加纳木霉GXM-18及其应用

加纳木霉gxm-18及其应用
【技术领域】
1.本发明涉及微生物技术领域，特别涉及加纳木霉gxm-18及其应用。


背景技术：

2.广西是我国主要的葡萄产区，由于广西地处亚热带季风气候，温暖、湿润，空气湿度大，很容易滋生霉菌等病原菌，易发白腐病、灰霉病、炭疽病、穗轴褐枯病等果穗疾病，对葡萄的产量会造成巨大影响，目前对于白腐病、灰霉病、炭疽病、穗轴褐枯病等疾病的防治最主要是依靠化学农药，使用化学药物会造成果园环境污染、对有益真菌形成无差别杀灭引发果园微生物生态失衡、引起病原菌耐药性、产生农产品农药残留风险等。
3.当然，现今也有一些可用于生物防治的菌剂，例如报道的哈茨木霉、绿色木霉、长枝木霉等；但是在实际的研究中发现，由于微生物资源过于丰富，虽然是同种属的微生物，但是其防效、功效差别很大，有些被现有技术报道的具有防效的微生物，但在实际验证中发现，不是同株微生物，仅同种还不能有效起到生物防治的作用，而且，有些生防菌具报道能抑制 a疾病，并不能抑制b疾病，对作物、疾病的使用非常有限；因此，为了有效提高生防菌的应用范围，需要不断充实生防菌的种质资源库，我们就需要不断的对自然界的微生物进行筛选、验证，以获得有确切功效的生防菌菌株。


技术实现要素：

4.鉴于上述内容，为解决现有商品木霉菌株存在的上述种种问题，本发明拟提供一株能防治葡萄白腐病、灰霉病、炭疽病、穗轴褐枯病的加纳木霉新菌株，其耐热性较好、菌丝生长迅速、对病原菌菌落浸染覆盖快、扩展攀爬能力极强等优点。
5.为达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：
6.一株加纳木霉(trichoderma ghanense)菌株gxm-18，其保藏编号为cctcc no：2022418，保藏于：中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏日期为2022年4月14 日。
7.本发明还包含所述的加纳木霉(trichoderma ghanense)菌株gxm-18的生物肥。
8.本发明还包含所述的加纳木霉(trichoderma ghanense)菌株gxm-18或所述的生物肥在防治葡萄白腐病、灰霉病、炭疽病和/或穗轴褐枯病上的应用。
9.本发明还包括所述的加纳木霉(trichoderma ghanense)菌株gxm-18在抑制葡萄白腐病、灰霉病、炭疽病和/或穗轴褐枯病病原菌生长上的应用。
10.进一步的，所述葡萄白腐病的病原菌为白腐盾壳霉(coniothyrium minitans)，所述葡萄灰霉病的病原菌为灰葡萄孢(botrytis cinerea)，所述葡萄炭疽病的病原菌为炭疽菌 (colletotrichum spp.)，所述葡萄穗轴褐枯病的病原菌为葡萄生链格孢(alternaria viticola)。
11.本发明还包括一种应用所述的加纳木霉(trichoderma ghanense)菌株gxm-18对葡萄进行生物防治的方法，所述方法为：将加纳木霉(trichoderma ghanense)菌株gxm-18
接种到葡萄废弃枝条中用薄膜覆盖、堆沤60-90d得到生物肥；然后将生物肥施加到葡萄根部和/或将加纳木霉(trichoderma ghanense)菌株gxm-18配制成活菌数含量为10
4-106cfu/ml的水溶液，对葡萄植株采用喷雾法进行喷施。
