选例中，所述的表达载体包括质粒。
59.在另一优选例中，所述的表达载体或质粒含有启动子、复制起点和标记基因。
60.在另一优选例中，所述的表达载体中含有表达多肽的表达盒。
61.在另一优选例中，所述的药物组合物的施用方法包括：呼吸道给药、注射给药、透皮给药、粘膜给药。
62.在另一优选例中，所述的药物组合物用选自下组的方式进行施用：皮下注射、肌内注射、静脉注射。
63.在另一优选例中，所述的药物组合物的剂型包括喷雾剂、气雾剂、粉雾剂或栓剂。
64.在另一优选例中，所述受试者包括：哺乳动物。
65.在另一优选例中，所述的哺乳动物包括人或非人哺乳动物。
66.在另一优选例中，所述非人哺乳动物包括：啮齿动物(如大鼠、小鼠)、灵长动物(如猴)。
67.在本发明的第三方面，提供了一种有效部位，所述有效部位为fes的f4组分(约30-50kd)。
68.在本发明的第四方面，提供了一种虫卵多肽组合，所述的虫卵多肽组合基本上由sj-sp-19和sj-sp-489构成，或由sj-sp-19和sj-sp-489的融合蛋白构成。
69.在另一优选例中，在所述虫卵多肽组合中，sjhis-sp-19和sjhis-sp-489总含量，或sj-sp-19和sj-sp-489的融合蛋白的含量，为≥90wt％，较佳地≥95wt％，更佳地≥99wt％，按所述虫卵多肽组合中所有多肽的总重量计。
70.在本发明的第五方面，提供了一种核酸组合，所述的核酸组合基本上由编码sj-sp-19的第一核酸和编码sj-sp-489的第二核酸构成。
71.在另一优选例中，所述的第一核酸和第二核酸各自独立地为线性的或位于表达载体上。
72.在另一优选例中，所述的第一核酸如seq id no:5所示。
73.在另一优选例中，所述的第二核酸如seq id no:6所示。
74.在本发明的第六方面，提供了一种本发明第三方面所述的有效部位或本发明第四
方面所述的虫卵多肽组合、本发明第五方面所述的核酸组合、或本发明第二方面所述的药物组合物的用途，用于制备一药物，所述药物用于(a)预防和/或治疗肿瘤；(b)活化肺泡巨噬细胞(am)；和/或(c)活化天然免疫。
75.在本发明的第七方面，提供了一种体外活化肺泡巨噬细胞的方法，在一种物质的存在下，培养肺泡巨噬细胞，从而获得活化的肺泡巨噬细胞，所述物质如本发明第一方面中所述。
76.在另一优选例中，所述活化肺泡巨噬细胞时所用物质浓度大于10μg～1000μg/ml，时间为24～72小时。
77.在本发明的第八方面，提供了一种经活化的肺泡巨噬细胞，所述的经活化的肺泡巨噬细胞是用权利要求7所述的方法制备的。
78.在另一优选例中，所述的经活化的am细胞具有以下一个或多个特征：
79.(y1)il-1β表达上调；
80.(y2)tnf-α表达上调；
81.(y3)il-12表达上调
82.(y4)nos2表达上调
83.在本发明第九方面，提供了一种细胞制剂或药物组合物，含有本发明第八方面所述的经活化的肺泡巨噬细胞和药学上可接受的载体。
84.在本发明的第十方面，提供了一种本发明第八方面所述的经活化的肺泡巨噬细胞的用途，用于制备一药物，所述药物用于：预防和/或治疗肿瘤。
85.在另一优选例中，所述的用途包括，向所需对象，通过静脉回输所述的经活化的肺泡巨噬细胞，从而达到预防和/或治疗肿瘤的目的。
86.在本发明的第十一方面，提供了一种治疗肿瘤的方法，包括步骤：将安全有效量的活性成分或含所述的活性成分的药物组合物施用于所需对象，从而治疗所述对象的肿瘤，其中，所述的活性成分选自下组：一种物质，所述物质如本发明第一方面中所述；本发明第八方面所述的经活化的肺泡巨噬细胞；或其组合。
87.在另一优选例中，当所述的活性成分为一种物质，所述物质如本发明第一方面中所述，则其施用的剂量为0.05-10mg/kg，较佳地，为0.1-5mg/kg。
88.在另一优选例中，当所述的活性成分为权利要求8所述的经活化的肺泡巨噬细胞，则其施用的剂量为小鼠每次5
×
105个/只，或人每次106～10
10
/60kg。
89.应理解，在本发明范围内，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一赘述。
附图说明
90.图1为显示日本血吸虫感染对肺部转移瘤的抑制作用。a，实验设计示意图；b，肺腺癌llc小鼠模型；c，b16黑色素瘤小鼠模型。
91.图2为显示日本血吸虫虫卵抑制小鼠肺部转移瘤。a，实验设计；b，活虫卵抑制肺部llc肿瘤细胞的转移瘤；c，活虫卵延长小鼠生存期；活虫卵(f-egg)；煮沸灭活死虫卵(d-egg)；d，新鲜分离的日本血吸虫虫卵。
92.图3为显示日本血吸虫活虫卵抑制nod-scid小鼠肺部转移瘤。a，llc肿瘤细胞模型；b，b16肿瘤细胞模型；f-egg：活虫卵；d-egg：煮沸灭活死虫卵。
93.图4为显示沉积在肺部的活虫卵对肝脏转移瘤的抑制作用。实验采用nod-scid小鼠和b16肿瘤细胞模型；f-egg：活虫卵；d-egg：煮沸灭活死虫卵。
94.图5为显示虫卵培养上清对肺部和肝脏肿瘤的抑制作用。fes：活虫卵培养上清；des：死虫卵培养上清；control:培养液对照。
95.图6为显示动态分析虫卵诱导肺部免疫细胞的变化。a，通过流式细胞术动态分析注射虫卵或pbs后小鼠支气管肺泡灌洗液(上)和肺组织(下)中t细胞、b细胞、nk细胞数目变化情况。b、c，动态分析注射虫卵或pbs后小鼠肺组织中肺泡巨噬细胞(ams)(b)和其他种类巨噬细胞(cd11c-)(c)数目变化情况。采用双因素方差分析和sidak事后检验。*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001。
96.图7为显示肺泡巨噬细胞介导的抗肿瘤作用。a，小鼠注射活虫卵和经支气管给予氯磷酸盐脂质体，通过流式细胞术检测支气管肺泡灌洗液中ams的占比情况。b，c57bl/6小鼠(llc肿瘤模型)或nod-scid小鼠(b16-f10肿瘤模型)注射活虫卵和清除ams后肺转移瘤数目变化情况。c，小鼠经支气管给予氯磷酸盐脂质体和感染日本血吸虫，支气管肺泡灌洗液中ams的占比情况。d，感染日本血吸虫的c57bl/6小鼠(b16-f10肿瘤模型)肺转移瘤数目变化情况。采用t检验或单因素方差分析。**p《0.01，***p《0.001。
97.图8为显示fes活化的ams体外杀伤肿瘤细胞的作用。a，从注射虫卵或pbs小鼠中分离出原代ams，通过高内涵检测ams对llc肿瘤细胞的杀伤作用。比例尺＝125μm。b，用不同浓度fes刺激的mh-s细胞与b16-gfp/luc共培养，通过流式检测gfp、f4/80双阳性mh-s(即吞噬了b16-gfp/luc的mh-s细胞)占总mh-s细胞的比例。c，从注射fes或pbs小鼠中分离出原代ams，按照4:1比例与b16-gfp/luc共培养，通过流式检测gfp、f4/80双阳性ams(即吞噬了b16-gfp/luc的ams)占总ams的比例。d，从注射虫卵或pbs小鼠体内分离出原代ams，回输至c57bl/6小鼠(llc肿瘤模型)或nod-scid小鼠(b16-f10肿瘤模型)体内，计数肺转移瘤情况。采用t检验或单因素方差分析和tukey事后检验。*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001。
98.图9为显示三组ams单细胞测序及分群。a，ams单细胞测序(上)和流式分选(下)流程示意图。b，原始29052个细胞tsne聚类结果中细胞类型注释信息。c、d，27796个ams tsne聚类结果中细胞分群信息(c)和样本分布信息(d)。e，各亚群细胞的样本来源分布情况。
99.图10为显示ams极化表型和抗肿瘤功能基因集的富集分析。a，不同样本中m1型巨噬细胞标志基因平均表达水平。b，部分m1型标志基因的表达水平小提琴图。c-e，氧应激、炎症小体和吞噬作用相关基因集富集分析。氧应激(c)、炎症小体(d)和吞噬作用(e)富集分数在不同样本中的经验累积分布图(左)和相关基因表达水平(右)。
100.图11为显示fes活化ams抗肿瘤效应分子的鉴定。a，比较不同样本中细胞杀伤作用相关基因集富集分数。b，与肿瘤抑制作用相关的细胞因子在不同样本中的表达差异热图。c、d，图b中的部分细胞因子表达水平点状图(c)和tsne聚类图(d)。
101.图12为显示fes活化ams抗肿瘤效应分子il-1β的实验分析。a，注射虫卵或pbs的小鼠ams中il1b mrna表达水平。b，注射虫卵或pbs的小鼠血清中成熟il-1β表达水平。c，注射fes或pbs的小鼠血清中成熟il-1β表达水平。d，c57bl/6小鼠(b16-f10肿瘤模型)注射fes和il-1β抗体(b122)后肺转移瘤数目。e，il-1β-/-小鼠注射fes后肺转移瘤数目。采用t检验或
