重组溶瘤病毒及其应用的制作方法

本技术涉及生物医药的，具体地说，涉及一种重组溶瘤病毒及其应用。

背景技术：

1、溶瘤病毒是一类具有复制能力的肿瘤杀伤性病毒，目前已被大众接受作为肿瘤免疫治疗的重要分支。溶瘤病毒能够特异性地靶向感染肿瘤细胞，例如利用肿瘤细胞中抑癌基因的失活或缺陷，从而选择性地感染肿瘤细胞；溶瘤病毒感染肿瘤细胞后，会在肿瘤细胞内大量复制并最终摧毁肿瘤细胞，从而杀死肿瘤细胞。同时，溶瘤病毒还可以提供提高宿主自身抗癌反应所必需的免疫刺激信号，从而吸引更多的免疫细胞来继续杀死残余的肿瘤细胞。

2、虽然溶瘤病毒在肿瘤免疫治疗方面具有较好的应用前景，但野生型溶瘤病毒往往会引起机体神经系统炎症等问题，在利用野生型病毒感染肿瘤细胞的过程中，还存在较大的致病风险。因此，为进一步推进溶瘤病毒的临床应用，需要对野生型溶瘤病毒进行改造，以获得减毒后的溶瘤病毒。将减毒后的溶瘤病毒用于临床应用，从而降低溶瘤病毒的致病风险，提高溶瘤病毒的安全性。

3、然而，在对溶瘤病毒改造的过程中，若仅是对野生型溶瘤病毒随机进行基因修饰，虽然能够降低其毒性，但改造后的溶瘤病毒可能治愈率效果不佳，甚至改造后的溶瘤病毒无法进行包装，不利于推进溶瘤病毒的临床应用。

技术实现思路

1、为了进一步提高溶瘤病毒对肿瘤细胞的体外和体内的侵染能力和杀伤能力，且降低溶瘤病毒对正常细胞的侵染能力，本技术提供一种重组溶瘤病毒及其应用。

2、本技术提供的一种重组溶瘤病毒采用如下的技术方案：

3、一种重组溶瘤病毒，所述重组溶瘤病毒包括m蛋白和外源基因编码的细胞因子；所述m蛋白与seq id no 1所示的氨基酸序列相比，包含以下位点突变：在第51位的甲硫氨酸突变为精氨酸(m51r)；在第221位缬氨酸突变为苯丙氨酸(v221f)；在第226位丝氨酸突变为精氨酸(s226r)。

4、进一步地，所述m蛋白还包含以下一个或多个位点突变：在第32位的天冬酰胺突变为丝氨酸(n32s)；和/或，在第49位的天冬酰胺突变为天冬氨酸(n49d)；和/或，在第54位的组氨酸突变为酪氨酸(h54y)；和/或，在第225位的缬氨酸突变为异亮氨酸(v225i)。

5、进一步地，所述m蛋白还包含以下一个或多个位点突变：敲除第111位亮氨酸编码碱基；或，在第111位亮氨酸突变为丙氨酸(l111a)。

6、进一步地，所述m蛋白还包含以下一个或多个位点突变：在第21位甘氨酸突变为丙氨酸(g21e)；和/或，在第33位甲硫氨酸突变为丙氨酸(m33a)；和/或，在第133位的丙氨酸突变为苏氨酸(a133t)。