12.本发明具有如下有益效果：
13.本发明筛选的加纳木霉gxm-18具有生长较迅速、菌丝扩展攀爬性能较强、快速占据生长空间，能有效的抑制了葡萄白腐病、灰霉病、炭疽病、穗轴褐枯病病原菌的生长，应用菌株加纳木霉gxm-18制备生物肥料和菌剂，能在葡萄树体表面及果园土壤环境中形成生态位优势进而压制病原菌滋生，从而对葡萄白腐病、灰霉病、炭疽病和穗轴褐枯病都具有良好的抑制作用；由此说明，本技术的菌株加纳木霉gxm-18是一株对葡萄多种主要病害具有良好防治作用的生防
【附图说明】
14.图1为本技术实施例的gxm-18菌株在平皿上的形态图；
15.图2为本技术gxm-18菌株的系统发育树图；
16.图3为木霉菌和白腐病病原菌的平板对峙图；图中：
①
为对照组1，其中，a为商品菌哈茨木霉，b为病原菌白腐盾壳霉；
②
为空白组；
③
为对照组2，其中，a为商品菌绿色木霉， b为病原菌白腐盾壳霉；
④
为实验组，其中，a为加纳木霉菌株gxm-18，b为病原菌白腐盾壳霉；
17.图4为木霉菌和灰霉病病原菌的平板对峙图；
①
为实验组，其中，a为加纳木霉菌株 gxm-18，b为病原菌灰葡萄孢；
②
为对照组，其中，a为商品菌哈茨木霉，b为病原菌灰葡萄孢；
③
为空白组；
18.图5为木霉菌和炭疽病病原菌的平板对峙图；
①
为空白组；
②
为对照组，其中，a为商品菌哈茨木霉，b为病原菌炭疽菌；
③
为实验组，其中，a为加纳木霉菌株gxm-18，b为病原菌炭疽菌；
19.图6为木霉菌和葡萄穗轴褐枯病病原菌的平板对峙图；
①
为对照组，其中，a为商品菌哈茨木霉，b为病原菌葡萄生链格孢；
②
为空白组；
③
为实验组，其中，a为加纳木霉菌株 gxm-18，b为病原菌葡萄生链格孢。
20.【具体实施方式】
21.本说明书中公开的所有特征，或公开的所有方法或过程中的步骤，除了互相排斥的特征和/或步骤以外，均可以以任何方式组合。
22.本说明书(包括任何附加权利要求、摘要)中公开的任一特征，除非特别叙述，每个特征只是一系列等效或类似特征中的一个例子而已。
23.实施例1：
24.加纳木霉(trichoderma ghanense)菌株gxm-18的筛选和鉴定：
25.本实施例的加纳木霉菌株gxm-18由发明人于2013年10月从广西壮族自治区河池市野生毛葡萄根系周围土壤中分离而得，其保藏编号为cctcc no：2022418；保藏于：中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏日期为2022年4月14日。
26.对本实施例的微生物进行形态学分类和分子生物学鉴定具体如下：
27.1、菌株的形态学鉴定：
28.将菌株gxm-18接种在pda培养基上，在37℃培养2d左右，结果如图1所示，菌落直径
为50mm左右，呈圆形，呈白色，有白色短绒毛，有白色孢子束。
29.2、分子生物学鉴定
30.对上述菌株进行测序、验证：采用its通用引物its1/its4： 5'-tccgtaggtgaacctgcgg-3'/5'-tcctccgcttattgatatgc-3'对菌株的its基因序列进行扩增，，然后通过与genbank中的ezbiocloud数据库和blastn数据库进行比较，构建两菌株的系统发育树图：如图2所示，菌株gxm-18与加纳木霉(trichoderma ghanense)聚类到一支。因此，判定菌株gxm-18属于trichoderma ghanense种。