单因素方差分析。*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001。
102.图13为显示不同酶处理fes对mh-s活化的影响。proteinase k、dnase i和rnase a处理后的fes，加入mh-s细胞培养24h后，rt-qpcr测定细胞il1b、marco和nos2 mrna表达水平。数据为各组mrna相对于medium control组的相对表达水平，内参基因为gapdh，表示为mean
±
sd，n＝4。数据分析采用多因素方差分析，***,p《0.001。
103.图14为显示fes组分活化mh-s细胞及体内抗肿瘤的作用。a，采用不同分子量截留的millipore超滤离心管，将fes制成5个不同分子量范围的组分(f1 to f5),即.f1＜3kda；3＜f2＜10kda；10＜f3＜30kda；30＜f4＜50kda and f5＞50kda。含不同分子量蛋白的fes组分加入mh-s细胞培养24h后，rt-qpcr测定细胞il1b，marco和nos2 mrna表达水平。数据为各组mrna相对于medium组的相对表达水平，内参基因为gapdh，表示为mean
±
sd，n＝4，***,p《0.001；b、c，体内b16/f10细胞小鼠模型，b，实验设计示意图；c，小鼠肺部和肝脏转移瘤个数；d，代表性的小鼠肺部组织中转移瘤he染色病理切片。小鼠体内肝、肺部肿瘤个数，表示为mean
±
sd，n＝6，**,p《0.01.medium：培养基对照；fes：虫卵培养上清液；f4：含有分子量30-50kda蛋白的fes。
104.图15为显示f4组分重组蛋白活化mh-s表达il-1β效应蛋白筛选。a，部分蛋白诱导表达的电泳图。ib：大肠杆菌裂解液离心后的沉淀部分；ss：大肠杆菌裂解液离心后的上清液部分；b，部分蛋白纯化后的蛋白电泳图；c，重组蛋白刺激mh-s细胞(肺泡巨噬细胞系)后il1b mrna的表达水平。数值表示为mean
±
sd，n＝3，**,p《0.01，统计分析采用单因素方差分析。d，蛋白酶k处理的重组蛋白对mh-s细胞表达il1b mrna的影响
105.图16为显示sjgst-sp重组蛋白活化mh-s表达il-1β的效应蛋白筛选。a，部分sjgst-sp蛋白表达产物的sds-page电泳图；b，183种sjgst-sp重组蛋白刺激mh-s分泌il-1β的检测；c，初筛结果阳性的4种蛋白重复实验结果。数据为样本和阴性对照光强度的比值r＝(样本两复孔的平均值-空白两复孔的平均值)/(阴性对照两复孔的平均值-空白两复孔的平均值)；d，sjhis-sp-57和sjhis-sp-489重组蛋白的sds-page电泳图,ib：大肠杆菌裂解液离心后沉淀；ss：大肠杆菌裂解液离心后上清液；e，刺激mh-s分泌il-1β的水平检测,ctr1和ctr2组为带his标签的无关重组蛋白；f，western blot和蛋白质谱分析sjsp-489重组蛋白，以小鼠抗sjhis-sp-489血清为一抗，检测fes中的sjsp-489蛋白(左侧)。质谱分析纯化后2个sjsp-489重组蛋白氨基酸序列。红色表示质谱分析结果与目的蛋白氨基酸序列吻合的部分。
106.图17为显示效应蛋白抑制小鼠肿瘤生长的作用。a，实验方案，每组8只小鼠，注释抗原剂量为30μg/次；b，各组小鼠肺部肿瘤个数；c，各组小鼠肝脏肿瘤个数；d、e，每组8只小鼠，注释抗原剂量为60μg/次,各组小鼠肺部肿瘤个数(d)；各组小鼠肝脏肿瘤个数(e)。***：与pbs组比较p《0.01；ns：与pbs组比较无显著差异。sjhis-sp-12和30μg sjhis-sp-24为体外筛选的阴性蛋白。
107.图18为显示效应蛋白体内外活化小鼠肺泡巨噬细胞的作用。a，il1b；b，il12 mrna的表达，数据为巨噬细胞il1b、il12 mrna的相对表达水平，以gapdh为内参，pbs组为对照(n＝3)；c，为il-1β分子阳性的小鼠肺泡巨噬细胞占总巨噬细胞的百分比；d，为il-12分子阳性的小鼠肺泡巨噬细胞占总巨噬细胞的百分比；e，为小鼠血清il-1β浓度。***：与pbs组比较有非常显著差异，
108.图19为显示sj-sp-19(fn316857)同源序列比对。sj：日本血吸虫；sh：埃及血吸虫；sm：曼氏血吸虫；ms：小鼠；hs:人。
109.图20为显示sj-sp-489(ay814009)同源序列比对。sj：日本血吸虫；sh：埃及血吸虫；sm：曼氏血吸虫。
具体实施方式
110.本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外地发现了日本血吸虫虫卵，及其培养上清、分泌排泄蛋白，具有激活肺泡巨噬细胞，抑制肿瘤形成与转移等抗肿瘤作用。
111.具体地，本发明人基于一类现象或规律，即，以前大量感染日本血吸虫的患者会发展为肝纤维化和甚至肝硬化，却较少由肝纤维化和肝硬化发展为肝癌，因而提出假说：日本血吸虫感染能诱导宿主产生抗肿瘤免疫并能提高宿主抵抗肿瘤发生发展的作用。如果能通过实验进一步明确诱导抗肿瘤免疫的虫源分子，可以将其转化为预防和治疗这类疾病的新方法。为此，本发明应用日本血吸虫自然感染小鼠模型和采用分离纯化的活虫卵构建虫卵肉芽肿肺模型，结合小鼠肺腺癌细胞系(llc)和黑色素瘤细胞系(b16)转移瘤模型对此假说开展实验研究，表明了日本血吸虫自然感染、分离纯化的活虫卵及其培养上清液能诱导宿主产生强大的抗肿瘤作用，并表明该抗肿瘤作用是通过活化肺泡巨噬细胞及其分泌il-1β等发挥作用的，并筛选鉴定了2个虫卵分泌排泄蛋白为活化天然免疫和抗肿瘤的虫源效应分子。
112.术语
113.为了更容易理解本发明，以下具体定义了某些技术和科学术语。除非在本文中另有明确定义，本文使用的所有其它技术和科学术语都具有本发明所属领域的一般技术人员通常理解的含义。在描述本发明之前，应当理解本发明不限于所述的具体方法和实验条件，因为这类方法和条件可以变动。还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案，并且意图不是限制性的，本发明的范围将仅由所附的权利要求书限制。
114.除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。
115.如本文所用，术语“任选”或“任选地”意味着随后所描述的事件或情况可以发生但不是必须发生、可以有但不是必须有，可以是1个、2个或3个。
116.血吸虫虫卵多肽
117.如本文所用，术语“血吸虫虫卵多肽”、“本发明蛋白”、“本发明多肽”可互换使用，指由sj-sp-19(seq id no:1)和/或sj-sp-489(seq id no:2)构成的蛋白质，并且具有激活肺泡巨噬细胞和/或抗癌的活性。应理解，该术语不仅包括在野生型的指由sj-sp-19(seq id no:1)和/或sj-sp-489(seq id no:2)蛋白，还包括其n-末端插入his标签蛋白的sjhis-sp-19和sjhis-sp-489，以及其插入其他标签蛋白；还包括其突变蛋白，只要这些突变不影响或基本上不影响其活性效果。
118.本发明所涉及的氨基酸序列如下所示：
119.野生型sj-sp-19(seq id no:1)：
120.mvymikydsthgkfqgdvsvengklnvngrlisvycerdplnipwnkdgaeyvvestgvfttidkaqahikndrakkviisapsadapmfvvgvnektydksmsvvsnascttnclaplakvindnfeiveglmttvhsftatqktvdgpssklwrdgrgafqniipastgaakavgkvipalngkltgmafrvptanvsvvdltcrlgkgatydqikavikaaangplkgileytedevvssdfigctsssifdakagislnnnfvklvswydnefgyscrvvdlithmhrvdhs
121.野生型sj-sp-489(seq id no:2)：