7、在一个具体的实施方式中，所述m蛋白的位点突变包含在第51位的甲硫氨酸突变为精氨酸(m51r)。

8、在一个具体的实施方式中，所述m蛋白的位点突变包含在第221位缬氨酸突变为苯丙氨酸(v221f)。

9、在一个具体的实施方式中，所述m蛋白的位点突变包含在第226位丝氨酸突变为精氨酸(s226r)。

10、在一个具体的实施方式中，所述m蛋白的位点突变包含在第32位的天冬酰胺突变为丝氨酸(n32s)。

11、在一个具体的实施方式中，所述m蛋白的位点突变包含第49位的天冬酰胺突变为天冬氨酸(n49d)。

12、在一个具体的实施方式中，所述m蛋白的位点突变包含在第54位的组氨酸突变为酪氨酸(h54y)。

13、在一个具体的实施方式中，所述m蛋白的位点突变包含在第225位的缬氨酸突变为异亮氨酸(v225i)。

14、在一个具体的实施方式中，所述m蛋白的位点突变包含敲除第111位亮氨酸编码碱基。

15、在一个具体的实施方式中，所述m蛋白的位点突变包含在第111位亮氨酸突变为丙氨酸(l111a)。

16、在一个具体的实施方式中，所述m蛋白的位点突变包含在第21位甘氨酸突变为丙氨酸(g21e)。

17、在一个具体的实施方式中，所述m蛋白的位点突变包含在第33位甲硫氨酸突变为丙氨酸(m33a)。

18、在一个具体的实施方式中，所述m蛋白的位点突变包含在第133位的丙氨酸突变为苏氨酸(a133t)。

19、在一个具体的实施方案中，所述m蛋白具有m51r、v221f、s226r的氨基酸取代。

20、在一个具体的实施方案中，所述m蛋白具有n32s、n49d、m51r、h54y、v221f、v225i、s226r的氨基酸取代。

21、在一个具体的实施方案中，所述m蛋白具有n32s、n49d、m51r、h54y、敲除第111位亮氨酸编码碱基、v221f、v225i、s226r的氨基酸取代。

22、在一个具体的实施方案中，所述m蛋白具有n32s、n49d、m51r、h54y、l111a、v221f、v225i、s226r的氨基酸取代。

23、在一个具体的实施方案中，所述m蛋白具有g21e、n32s、n49d、m51r、h54y、v221f、v225i、s226r的氨基酸取代。

24、在一个具体的实施方案中，所述m蛋白具有g21e、n32s、m33a、n49d、m51r、h54y、v221f、v225i、s226r的氨基酸取代。

25、在一个具体的实施方案中，所述m蛋白具有g21e、n32s、m33a、n49d、m51r、h54y、a133t、v221f、v225i、s226r的氨基酸取代。

26、在一个具体的实施方案中，所述m蛋白具有n32s、m33a、n49d、m51r、h54y、v221f、v225i、s226r的氨基酸取代。

27、在一个具体的实施方案中，所述m蛋白具有n32s、m33a、n49d、m51r、h54y、a133t、v221f、v225i、s226r的氨基酸取代。

28、在一个具体的实施方案中，所述m蛋白具有n32s、n49d、m51r、h54y、a133t、v221f、v225i、s226r的氨基酸取代。

29、在本技术中，野生型vsv病毒indiana muddsummer亚型m蛋白包含如seq id no 1所示的氨基酸序列。

30、在一个具体的实施方案中，所述m蛋白包含如seq id no 2所示的氨基酸序列。

31、在一个具体的实施方案中，所述m蛋白包含如seq id no 3所示的氨基酸序列。

32、在一个具体的实施方案中，所述m蛋白包含如seq id no 4所示的氨基酸序列。

33、在一个具体的实施方案中，所述m蛋白包含如seq id no 5所示的氨基酸序列。

34、在一个具体的实施方案中，所述m蛋白包含如seq id no 6所示的氨基酸序列。

35、在一个具体的实施方案中，所述m蛋白包含如seq id no 7所示的氨基酸序列。

36、在一个具体的实施方案中，所述m蛋白包含如seq id no 8所示的氨基酸序列。

37、在一个具体的实施方案中，所述m蛋白包含如seq id no 9所示的氨基酸序列。

38、在一个具体的实施方案中，所述m蛋白包含如seq id no 10所示的氨基酸序列。

39、在一个具体的实施方案中，所述m蛋白包含如seq id no 11所示的氨基酸序列。

40、进一步地，所述细胞因子选自白细胞介素、干扰素、肿瘤坏死因子、集落刺激因子、转化生长因子β、趋化因子家族。

41、进一步地，所述细胞因子选自如下任意一种或多种：gm-csf、g-csf、m-csf、il-1、il-2、il-4、il-5、il-6、il-9、il-10、il-12、il-13、il-15、il-17、il-18、il-23、il-27、ifn-α、ifn-β、ifn-γ、ifn-β、tgf-β和tnf-α。