31.实施例2：
32.菌株对葡萄白腐病病菌的平板对峙实验：
33.葡萄白腐病是由白腐盾壳霉(coniothyrium diplodiella)引起的，为了研究菌株对葡萄白腐病的抑制作用，本实施例采用菌株gxm-18白腐盾壳霉(coniothyrium diplodiella)进行平板对峙实验，具体如下：
34.在pda平板培养基上，在培养基的下侧接种葡萄白腐病病原菌，同时，在培养基的上侧接种木霉菌株，在37℃条件下培养48h，观察平板培养基的拮抗情况；具体如图3所示：
35.图3中
①
为对照组1，其中，a为商品菌绿色木霉(购自沂源康源生物科技有限公司)， b为病原菌白腐盾壳霉；
②
为空白组；
③
为对照组2，其中，a为商品菌哈茨木霉(购自：美国拜沃公司)，b为病原菌白腐盾壳霉；
④
为实验组，其中，a为加纳木霉菌株gxm-18，b 为病原菌白腐盾壳霉；
36.从图3可见，实验组平板上快速布满了菌株gxm-18的菌丝，挤占葡萄白腐病病原菌的生长空间，白腐病病原菌的生长受到明显抑制(图3的
④
)，而接种了商品绿色木霉菌和接种了商品哈茨木霉的对照组1和对照组2的平板中，葡萄白腐病病原菌的生长基本不受影响 (图3的
①
和
③
)，而从仅接种了葡萄白腐病病原菌的空白组(图3的
②
)和图3的
①
、
③
对比可见，葡萄白腐病病原菌的菌落大小相差不大，进一步说明，商品绿色木霉菌和哈茨木霉对葡萄白腐病病原菌的生长没有抑制作用。
37.实施例3：
38.菌株对葡萄灰霉病病菌的平板对峙实验：
39.葡萄灰霉病是由灰葡萄孢(botrytis cinerea)引起的，为了研究菌株对葡萄灰霉病的抑制作用，本实施例采用菌株gxm-18对灰葡萄孢(botrytis cinerea)进行平板对峙实验，具体如下：
40.在糖蜜琼脂平板培养基上，在培养基的下侧接种葡萄灰霉病病原菌，24h后再在培养基的上侧接种木霉菌株，接种完成后，在30℃条件下培养48h，观察平板培养基的拮抗情况；具体如图4所示：
41.图4中；
①
为实验组，其中，a为加纳木霉菌株gxm-18，b为病原菌灰葡萄孢；
②
为对照组，其中，a为商品菌哈茨木霉，b为病原菌灰葡萄孢；
③
为空白组。
42.从图4可见，实验组平板上快速布满了菌株gxm-18的菌丝，挤占葡萄灰霉病病原菌的生长空间，灰霉病病原菌的生长受到明显抑制(图4的
①
)，而接种了商品哈茨木霉的对照组的平板中，葡萄灰霉病病原菌的生长基本不受影响(图4的
②
)，而从仅接种了葡萄灰霉病病原菌的空白组(图4的
③
)和图4的
①
对比可见，葡萄灰霉病病原菌的菌落大小相差不大，进一步说明，商品哈茨木霉对葡萄灰霉病病原菌的生长没有抑制作用。
43.实施例4：
44.菌株对葡萄炭疽病病菌的平板对峙实验：
45.葡萄炭疽病是由炭疽菌(colletotrichum spp.)引起的，为了研究菌株对葡萄炭疽病的抑制作用，本实施例采用菌株gxm-18对炭疽菌(colletotrichum spp.)进行平板对峙实验，具体如下：
46.在马铃薯葡萄糖平板培养基上，在培养基的下侧接种葡萄炭疽病病原菌，24h后再在培养基的上侧接种木霉菌株，接种完成后，在30℃条件下培养48h，观察平板培养基的拮抗情况；具体如图5所示：
47.图5中
①
为未接种木霉的空白组；
②
为接种了商品哈茨木霉菌株(美国拜沃公司生产) 的对照组；
③