122.mnqikprilfllvllidlydrilasnydqyidrltndgkllyddyikqnpslesalerlytlqhpifqedypgnyeitdkqwnaflneidqaklgrlqnndadkpemtysnldrksnyelypntnnnndkvlnepslterrneiayqnplwgehkvtggssetgqwidyallgagaqdlldnessvdnfnlsneiesshieskvdnlpaycdppnpcplnykshdlpspcdhgiedtiefnrnwiirkmengecscdnehmdscpiesnengdknnfvsaqkadrkpywvnpylrgesrkrlvakkrvkrshtsfpsfqvyhynpylmgsvhktavkkigpykpshekym
123.带有his tag的sjhis-sp-19序列(seq id no:3)
124.mgsshhhhhhssglvprgshmasmtggqqmgrgsmvymikydsthgkfqgdvsvengklnvngrlisvycerdplnipwnkdgaeyvvestgvfttidkaqahikndrakkviisapsadapmfvvgvnektydksmsvvsnascttnclaplakvindnfeiveglmttvhsftatqktvdgpssklwrdgrgafqniipastgaakavgkvipalngkltgmafrvptanvsvvdltcrlgkgatydqikavikaaangplkgileytedevvssdfigctsssifdakagislnnnfvklvswydnefgyscrvvdlithmhrvdhs
125.带有his tag的sjhis-sp-489序列(seq id no:4)
126.mgsshhhhhhssglvprgshmasmtggqqmgrgsmnqikprilfllvllidlydrilasnydqyidrltndgkllyddyikqnpslesalerlytlqhpifqedypgnyeitdkqwnaflneidqaklgrlqnndadkpemtysnldrksnyelypntnnnndkvlnepslterrneiayqnplwgehkvtggssetgqwidyallgagaqdlldnessvdnfnlsneiesshieskvdnlpaycdppnpcplnykshdlpspcdhgiedtiefnrnwiirkmengecscdnehmdscpiesnengdknnfvsaqkadrkpywvnpylrgesrkrlvakkrvkrshtsfpsfqvyhynpylmgsvhktavkkigpykpshekym
127.*下划线部分为载体上的his tag序列。
128.在本发明中，本发明的蛋白还包括其保守性变异体，指与本发明蛋白的氨基酸序列(seq id no:1和/或seq id no:2)相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。
129.表1
[0130][0131][0132]
如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。
[0133]
本发明的多核苷酸可以是dna形式或rna形式。dna形式包括cdna、基因组dna或人工合成的dna。dna可以是单链的或是双链的。dna可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与seq id no:5、6所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有seq id no:1、2的蛋白质，但与seq id no:5、6所示的编码区序列有差别的核酸序列。
[0134]
本发明所涉及的核苷酸序列如下所示：
[0135]
sj-sp-19(seq id no:5)：
[0136]
atggtgtacatgataaaatatgactccacccatggaaagtttcaaggtgatgtttcggttgagaacggaaaacttaatgtcaatggaaggcttatatcagtttactgcgagagggatccattgaacataccatggaacaaggatggtgctgagtatgttgtagagtccactggagtcttcactacaattgataaagctcaagctcatattaaaaacgatcgggctaaaaaagttataatatcagctccctcggcagacgcacccatgtttgttgttggtgtgaatgaaaagacttacgacaagtcaatgtctgtggtttcgaatgcatcgtgcaccacaaactgtctagcacctctagctaaagtcattaatgacaattttgaaatagttgaaggccttatgactactgtacactcatttacggctacgcaaaagaccgttgatggaccatcttcaaaactgtggagagatggtcgtggggcgtttcagaatattattccagcctccactggtgctgcaaaggcagtgggcaaagtcatccctgcattaaacggaaagttgacaggaatggctttccgggtgcctacagcgaatgtttcagtagttgacctgacatgcagattgggcaaaggagctacctacgatcaaatcaaggctgtgatcaaagcagccgcaaatggaccattaaaaggcatcttggaatatactgaagatgaagttgtcagctcagactttattggatgtaccagttcatccatatttgatgcaaaggctggaatctctctcaacaacaatttcgtgaaactggtttcatggtacgacaatgaattcggctacagttgccgcgtggtcgatctcatcacgcatatgcatagagtcgaccattctta
[0137]
sj-sp-489(seq id no:6)：
[0138]
atgaaccaaatcaaacctagaatattatttctgttagtgcttttaattgatctgtatgatcgaatattagcaagtaattatgatcagtatatagatagattgacaaatgatggcaaattattatacgatgattatattaaacagaatcctagtttagaatcagcattagaacgattatatacgctacaacatccaatttttcaagaagattatccaggaaattatgagattactgataaacaatggaatgcatttctaaatgaaatcgatcaagctaaattaggcagactgcaaaacaatgatgctgataaaccagagatgacctactcaaatctcgacagaaaatcgaattatgaattgtatccaaatacaaataataataatgacaaagttttaaatgaacctagtttaacagaacgtcgaaatgaaatcgcctatcaaaatccactgtggggtgaacataaagttactggtggttccagtgaaacaggtcaatggatagattatgctttattaggagctggagcacaagatctacttgataatgaatcatcagttgataattttaatctttccaatgaaatagaatcatctcatatagagtcaaaagttgataatttaccagcatattgtgatccacctaatccttgtccattaaattataaatcacatgatttaccgtcaccatgtgatcatggtattgaagatactatcgagtttaatcgaaactggataataaggaaaatggaaaatggtgaatgttcatgtgacaatgaacatatggatagttgcccaattgaatcaaatgaaaatggagacaaaaataattttgtttcagcacaaaaggcggatagaaaaccatactgggttaatccatatctccggggtgaaagtcgaaaaaggctcgtagctaagaaacgagtaaagcgttcacatacttcttttccatcttttcaggtataccattacaatccttatctgatgggtagcgttcataaaacagcagtgaaaaaaattggaccatacaaaccatcccatgaaaaatatatgtaa
[0139]
编码seq id no:5、6的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。
[0140]
术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
[0141]