42、进一步地，所述细胞因子选自如下任意一种或多种：gm-csf、il-2、il-9、il-12、il-15、il-18、tnf-α、ifn-β。

43、在一个具体的实施方案中，所述细胞因子为gm-csf。

44、在一个具体的实施方案中，所述细胞因子为il-2。

45、在一个具体的实施方案中，所述细胞因子为il-12。

46、在一个具体的实施方案中，所述细胞因子为il-15。

47、在一个具体的实施方案中，所述细胞因子为il-18。

48、在一个具体的实施方案中，所述细胞因子为tnf-α。

49、在一个具体的实施方案中，所述细胞因子为ifn-β。

50、在一个具体的实施方案中，所述细胞因子gm-csf包含如seq id no 20所示的氨基酸序列。

51、在一个具体的实施方案中，所述细胞因子il-2包含如seq id no 21所示的氨基酸序列。

52、在一个具体的实施方案中，所述细胞因子il-12-a包含如seq id no 22所示的氨基酸序列。

53、在一个具体的实施方案中，所述细胞因子il-12-b包含如seq id no 23所示的氨基酸序列。

54、在一个具体的实施方案中，所述细胞因子il-15包含如seq id no 24所示的氨基酸序列。

55、在一个具体的实施方案中，所述细胞因子il-18包含如seq id no 25所示的氨基酸序列。

56、在一个具体的实施方案中，所述细胞因子tnf-α包含如seq id no 26所示的氨基酸序列。

57、在一个具体的实施方案中，所述细胞因子ifn-β包含如seq id no 27所示的氨基酸序列。

58、在一个具体的实施方案中，所述细胞因子il-12-a包含如seq id no 28所示的氨基酸序列。

59、在一个具体的实施方案中，所述细胞因子il-12-a包含如seq id no 29所示的氨基酸序列。

60、在一个具体的实施方案中，所述细胞因子il-12-a包含如seq id no 30所示的氨基酸序列。

61、在一个具体的实施方案中，所述细胞因子il-15包含如seq id no 31所示的氨基酸序列。

62、在一个具体的实施方案中，所述细胞因子il-18包含如seq id no 32所示的氨基酸序列。

63、一种重组溶瘤病毒，所述重组溶瘤病毒包含上述m蛋白；所述重组溶瘤病毒还包括g蛋白；所述g蛋白与seq id no 12所示的氨基酸序列相比，包含以下一个或多个位点突变：在第53位的缬氨酸突变为异亮氨酸(v53i)；和/或，在第141位的丙氨酸突变为缬氨酸(a141v)；和/或，在第172位的天冬氨酸突变为酪氨酸(d172y)；和/或，在第217位的赖氨酸突变为谷氨酸(k217e)；和/或，在第232位的天冬氨酸突变为甘氨酸(d232g)；和/或，在第331位的缬氨酸突变为丙氨酸(v331a)；和/或，在第371位的缬氨酸突变为谷氨酸(v371e)；和/或，在第436位的甘氨酸突变为天冬氨酸(g436d)；和/或，在第438位的苏氨酸突变为丝氨酸(t438s)；和/或，在第453位的苯丙氨酸突变为亮氨酸(f453l)；和/或，在第471位的苏氨酸突变为异亮氨酸(t471i)；和/或，在第487位的酪氨酸突变为组氨酸(y487h)。

64、在一个具体的实施方案中，所述g蛋白的位点突变包含在第53位的缬氨酸突变为异亮氨酸(v53i)。

65、在一个具体的实施方案中，所述g蛋白的位点突变包含在第141位的丙氨酸突变为缬氨酸(a141v)。

66、在一个具体的实施方案中，所述g蛋白的位点突变包含在第172位的天冬氨酸突变为酪氨酸(d172y)。

67、在一个具体的实施方案中，所述g蛋白的位点突变包含在第217位的赖氨酸突变为谷氨酸(k217e)。

68、在一个具体的实施方案中，所述g蛋白的位点突变包含在第232位的天冬氨酸突变为甘氨酸(d232g)。

69、在一个具体的实施方案中，所述g蛋白的位点突变包含在第331位的缬氨酸突变为丙氨酸(v331a)。

70、在一个具体的实施方案中，所述g蛋白的位点突变包含在第371位的缬氨酸突变为谷氨酸(v371e)。

71、在一个具体的实施方案中，所述g蛋白的位点突变包含在第436位的甘氨酸突变为天冬氨酸(g436d)。

72、在一个具体的实施方案中，所述g蛋白的位点突变包含在第438位的苏氨酸突变为丝氨酸(t438s)。

73、在一个具体的实施方案中，所述g蛋白的位点突变包含在第453位的苯丙氨酸突变为亮氨酸(f453l)。

74、在一个具体的实施方案中，所述g蛋白的位点突变包含在第471位的苏氨酸突变为异亮氨酸(t471i)。

75、在一个具体的实施方案中，所述g蛋白的位点突变包含在第487位的酪氨酸突变为组氨酸(y487h)。

76、在一个具体的实施方案中，所述g蛋白具有v53i的氨基酸取代。

77、在一个具体的实施方案中，所述g蛋白具有v53i、a141v的氨基酸取代。

78、在一个具体的实施方案中，所述g蛋白具有v53i、a141v、d172y的氨基酸取代。

79、在一个具体的实施方案中，所述g蛋白具有v53i、a141v、d172y、k217e的氨基酸取代。

80、在一个具体的实施方案中，所述g蛋白具有v53i、a141v、d172y、k217e、d232g的氨基酸取代。

81、在一个具体的实施方案中，所述g蛋白具有v53i、a141v、d172y、k217e、d232g、v331a、的氨基酸取代。

82、在一个具体的实施方案中，所述g蛋白具有v53i、a141v、d172y、k217e、d232g、v331a、v371e的氨基酸取代。

83、在一个具体的实施方案中，所述g蛋白具有v53i、a141v、d172y、k217e、d232g、v331a、v371e、g436d的氨基酸取代。

84、在一个具体的实施方案中，所述g蛋白具有v53i、a141v、d172y、k217e、d232g、v331a、v371e、g436d、t438s的氨基酸取代。