为接种了加纳木霉菌株gxm-18的实验组。
48.从图5可见，实验组平板上快速布满了菌株gxm-18的菌丝，挤占葡萄炭疽病病原菌的生长空间，炭疽病病原菌的生长受到明显抑制(图5的
③
)，而接种了商品哈茨木霉的对照组的平板中，葡萄炭疽病病原菌的生长基本不受影响(图5的
②
)，而从仅接种了葡萄炭疽病病原菌的空白组(图5的
①
)和图5的
②
对比可见，葡萄炭疽病病原菌的菌落大小相差不大，进一步说明，商品哈茨木霉对葡萄炭疽病病原菌的生长没有抑制作用。
49.实施例5：
50.菌株对葡萄穗轴褐枯病病菌的平板对峙实验：
51.葡萄穗轴褐枯病是由葡萄生链格孢(alternaria viticola)引起的，为了研究菌株对葡萄穗轴褐枯病的抑制作用，本实施例采用菌株gxm-18对葡萄生链格孢(alternaria viticola)进行平板对峙实验，具体如下：
52.在糖蜜琼脂平板培养基上，在培养基的下侧接种葡萄穗轴褐枯病病原菌，24h后再在培养基的上侧接种木霉菌株，接种完成后，在30℃条件下培养48h，观察平板培养基的拮抗情况；具体如图6所示：
53.图6中
①
为接种了商品哈茨木霉菌株(美国拜沃公司)的对照组；
②
为未接种木霉的空白组；
③
为接种了加纳木霉菌株gxm-18的实验组。
54.从图6可见，实验组平板上快速布满了菌株gxm-18的菌丝，挤占葡萄穗轴褐枯病病原菌的生长空间，炭疽病病原菌的生长受到明显抑制(图6的
③
)，而接种了商品哈茨木霉的对照组的平板中，葡萄穗轴褐枯病病原菌的生长基本不受影响(图6的
①
)，而从仅接种了葡萄穗轴褐枯病病原菌的空白组(图6的
②
)和图6的
①
对比可见，葡萄穗轴褐枯病病原菌的菌落大小相差不大，进一步说明，商品哈茨木霉对葡萄穗轴褐枯病病原菌的生长没有抑制作用。
55.综合实施例2-实施例5可见，加纳木霉菌株gxm-18对于葡萄灰霉病、炭疽病、白腐病、穗轴褐枯病等葡萄果实重要病害的病原菌具有拮抗作用，表现为快速挤占生存空间、覆盖病原菌菌落等现象，可应用于葡萄的生防作用。与商品生防菌剂常涉及的哈茨木霉相比，加纳木霉gxm-18菌株在生长速度上具有绝对优势，这一优势有利于在应用中快速占领生态位，获得生长优势，进而更好的发挥防治效果。
56.实施例6：
57.加纳木霉菌株gxm-18对葡萄生长的影响：
58.实验组生物肥制备方法：
59.(1)种子斜面的制备：分离平板培养基和斜面培养基均为麸皮5g/l，琼脂15g/l；将保藏于－80℃条件下的甘油菌种通过平板划线或稀释涂布法接种至分离平板培养基上，37℃培养24h获得单菌落，挑取生长迅速、孢子丰富的单菌落接种于斜面培养基上，37℃培养72h 获得孢子丰富的斜面菌种。
60.(2)种子孢子悬浮液的制备：用9g/l的氯化钠溶液将斜面种子上的孢子洗下，移入盛有玻璃珠的三角瓶中室温振荡30-60min，制成均匀的孢子悬浮液。
61.(3)二级种子制备：可采用粉碎至0.5cm左右的葡萄皮渣、枯叶、枝条为种子培养基，调节含水量至质量比50％-60％(w/w)，经121℃湿热灭菌20min后冷至室温，按体积质量比1％(v/w)的量接种孢子悬浮液，37℃培养72h获得孢子丰富的二级种子。