本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体；也可以是编码相同的氨基酸而使用不同密码子所产生的多核苷酸的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。
[0142]
如本文所用，术语“引物”指的是在与模板配对，在dna聚合酶的作用下能以其为起
点进行合成与模板互补的dna链的寡聚核苷酸的总称。引物可以是天然的rna、dna，也可以是任何形式的天然核苷酸。引物甚至可以是非天然的核苷酸如lna或zna等。引物“大致上”(或“基本上”)与模板上一条链上的一个特殊的序列互补。引物必须与模板上的一条链充分互补才能开始延伸，但引物的序列不必与模板的序列完全互补。比如，在一个3'端与模板互补的引物的5'端加上一段与模板不互补的序列，这样的引物仍大致上与模板互补。只要有足够长的引物能与模板充分的结合，非完全互补的引物也可以与模板形成引物-模板复合物，从而进行扩增。
[0143]
本发明蛋白的核苷酸全长序列或其片段通常可以用pcr扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于pcr扩增法，可根据已公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cdna库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cdna库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次pcr扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
[0144]
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
[0145]
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
[0146]
应用pcr技术扩增dna/rna的方法被优选用于获得本发明的基因。用于pcr的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的dna/rna片段。
[0147]
本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或融合蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述蛋白质的方法。
[0148]
通过常规的重组dna技术，本发明的序列可用来表达或生产重组蛋白。一般来说有以下步骤：
[0149]
(1)用编码本发明蛋白的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；
[0150]
(2)在合适的培养基中培养的宿主细胞；
[0151]
(3)从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
[0152]
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含本发明蛋白的编码dna序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组dna技术、dna合成技术、体内重组技术等。所述的dna序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mrna合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
[0153]
此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(gfp)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。
[0154]
包含上述的适当dna序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
[0155]
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇s2或sf9的昆虫细胞；cho、ns0、cos7、或293细胞的动物细胞等。
[0156]
用重组dna转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收dna的感受态细胞可在指数生长期后收获，用cacl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用mgcl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的dna转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。
[0157]
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
[0158]
在上面的方法中的蛋白质可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超声处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(hplc)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
[0159]
可以用重组法来大批量地获得本发明肽序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到相关肽。
[0160]
此外，还可用化学方法直接合成相关肽序列。
[0161]
药物组合物
[0162]
由于本发明多肽具有优异激活肺泡巨噬细胞和/或抗癌的活性，因此本发明多肽(包括野生型，或其活性片段，或保持其多肽活性范围内的突变体，或其药学上可接受的盐或酯)，以及含有本发明多肽为主要活性成分的药物组合物，可用于激活肺泡巨噬细胞和/或预防和/或治疗肿瘤。
[0163]
本发明的药物组合物包含安全有效量范围内的本发明多肽及药学上可以接受的赋形剂或载体。其中“安全有效量”指的是：化合物的量足以明显改善病情，而不至于产生严重的副作用。通常，药物组合物含有1-2000mg本发明多肽，更佳地，含有10-200mg本发明多肽。较佳地，所述的“一剂”为一个胶囊或药片。
[0164]“药学上可接受的载体”指的是：一种或多种相容性固体或液体填料或凝胶物质，它们适合于人使用，而且必须有足够的纯度和足够低的毒性。“相容性”在此指的是组合物中各组分能和本发明靶向抑制剂以及它们之间相互掺和，而不明显降低化合物的药效。药学上可以接受的载体部分例子有纤维素及其衍生物(如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素钠、纤维素乙酸酯等)、明胶、滑石、固体润滑剂(如硬脂酸、硬脂酸镁)、硫酸钙、植物油(如豆油、芝麻油、花生油、橄榄油等)、多元醇(如丙二醇、甘油、甘露醇、山梨醇等)、乳化剂(如)、润湿剂(如十二烷基硫酸钠)、着色剂、调味剂、稳定剂、抗氧化剂、防腐剂、无热原水等。
[0165]
本发明多肽或药物组合物的代表性的施用方式包括(但并不限于)：吸入式和肠胃外(静脉内、肌肉内或皮下)。
[0166]
用于肠胃外注射的组合物可包含生理上可接受的无菌含水或无水溶液、分散液、悬浮液或乳液，和用于重新溶解成无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉末。适宜的含水和非水载体、稀释剂、溶剂或赋形剂包括水、乙醇、多元醇及其适宜的混合物。
[0167]
用于吸入式的组合药可包含气雾剂、喷雾剂等。
[0168]
本发明多肽可以单独给药，或者与其他药学上可接受的化合物联合给药。
[0169]
联合给药时，所述药物组合物还包括与一种或多种(2种，3种，4种，或更多种)其他药学上可接受的化合物。该其他药学上可接受的化合物中的一种或多种可与本发明的化合物同时、分开或顺序地施用。
[0170]
使用药物组合物时，是将安全有效量的本发明多肽适用于需要治疗的哺乳动物(如人)，其中施用时剂量为药学上认为的有效给药剂量，对于60kg体重的人而言，日给药剂量通常为1～2000mg，优选10～500mg。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
[0171]
治疗方法
[0172]
本发明还提供了一种治疗肿瘤的方法，即，将安全有效量的本发明活性成分或药物组合物施用于所需对象，从而治疗肿瘤。
[0173]
本发明的主要优点
[0174]
(a)抗肿瘤作用强：本发明的fes及其效应蛋白sj-sp-489能抑制90％以上肺部和肝脏的转移瘤。
[0175]
(b)抗多种肿瘤作用：包括对肺癌细胞、黑色素瘤细胞、白血病和淋巴细胞瘤等多种肿瘤的显著抑制作用。
[0176]
(c)抗肿肿瘤免疫机制明确：是通过活化肺泡巨噬细胞及其分泌的il-1β等细胞因子发挥抗肿瘤作用的。
[0177]
(4)发现了介导抗肿瘤作用的虫源效应蛋白：发现了sj-sp-489和sj-sp-19虫卵分泌排泄蛋白具有与fes同等的抗肿瘤作用，从而拓展了本发明在预防和治疗肿瘤中实际应用及其前景。
[0178]
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(new york:cold spring harbor laboratory press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
[0179]
通用方法和材料
[0180]
1.建立日本血吸虫自然感染的小鼠肿瘤模型(用于实施例1)
[0181]
第0天时将c57bl/6小鼠经腹部感染16条日本血吸虫尾蚴，第40天时通过尾静脉注射1
×
106个b16/f10或llc肿瘤细胞，在第55天和第65天左右分别处死b16/f10和llc模型小鼠，收集样本。
[0182]
2.虫卵的分离和死虫卵的制备(用于实施例2)
[0183]
2.1新鲜活虫卵的分离：(1)将km小鼠经腹部感染40条尾蚴；(2)在第42-49天时处死小鼠，分离出肝脏，用pbs洗涤数次。(3)将肝脏用研磨仪研磨，将匀浆液依次通过80目、150目滤网，收集滤液。(4)经4℃、3000rpm、2min离心，弃上清，用1.2％nacl重悬沉淀，重复离心3次。(5)用pbs重悬沉淀，加入胰酶、三抗和dna酶i，震荡混匀，置于37℃摇床、200转摇3小时。(6)经4℃、50g、10min离心，弃上清。(7)用2ml pbs重悬沉淀，缓慢加入到含50％percoll分离液的上层，4℃、800g、5min离心。(8)弃上清，用pbs重悬沉淀，自然沉降10min，弃上清。(9)用2ml pbs重悬沉淀，镜下观察并计数。可见大量新鲜活虫卵，背景干净无杂质，
仅有少量卵壳(图2d)。
[0184]
2.2死虫卵制备：将活虫卵放入沸水中煮1小时，后经4℃、300g、5min离心，弃上清，用pbs重悬沉淀，自然沉降10min，重复三次。
[0185]
2.3动物模型：第0天时通过尾静脉向c57bl/6或nod-scid小鼠注射5000个活虫卵，对照组注射5000个死虫卵或200μl pbs。第7天时注射第二次。第13天时注射1
×
106个b16/f10或llc细胞。第14天时注射第三次。在第33天和第43天左右分别处死b16/f10和llc模型小鼠，收集样本，观察小鼠肺部和肝脏肿瘤数目，或观察小鼠生存时间。
[0186]
3.验证抗肿瘤作用是否依赖于t、b细胞的实验方法(用于实施例3)
[0187]
虫卵制备同上。b16/f10和llc细胞分别用含10％fbs和双抗的rpmi 1640培养基或高糖型dmem培养基，培养于37℃、含5％co2细胞培养箱中。按上述2.3方法和时间点给饲养在spf级动物房的6周龄nod-scid雄性小鼠注入虫卵和b16/f10和llc细胞，观察小鼠肺部和肝脏肿瘤数目，或观察小鼠生存时间。
[0188]
4.fes(或des)的制备(用于实施例5)
[0189]
(1)用于fes制备的虫卵来自于感染日本血吸虫的新西兰兔。将新西兰兔四肢固定于支架上，去掉腹部毛发并用水浸湿皮肤。将800-1000条尾蚴置于盖玻片上，经腹部皮肤感染兔子，待尾蚴钻入兔子皮肤，大约需要10min，去掉盖玻片。在尾蚴感染后42天时处死兔子，按上述2.1方法分离日本血吸虫虫卵。
[0190]
(2)将活虫卵(或死虫卵)按照20万/孔密度铺于12孔板中，每孔加入3ml含抗生素的1640培养基。(2)每24小时收集2ml上清，并加入2ml新鲜培养基。(3)将收集的上清于4℃、高速离心10min，重复2次，收集上清。(4)用0.22μm滤器过滤上清，并用3kd超滤管将上清浓缩至原体积1/10，于-80℃冰箱保存。
[0191]
5.肺组织单细胞悬液的制备(用于实施例6)
[0192]
(1)用异氟烷麻醉小鼠并通过眼球放血处死。(2)分离出肺脏，用pbs洗涤数次后放入解离管中，加入美天旎肺组织解离试剂盒提供的解离酶。(3)将肺脏用研磨仪研磨。将研磨液放于37℃恒温摇床中，200转消化30分钟。(4)用40μm细胞筛过滤组织消化液，收集滤液。(5)将滤液经4℃、300g、10min离心，弃上清，用pbs重悬沉淀，重复离心2次。用pbs重悬沉淀后得到肺组织单细胞悬液。
[0193]
6.小鼠原代ams的分离和培养(用于实施例6)
[0194]
(1)将支气管肺泡灌洗液加热至37℃，保持该温度。(2)用异氟烷麻醉小鼠并通过眼球放血处死。(3)暴露出小鼠肺脏和气管，用剪刀在气管上方剪开一“v”形朝上切口。(4)将1ml注射器插入气管内，用线固定。(5)吸取700μl支气管肺泡灌洗液注入到肺脏，缓慢回抽，每次可收集约500-600μl肺泡灌洗液。(6)重复灌洗15-20次，每只小鼠可收集到10ml肺泡灌洗液。(7)将灌洗液通过70μm细胞筛过滤，转移至新15ml离心管。(8)经4℃、300g、7min离心，去掉上清。(9)用红细胞裂解液裂解残留的红细胞。再次离心，去掉上清。(10)用1640完全培养基重悬沉淀。通过胎盼蓝染色，观察细胞死活情况并计数，将细胞铺至培养板内进行培养。(11)原代ams的培养：将原代ams铺于24孔板中，用rmpi1640完全培养基培养。4h后去掉培养基，用pbs清洗掉悬浮细胞，加入新鲜培养基。
[0195]
7.单细胞测序样本的制备(用于实施例7)
[0196]
(1)第0天时将活虫卵、死虫卵或pbs注射到c57bl/6小鼠体内，第7天时重复注射一
次，每组5只小鼠。(2)第12天时处死小鼠，分离出肺脏，借助美天旎组织解离试剂盒制成单细胞悬液。(3)用fitc-cd11c、pe-f4/80和apc-siglecf流式抗体标记ams。(4)流式分选出高纯度的ams，每只小鼠分选10万细胞，将同组小鼠分选出的ams合为一管。(5)细胞经过dpbs洗涤2次后，交由生物公司进行单细胞测序建库。
[0197]
8.单细胞测序数据的分析(用于实施例7)
[0198]
(1)借助r语言中seurat包读取cellranger分析后的表达矩阵，并进行数据质控、去除批次效应、标准化、降维和聚类分析，借助singler包鉴定细胞类型。(2)基因平均表达量的计算：使用colmeans函数计算出每个细胞中相应基因集的平均表达量，并绘制箱型图。(3)基因集富集分析：使用seurat包自带addmodulescore函数对基因集进行评分，评分结果通过经验累积分布函数(ecdf)和小提琴图可视化。
[0199]
9.小鼠血清中il-1β的检测(用于实施例7)
[0200]
(1)通过眼球取血法收集小鼠血液，经5000rpm、15min离心，收集上清，重复离心一次，将收集后的血清置于-80℃冰箱备用。(2)使用thermo公司提供的小鼠il-1βelisa检测试剂盒检测小鼠血清中il-1β表达水平。
[0201]
10.il-1β体内中和实验(用于实施例7)
[0202]
在第0、3、6、9天注射fes，在第7天时注射b16-f10细胞，第25天时处理小鼠。为抑制il-1β，通过腹腔将抗il-1β抗体(b122)注射到小鼠体内，每次0.625mg/kg，3天/次。对照注射等量igg抗体。
[0203]
11.fes内活性物质的灭活处理(用于实施例8)
[0204]
(1)蛋白的消化：向fes中加入蛋白酶k至终浓度为100μg/ml,在56℃水浴锅中孵育1h，然后置于沸水中10min以灭活蛋白酶k。(2)dna和rna的消化：向fes中加入dna酶或rna酶，至终浓度为50mg/ml或25mg/ml,置于室温下消化2h。
[0205]
12.制备含不同分子量蛋白的fes(用于实施例8)
[0206]
(1)将过滤后的培养上清置于截留分子量50kda的超滤离心管中，，收集滤液(即为蛋白分子量《50kda的fes)。(2)将滤液置于截留分子量30kda的超滤离心管中，收集浓缩液(即为蛋白分子量《50kda和》30kda的fes,即f4)；以此类推，制备其他不同分子量范围的fes组分(f1，f2，f3和f5)，即f1＜3kda；3＜f2＜10kda；10＜f3＜30kda；30＜f4＜50kda和f5＞50kda，。