62.(4)葡萄栽培废弃物处理：将修剪产生的废弃枝条等栽培废弃物收集码放建堆，通过喷洒5g/l的磷酸氢二钾溶液使其表面充分湿润；二级种子可用5倍体积的5g/l磷酸氢二钾溶液洗脱其孢子，所得孢子悬浮液通过喷洒或涂抹的方式接种于栽培废弃物堆上，也可用0.5 倍体积的5g/l磷酸氢二钾溶液与二级种子预混，再通过混施或洒施的方式接种于栽培废弃物堆上，覆盖薄膜保湿堆沤60-90天，既可有效杀灭废弃物中残留的病原菌，又能获得富含木霉菌剂的纤维素有机质堆肥。其中，底料与孢子悬浮液的固液比为100:5；孢子悬浮液中含孢子为10
4-106cfu/ml。。
63.本实验组采用的木霉为：加纳木霉菌株gxm-18。
64.对照组生物肥制备方法与实验组相同，不同的是，使用的木霉为市售的商品哈茨木霉。
65.空白组生物肥制备方法：
66.采用等量的清水替代孢子悬浮液，即：
67.将修剪产生的废弃枝条等栽培废弃物收集码放建堆，通过喷洒5g/l的磷酸氢二钾溶液使其表面充分湿润；然后按照固液比为100:5向废弃物表面喷洒清水，再通过混施或洒施的方式接种于栽培废弃物堆上，覆盖薄膜保湿堆沤60-90天即获得不含木霉菌剂的堆肥。
68.堆沤结束后，将上述生物肥料以300kg/亩的施加量施加在葡萄根部，每个栽培周期共施加1次；
69.同时，还将木霉菌配制成菌液(菌液中木霉菌的活菌数为10
4-106cfu/ml)采用喷雾法施药，一次喷药量为45l/亩，从葡萄的萌芽期开始喷药，以后每隔15d喷雾防治一次，遇开花期暂停，连续喷施4次。其中，实验组喷施的是加纳木霉菌株gxm-200的菌液、对照组喷施的是商品哈茨木霉、空白组喷施的是清水，其他管理方法不变。
70.分别在果实采收期调查葡萄果穗灰霉病的病情指数及计算相对防效。
71.其中，葡萄果穗白腐病、炭疽病、灰霉病和褐枯病的病情分级标准如下：
72.0级，果穗无病；
73.1级，果穗发病颗粒占果穗果粒总数的5％以下；
74.3级，果穗发病果粒果穗果粒总数的6％～10％；
75.5级，果穗发病果粒占果穗果粒总数的11％～25％；
76.7级，果穗发病果粒占果穗以上果粒总数的26％～50％；
77.9级，果穗发病果粒果穗果粒总数的50％。
78.病情指数＝∑(各级病果穗数
×
相对级数值)/(调查总果穗数
×
9)；
79.防治效果(％)＝[(空白组病情指数—处理组病情指数)/空白组病情指数]
×
100
[0080]
得到的结果如下：
[0081]
表1不同生物肥对葡萄病害的影响
[0082][0083]
上表可见，采用加纳木霉菌株gxm-18制备生物菌肥，并结合利用菌液进行喷施，能有效提高葡萄白腐病、灰霉病、炭疽病和褐枯病的防效，其中，对葡萄白腐病的防效达到71.43％；对葡萄灰霉病的防效达到86.85％；对葡萄炭疽病的防效达到89.29％；对葡萄穗轴褐枯病的防效达到64.71％远高于对照组(市售的商品哈茨木霉)；而对照组(市售的商品哈茨木霉) 基本上对葡萄的白腐病、炭疽病和穗轴褐枯病都没有防效。由此说明，并非同属的木霉对葡萄对白腐病、灰霉病、炭疽病和褐枯病都具有良好的防效，利用本技术的加纳木霉菌株 gxm-18制备菌肥能有效减少农药的使用量，是一种能有效应用于葡萄的生防微生物。
[0084]
综上，加纳木霉gxm-18对葡萄白腐病、灰霉病、炭疽病和穗轴褐枯病的病原菌都具有良好的抑制作用，使用菌株加纳木霉gxm-18制备得到的生物菌肥，对葡萄白腐病、灰霉病、炭疽病和穗轴褐枯病有良好的防治作用，该菌肥的应用，能有效降低化学农药的使用量。
[0085]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明的保护范围应以所附权利要求为准。