[0207]
13.his标签蛋白的表达、纯化和鉴定(用于实施例8)
[0208]
(1)根据质谱分析得到的f4组分的蛋白名称信息，从ncbi网站获得基因序列信息。(2)通过公司合成dna片段，并将其连接到pet28a载体上。(3)将重组载体转化到bl21(de3)中，用iptg诱导蛋白表达。(4)裂解大肠杆菌，收集上清液和沉淀(含有包涵体)。(5)将细菌裂解物的沉淀用含尿素的包涵体溶解液溶解，并借助纯化树脂进行纯化。(6)将收集的蛋白洗脱液装入复性袋中，用复性液复性。(7)将复性后的蛋白转入超滤管中进行浓缩，利用bca法测定蛋白浓度。(8)用sds-page电泳法鉴定蛋白表达情况。
[0209]
14.his标签蛋白的筛选(用于实施例8)
[0210]
(1)将对数生长期mh-s细胞铺于96孔细胞培养板中。(2)每孔加入终浓度为10mg/μl的纯化蛋白，并置于恒温培养箱内培养24h。(3)收集培养上清液，并用elisa法检测il-1β蛋白浓度。(4)收集培养细胞，检测细胞il1b等基因表达水平。
[0211]
实施例1日本血吸虫感染抑制肺部转移瘤的形成
[0212]
通过人工感染日本血吸虫的中间宿主
‑‑
钉螺，制备日本血吸虫尾蚴，并感染自然宿主，自然终宿主包括人体和适宜动物宿主，如小鼠、家兔和水牛等。尾蚴能通过皮肤进行感染，进入体内后通过体内移行途径到达肠系膜静脉，并在那里发育为成虫和产虫卵；产出的虫卵随肠系膜静脉和门脉回流系统分布，并沉积在肝脏和肠壁组织。
[0213]
在肺腺癌llc细胞肺部转移瘤模型中，感染组小鼠在肺部形成了平均0.2
±
0.4个肿瘤灶，显著少于未感染(pbs)对照组的8.7
±
2.6个肿瘤灶；在b16肿瘤模型中，感染组小鼠在肺脏中形成了0.8
±
1.0个肿瘤灶，显著少于未感染对照组的37.0
±
9.4个肿瘤灶(图1)，这样，与未感染小鼠相比，血吸虫感染可以使两种肿瘤细胞模型的肺脏转移瘤数目分别减少98.1％和97.7％(p《0.001)。
[0214]
实施例2日本血吸虫虫卵抑制小鼠肺部转移瘤形成
[0215]
将活虫卵(f-egg)、煮沸灭活死虫卵(d-egg)和pbs通过尾静脉分别注入c57bl/6小鼠，由此注入的虫卵沉积在肺脏，引起肺部虫卵肉芽肿。随后注入llc肿瘤细胞以形成肺脏转移瘤。
[0216]
结果显示，在f-egg组的6只小鼠中，4只无肿瘤形成，另外2只各有1个肿瘤灶，而d-egg对照组小鼠肿瘤数目为9.7
±
5.6个，pbs组为24.3
±
6.6个。这样，f-egg组肿瘤数目比d-egg组和pbs组分别减少了96.6％和98.6％(图2a,b，p《0.001)。
[0217]
另外，f-egg显著延长了小鼠的生存时间。80％的f-egg组小鼠(8只)在实验观察期结束(60天)时仍存活，而d-egg组和pbs组全部小鼠的死亡时间分别在37天和31天内(图2c)。
[0218]
实施例3活虫卵介导的抗肿瘤作用不依赖于t、b细胞
[0219]
为了解上述抗肿瘤活性是否依赖t和b细胞，本发明人采用缺乏成熟t和b细胞的nod-scid小鼠进行类似实验。
[0220]
结果显示，在此免疫缺陷小鼠模型中，f-egg组肿瘤数目(1
±
0.6)比d-egg组(28.5
±
10.7)和pbs组(38.2
±
5.1)分别减少96.5％和97.4％(p《0.001)(图3a)。此外，本发明人采用更具侵袭性的b16黑色素瘤细胞系进行类似实验。结果显示，在nod-scid小鼠模型中，f-egg可以显著抑制肺部转移瘤，其肿瘤数目比d-egg组和pbs组分别减少64.1％和65.1％(图3b)。该实验结果表明，f-egg介导的抗肿瘤作用并不依赖于t、b细胞。
[0221]
实施例4日本血吸虫虫卵对远处器官肿瘤的抑制作用
[0222]
在b16细胞转移瘤模型中，除了肺部形成转移瘤外，还能在肝脏形成肉眼可见的黑色素瘤转移瘤。实验步骤同前，通过尾静脉注射的虫卵沉积在肺部，而沉积在肺部的f-egg能够显著抑制肝脏黑色素细胞转移瘤。在nod-scid小鼠模型中，f-egg组肝脏肿瘤数目(2
±
1.4)比pbs(51.5
±
23.8)和死虫卵对照组(40.5
±
25.6)分别减少96.1％和95.1％(p《0.01)(图4)。此外，如图1所示，在日本血吸虫自然感染小鼠模型中，雌虫产出大量的虫卵，主要沉积在肝脏和肠壁组织。而沉积在肝脏和肠壁组织的虫卵且能对肺部转移瘤产生强大的抑制作用。这些结果表明日本血吸虫虫卵可对体内远处器官的肿瘤发挥强大的抑制作用。
[0223]
实施例5虫卵分泌排泄物介导的抗肿瘤作用
[0224]
如上所述，沉积在肺部或者肝脏中的虫卵能对远处器官转移瘤发挥抑制作用，该结果提示本发明人，虫卵的抗肿瘤作用可能是由其分泌排泄物介导的。因此，本发明人制备
了浓缩的无血清活虫卵培养上清(fes)和死虫卵培养上清(des)，通过尾静脉在第0，3，6，9天注入小鼠体内，在第7天注入b16肿瘤细胞，在第27天时收集样本。
[0225]
结果显示，fes组小鼠肺脏形成1.4
±
0.5个肿瘤灶，显著少于des组的32.6
±
9.9个和培养基对照组的32.8
±
5.5个(p《0.001)(图5)。在肝脏，fes组平均0.2
±
0.4个转移灶，而des组为18.6
±
6.4个肝脏转移灶，虫卵培养基对照组为16.8
±
7.9个肝脏转移灶，即两个对照组的肝脏转移灶显著多于活虫卵上清组(p《0.001)(图5)。以上结果表明，虫卵分泌排泄物具有与活虫卵同等效力的抗肿瘤作用，并提示虫卵介导的抗肿瘤作用是通过其分泌排泄物介导并发挥作用的。
[0226]
实施例6活虫卵介导抗肿瘤作用的细胞机制是激活肺泡巨噬细胞
[0227]
为阐明肺部活虫卵介导的抗肿瘤效应的细胞机制，本发明人分析了肺部及肺泡灌洗液中的免疫细胞组成。
[0228]
结果显示，注入5000个活虫卵和死虫卵的小鼠，其肺部和肺泡灌洗液中的cd4
+
t细胞、cd8
+
t细胞、nk细胞和b细胞相比于pbs组都有显著改变,但这些细胞在f-egg组和d-egg组间没有显著差异(图6a)，而f-egg组肺泡巨噬细胞(ams,f4/80
+
、cd11c
+
、siglec-f
+
)的数量比d-egg组明显增加(图6b)。通过免疫组化分析，肺泡巨噬细胞能浸润在肿瘤结节内(图6c)。此外，在自然感染小鼠模型中肺部的肺泡巨噬细胞也同样升高(图6d)。这些结果提示肺泡巨噬细胞可能与f-egg介导的抗肿瘤作用相关。
[0229]
随后，本发明人对f-egg诱导的肺泡巨噬细胞进行功能研究，通过气管滴注氯膦酸二钠脂质体以清除小鼠肺泡巨噬细胞同时不影响其它类型的巨噬细胞。
[0230]
结果显示，在使用清除剂以后，肺泡灌洗液中的肺泡巨噬细胞减少了90％(图7a)。然而，清除了肺泡巨噬细胞的小鼠失去了f-egg介导的抗肿瘤活性：在b16和llc肿瘤细胞模型中，f-egg+ams清除组肺转移瘤数目分别为43.5
±
12.3和27.3
±
10.0个，与pbs对照组的肿瘤数目无显著差异(p》0.05)(图7b)。本发明人在自然感染模型中也得到了相似的结果，即清除肺泡巨噬细胞后的感染小鼠对肺部转移瘤的抑制作用几乎完全消失(图7c,d)。这些结果提示，虫卵介导的抗肿瘤作用依赖肺泡巨噬细胞。
[0231]
为了验证活虫卵(f-egg)诱导肺泡巨噬细胞(ams)的抗肿瘤效应，本发明人从虫卵处理组小鼠体内分离肺泡巨噬细胞，将它们与肿瘤细胞共培养。
[0232]
结果显示活虫卵组的肿瘤细胞死亡比例明显多于对照组，并且与共培养的巨噬细胞浓度呈依赖关系(图8a)；此外，检测了fes激活的ams在吞噬肿瘤细胞方面的活性,本发明人构建了b16-gfp/luc稳转细胞，将fes活化的ams细胞系(mh-s细胞)与b16-gfp/luc细胞共培养，并通过流式细胞术检测gfp
+
f4/80
+
双阳性细胞占总f4/80
+
细胞的百分比。结果显示，对照组和三个实验组巨噬细胞吞噬b16-gfp/luc肿瘤细胞的比例分别为1.9
±
0.3％、3.7
±
0.5％、4.9+0.4％和7.2
±
0.5％，表明该活化的巨噬细胞显著增强对b16-gfp/luc肿瘤细胞的吞噬能力(图8b)。同时，采用小鼠体内fes激活的ams进行类似实验，结果显示，对照组和fes组原代ams对肿瘤细胞的吞噬比例分别为4.9
±
0.8％、9.7
±
1.5％(p《0.01)(图8c)。以上结果说明，fes活化的ams增强了对肿瘤细胞的吞噬作用。
[0233]
此外，本发明人应用细胞回输的方法，来验证虫卵诱导的肺泡巨噬胞体内抗肿瘤效应。首先，本发明人在第0天时通过尾静脉注射肿瘤细胞，在第7、10、13天时，通过气管回输5
×
105个从小鼠血吸虫虫卵肺模型中分离出来的肺泡巨噬胞，然后观察小鼠，适时收集
样本。
[0234]
结果显示，在llc模型中，回输活虫卵组肺泡巨噬胞的小鼠肺脏肿瘤数比pbs组和死虫卵组的分别少了52.2％和50.7％(图8d)，在b16模型中，活虫卵组的肿瘤数比pbs组和死虫卵组分别少了40.1％和40.3％(图8d)。这个结果说明活虫卵诱导的肺泡巨噬细胞回输给荷瘤小鼠具有抗肿瘤的作用。
[0235]
实施例7fes活化ams表型和抗肿瘤效应分子的鉴定
[0236]
为了从单细胞水平阐述虫卵或其fes活化ams的表型及其抗肿瘤的效应分子，本发明人对活化的ams进行单细胞转录普测序分析。首先，本发明人通过尾静脉分别将f-egg、d-egg和pbs分两次注射到小鼠体内，借助流式细胞分选技术，将肺组织中的ams(f4/80
+
、cd11c
+
、siglecf
+
)分选出来(图9a)，进行10
×
genomics单细胞转录普测序。本发明人得到了29052个细胞的数据，包括12605个pbs组细胞、6475个d-egg组细胞和9972个f-egg组细胞，平均每个细胞测到了8306个umi和2531个基因。
[0237]
经过对数据重新进行整合、降维和tsne聚类，细胞被分成了7个亚群(图9b,c)，各亚群细胞样本构成明显不同。亚群1的细胞主要由pbs组细胞构成，占97.7％；亚群2的主要由d-egg组细胞构成，占76.2％；亚群3的细胞主要由f-egg组细胞构成，占95.5％；亚群5的细胞由d-egg和f-egg组来源地细胞构成，分别占31.0％和68.8％；其他三个亚群由三个样本组的细胞共同构成(图9d)。如前所述，f-egg活化的ams具有抗肿瘤效应，因此，具有抗肿瘤效应的f-egg组细胞主要分布在亚群3和亚群5两个亚群。
[0238]
(1)ams极化表型的分析
[0239]
m1型巨噬细胞高表达tnf-α、il-1β、il-12、il-6和cox-2等细胞因子，起到抗肿瘤作用；m2型巨噬细胞高表达il-10和il-13、tgf-β等细胞因子，促进血管生成、肿瘤侵袭和转移。鉴于m1型巨噬细胞在抗肿瘤中的重要作用，本发明人对各样本ams极化表型进行了鉴定和分析。本发明人首先选择了一些m1型巨噬细胞的标志基因，然后计算整个基因集在不同样本和不同亚群间的平均表达情况，并通过箱型图进行展示。结果显示，f-egg组ams高表达m1型标志基因，如il1a、nfkbiz(图10a,b)。
[0240]
(2)ams抗肿瘤免疫相关功能的富集分析
[0241]
巨噬细胞抗肿瘤的涉及多种机制，包括吞噬作用、ros、炎症小体等。越来越多研究认为ros和炎症小体具有抗肿瘤的作用。因此，本发明人对吞噬作用、氧应激和炎症小体相关基因集进行了功能富集，并通过ecdf和点状图展示基因集富集情况和基因表达情况。结果发现，氧应激特征基因集在f-egg组ams显著被富集，包括编码氧应激通路核心酶的gpx1、dusp1和编码抗氧化酶的sod1、sod2(图10c)。另外，f-egg组来源的ams高表达与炎症小体相关的基因集，如接头分子nlrp3、aim2，以及下游分子casp4(图10d)。吞噬功能是巨噬细胞发挥抗肿瘤效应的重要方式之一，f-egg组ams表达的基因显著富集吞噬功能，这些基因包括编码吞噬受体的fcgr4、编码蛋白激酶c的prkcd等(图10e)。
[0242]
(3)f-egg介导的抗肿瘤效应分子的鉴定
[0243]
为了鉴定ams发挥抗肿瘤作用的效应分子，本发明人利用单细胞测序数据，根据go数据集对正向调控细胞杀伤能力的基因集型评分。评分结果显示，f-egg组细胞基因集评分显著高于d-egg组(图11a)，表明f-egg活化的ams具有更高的杀伤能力。根据已有文献报道，本发明人寻找到一些具有抗肿瘤作用的细胞因子，如tnf、il1b、ccl2、cxcl16、il12b、ifng
等，通过热图和点状图分析，本发明人发现f-egg组细胞显著高表达tnf、il1a、il1b等基因(图11b,c)。tsne图显示f-egg组细胞占主要的亚群3和亚群5细胞高表达tnf、il1a、il1b(图11d)。
[0244]
il-1β在f-egg活化的ams中的表达显著提高，为研究il-1β在虫卵活化ams抗肿瘤的作用，本发明人分离出虫卵活化的原代ams，通过qpcr方法检测显示，f-egg组ams中il1b升高了5.93
±
2.78倍(图12a)。然后，本发明人通过elisa方法检测了各组小鼠血清中il-1β的表达水平，pbs组、d-egg和f-egg组小鼠血清il-1β水平分别为27.51
±
9.72pg/ml、32.67
±
11.76pg/ml和57.54
±
18.97pg/ml，f-egg可以显著升高小鼠血清中il-1β水平(图12b)。另外，本发明人检测了小鼠注射fes后血清中il-1β水平，结果显示，fes可以升高小鼠血清中il-1β水平(图12c)。以上研究结果表明，活虫卵及fes上调ams表达il-1β。
[0245]
接下来，本发明人研究il-1β在虫卵活化ams抗肿瘤效应中的作用。本发明人采用了抑制il-1β功能的方法，包括采用il-1β中和抗体(b122)以及il-1β敲除小鼠，检测抑制或敲除小鼠il-1β后fes活化ams的抗肿瘤效应是否发生改变。首先，本发明人给予小鼠腹腔注射il-1β抗体(b122)抑制小鼠体内的il-1β，同时注射fes和b16肿瘤细胞，结果显示，pbs组、fes+igg组和fes+b122抗体组肺转移瘤数目分别为78.0
±
12.38、29.0
±
6.2和70.7
±
26.8(图12d)。该结果表明抑制il-1β(fes+b122组)后，fes活化ams的抗肿瘤作用基本消失，其肺部肿瘤数目与pbs对照组相似。此外，本发明人采用了il-1β敲除小鼠开展进一步实验，结果显示，pbs+wt组、fes+wt组和fes+il-1β-/-组小鼠肺转移瘤数目分别为21.8
±
6.6、4.7
±
1.5和13.3
±
4.2(图12e)。综上所述，本发明人通过抑制或敲除小鼠体内il-1β的相关实验，进一步表明了il-1β在fes介导抗肿瘤效应中发挥了重要作用。
[0246]
实施例8介导活化肺泡巨噬细胞和抗肿瘤的虫源分子鉴定
[0247]
上述研究发现了日本血吸虫活虫卵介导的抗肿瘤作用，而这种抗肿瘤作用是通过活化ams为m1型并高表达il-1β等效应分子。进一步研究表明，活化ams继而产生抗肿瘤作用是由虫卵分泌排泄物(即虫卵培养上清，fes)介导的,那么在fes中的主要发挥活化ams和抗肿瘤作用的虫源分子是什么，仍不清楚，对此，本发明人开展以下研究：
[0248]
(1)fes中激活巨噬细胞的有效物质是蛋白质
[0249]
fes成分复杂，能发挥活性作用可能的物质包括dna、rna及蛋白质等。对此，本发明人分别用dnase i、rnase a和蛋白酶k酶解fes中的dna、rna和蛋白质，观察消化后的fes对肺泡巨噬细胞系(mh-s)的活化作用。结果显示，fes能活化mh-s并显著上调il1b mrna及另外2个m1标志物(即marco和nos2)的表达，而dnase i和rnase a处理不影响其活化mh-s的作用，但蛋白酶处理后的fes失去了活化mh-s高表达il1b、marco和nos2 mrna的能力(图13)。此结果表明fes活化mh-s的有效活性成分为蛋白质。
[0250]
(2)fes中活化mh-s的蛋白质分子量在30-50kda之间
[0251]
本发明人采用millipore超滤离心管制备虫卵培养上清不同分子量的组分(f1 to f5)，即f1＜3kda；3＜f2＜10kda；10＜f3＜30kda；30＜f4＜50kda和f5＞50kda，并在体外检测各组分激活巨噬细胞的作用。结果显示，只有f4(30-50kda)组分对mh-s具有明显的激活作用，其激活mh-s表达il1b mrna水平与fes相当(图14a)，而其他组分无明显活化mh-s的作用。体内实验显示，注入f4组分的小鼠能显著抑制肺和肝脏转移瘤，其抑制率分别为80.8％和94.3％(图14b,c,d)。
[0252]
(3)激活mh-s虫源效应蛋白的筛选和鉴定
[0253]
①
基于上述f4组分的筛选
[0254]
上述结果显示f4(30-50kda)组分是活化mh-s的有效组分。这样，本发明人对f4组分进行质谱分析，通过对2个样本分析，按照匹配得分和分子量大小等标准，选取其中29个日本血吸虫分泌排泄蛋白(sjsp蛋白)，构建带his标签的重组表达质粒，并在大肠杆菌进行表达，其中21个sjsp重组蛋白成功表达(图15a)，并用镍柱进行纯化(图15b)。将各重组蛋白与mh-s进行培养，检测mh-s表达il-1β水平。初筛结果显示，其中4个sjsp蛋白具有刺激上调il-1β表达的作用(图15c)。进一步筛选鉴定包括采用蛋白酶消化处理等，发现其中2个蛋白(sjhissp-5和sjhissp-19)刺激mh-s表达il-1β是对蛋白酶消化敏感(图15d)。这样，筛选出sjhissp-5和sjhissp-19蛋白用于后续动物实验。
[0255]
②
基于实验室前期已构建的sjsp蛋白库的筛选
[0256]
实验室前期已经构建了由205个日本血吸虫分泌排泄蛋白组成的筛选文库，根据近年来文献报道，本发明人又增加了27个虫卵分泌排泄蛋白或日本血吸虫循环抗原，以上232个分泌排泄蛋白与gst(glutathione s-transferase)进行融合表达，并在大肠杆菌系统中成功表达(图16a)。将其中183个sjgst-sp与mh-s细胞进行共培养，用夹心elisa检测培养上清液中il-1β的水平。初筛结果显示，其中4个sjgst-sp能上调mh-s表达和分泌il-1β(r≥2.0)(图16b)。进一步重复筛选和验证，证明了其中的2个蛋白(sjgst-sp-489和sjgst-sp-57)具有活化mh-s并上调其il-1β分泌的能力(图16c)。在此基础上，重新构建缺失gst的重组蛋白sjhis-sp-57和sjhis-sp-489(图16d)。体外激活mh-s实验结果显示，缺失gst的sjhis-sp-489仍具有活化mh-s的作用，且对蛋白酶消化敏感(图16d)，而sjhis-sp-57失去了上调il-1β表达和分泌的作用(图16e)。质谱分析纯化后sjsp-489重组蛋白的氨基酸序列，2个样本质谱分析结果涵盖94.67％的sjsp-489重组蛋白氨基酸序列(图16f)，进一步验证了sjsp-489重组蛋白序列。
[0257]
③
sjhis-sp-19和sjhis-sp-489抑制小鼠转移瘤
[0258]
上述体外筛选实验已鉴定出3个重组蛋白(sjhis-sp-5、sjhis-sp-19和sjhis-sp-489)。为进一步证实这些重组蛋白是否能在体内产生抗肿瘤的作用，本发明人采用上述肿瘤小鼠模型，开展对这3个蛋白体内免疫效应的实验观察。以fes为阳性对照，另外2个体外筛选为阴性的重组蛋白(sjhis-sp-12和sjhis-sp-24)为阴性对照，按照图17a的实验流程和时间点，给每只小鼠接种重组蛋白的剂量为30μg，分4次尾静脉注入各重组蛋白，16天后观察小鼠肺部和肝脏肿瘤数目。结果显示，pbs组肺部和肝脏的平均肿瘤数目分别为97.1
±
16.0和42.3
±
8.5；与pbs组比较，fes阳性对照能显著抑制肺部和肝脏的肿瘤生长，其平均肿瘤数目分别为28.9
±
15.1和12.1
±
5.9，肿瘤数目分别减少70.3％和71.4％(p《0.01)(图17b，c)；在3个体外筛选阳性的蛋白中，sjhis-sp-19和sjhis-sp-489蛋白能显著抑制小鼠肿瘤生长，其肺部平均肿瘤数目分别为50.2
±
18.8和42.7
±
11.2(p《0.01)，肿瘤分别减少48.2％和51.0％(p《0.01)，肝部平均肿瘤数目分别为18.9
±
7.9和19.7
±
7.4，肿瘤分别减少55.4％和54.9％(p《0.01)，与对照组相比，能显著抑制肺部和肝脏的肿瘤生长(p《0.01)(图17b，c)；但sjsp-5蛋白对小鼠肝、肺部肿瘤无明显抑制作用。阴性对照sjhis-sp-12和sjhis-sp-24也无抑制作用(图17b，c)。
[0259]
接下来本发明人对sjhis-sp-19和sjhis-sp-489蛋白进行联合免疫，两个蛋白联
合后的总剂量为每只小鼠60μg/次，并将sjhis-sp-19和sjhis-sp-489的单个蛋白组的剂量同样增加到60μg/次。结果显示，pbs组肺部和肝脏的平均肿瘤数目分别为36.2
±
6.0和81.2
±
10.1(图17d，e)；与pbs组比较，fes阳性对照能显著抑制肺部和肝脏的肿瘤生长，其平均肿瘤数目分别为4.2
±
2.7和0.6
±
1.0(p《0.01)，肿瘤分别减少88.3％和99.2％；60μg sjhis-sp-19和sjhis-sp-489蛋白能显著抑制小鼠肿瘤生长，其肺部平均肿瘤数目分别为9.0
±
3.0和4.1
±
6.2(p《0.01)，肿瘤分别减少75.2％和95.0％(图17d)，肝部平均肿瘤数目分别为4.1
±
6.2和2.4
±
2.0(p《0.01)(图17e)，肿瘤分别减少94.9％和97.0％，其抑制效力与fes阳性对照相当(图17d,e)。这些实验进一步验证了sjhis-sp-19号和sjhis-sp-489号蛋白在小鼠体内的抗肿瘤作用。联合使用30μg sjhis-sp-19和30μg sjhis-sp-489能产生强效抗肿瘤作用，阴性对照60μg sjhis-sp-12和sjhis-sp-24未见抑制肿瘤生长的效果(图17d，e)。
[0260]
④
重组效应蛋白体内外活化肺泡巨噬细胞的作用
[0261]
上述研究表明了sjhis-sp-19和sjhis-sp-489蛋白在体内能诱导与fes相似的抗肿瘤作用，但该作用是否通过激活小鼠肺泡巨噬细胞？对此，以fes为阳性对照，sjhis-sp-12号蛋白作为阴性对照，在小鼠肺泡巨噬细胞培养液内加入终浓度为20μg/ml的蛋白，培养24h后检测细胞il1b、il12b mrna表达情况。结果显示，与pbs组比较，fes组细胞il1b、il12b mrna表达显著提高；sjhis-sp-12阴性对照蛋白组细胞较pbs组il1b、il12b mrna无显著差异，而sjhis-sp-19和sjhis-sp-489蛋白组的il1b、il12b mrna表达都有显著提高(p《0.01，图18a,b)。
[0262]
为了进一步表明sjhis-sp-19和sjhis-sp-489蛋白在小鼠体内能激活肺泡巨噬细胞，本发明人通过尾静脉按照60μg/只小鼠的蛋白剂量注入小鼠体内，共注射4次(d0、d3、d6和d9)，然后观察小鼠体内肺泡巨噬细胞的功能改变。结果显示，fes能显著上调表达il-1β和il-12肺泡巨噬细胞的比例(图18c,d)，同时提高小鼠血清il-1β水平(图18e)，阴性蛋白对照组无此作用(图18c,d,e)。该结果表明sjhis-sp-19和sjhis-sp-489重组蛋白能在体内激活小鼠m1型肺泡巨噬细胞，提示这两个蛋白在体内是通过活化m1型肺泡巨噬细胞发挥抗肿瘤作用的。
[0263]
实施例9 sjhis-sp-19和sjhis-sp-489序列同源性分析
[0264]
sjsp-19(fn316857)编码glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase(gapdh)。本发明人比对了日本血吸虫gapdh和埃及血吸虫、曼氏血吸虫的同源性；在血吸虫中，该蛋白的氨基酸序列相似性为85.5％；与人和小鼠的gapdh相比，该蛋白的氨基酸序列相似性为70.1％(图19)。该蛋白的基因是持家基因，在生物进化中具有保守性。
[0265]
sjsp-489(ay814009)该基因在血吸虫中的功能未知，其中还有编码neuroendocrine protein的7b2结构域(domain)。
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在哺乳动物中neuroendocrine protein基因编码一种分泌型伴侣蛋白，可防止其他分泌型蛋白质的聚集，包括与神经退行性和代谢疾病相关的蛋白质。
[0267]
序列比对表明,sjsp-489(ay814009)基因在血吸虫中的序列相似性为76.7％(图20)。
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人和小鼠neuroendocrine protein 7b2(human：np_001138229.1；mouse：np_033188.3)的蛋白氨基酸序列与sjsp-489蛋白序列相似性较小。
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在本发明提及的所有文献都在本技术中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限定的范围。