85、在一个具体的实施方案中，所述g蛋白具有v53i、a141v、d172y、k217e、d232g、v331a、v371e、g436d、t438s、f453l的氨基酸取代。

86、在一个具体的实施方案中，所述g蛋白具有v53i、a141v、d172y、k217e、d232g、v331a、v371e、g436d、t438s、f453l、t471i的氨基酸取代。

87、在一个具体的实施方案中，所述g蛋白具有v53i、a141v、d172y、k217e、d232g、v331a、v371e、g436d、t438s、f453l、t471i、y487h的氨基酸取代。

88、在一个具体的实施方案中，所述g蛋白具有a141v、d172y、k217e、d232g、v331a、v371e、g436d、t438s、f453l、t471i、y487h的氨基酸取代。

89、在一个具体的实施方案中，所述g蛋白具有d172y、k217e、d232g、v331a、v371e、g436d、t438s、f453l、t471i、y487h的氨基酸取代。

90、在一个具体的实施方案中，所述g蛋白具有k217e、d232g、v331a、v371e、g436d、t438s、f453l、t471i、y487h的氨基酸取代。

91、在一个具体的实施方案中，所述g蛋白具有d232g、v331a、v371e、g436d、t438s、f453l、t471i、y487h的氨基酸取代。

92、在一个具体的实施方案中，所述g蛋白具有v331a、v371e、g436d、t438s、f453l、t471i、y487h的氨基酸取代。

93、在一个具体的实施方案中，所述g蛋白具有v371e、g436d、t438s、f453l、t471i、y487h的氨基酸取代。

94、在一个具体的实施方案中，所述g蛋白具有g436d、t438s、f453l、t471i、y487h的氨基酸取代。

95、在一个具体的实施方案中，所述g蛋白具有t438s、f453l、t471i、y487h的氨基酸取代。

96、在一个具体的实施方案中，所述g蛋白具有f453l、t471i、y487h的氨基酸取代。

97、在一个具体的实施方案中，所述g蛋白具有t471i、y487h的氨基酸取代。

98、在一个具体的实施方案中，所述g蛋白具有y487h的氨基酸取代。

99、在本技术中，野生型vsv病毒indiana muddsummer亚型g蛋白包含如seq id no 12所示的氨基酸序列。

100、在一个具体的实施方案中，所述g蛋白如seq id no 13所示的氨基酸序列。

101、一种重组溶瘤病毒，所述重组溶瘤病毒包含上述m蛋白，或上述m蛋白和g蛋白；所述重组溶瘤病毒还包括n蛋白；所述n蛋白与seq id no 14所示的氨基酸序列相比，包含以下一个或多个位点突变：在第14位的异亮氨酸突变为缬氨酸(i14v)；和/或，在第155位的精氨酸突变为赖氨酸(r155k)；和/或，在第353位的丝氨酸突变为天冬酰胺(s353n)。

102、在一个具体的实施方案中，所述n蛋白的位点突变包含在第14位的异亮氨酸突变为缬氨酸(i14v)。

103、在一个具体的实施方案中，所述n蛋白的位点突变包含在第155位的精氨酸突变为赖氨酸(r155k)。

104、在一个具体的实施方案中，所述n蛋白的位点突变包含在第353位的丝氨酸突变为天冬酰胺(s353n)。

105、在一个具体的实施方案中，所述n蛋白具有i14v的氨基酸取代。

106、在一个具体的实施方案中，所述n蛋白具有i14v、r155k的氨基酸取代。

107、在一个具体的实施方案中，所述n蛋白具有i14v、r155k、s353n的氨基酸取代。

108、在一个具体的实施方案中，所述n蛋白具有r155k、s353n的氨基酸取代。

109、在一个具体的实施方案中，所述n蛋白具有s353n的氨基酸取代。

110、在本技术中，野生型vsv病毒indiana muddsummer亚型n蛋白包含如seq id no 14所示的氨基酸序列。

111、在一个具体的实施方案中，所述n蛋白包含如seq id no 15所示的氨基酸序列。

112、一种重组溶瘤病毒，所述重组溶瘤病毒包含上述m蛋白；或上述m蛋白和g蛋白；或上述m蛋白、g蛋白和n蛋白；所述重组溶瘤病毒还包括p蛋白；所述p蛋白与seq id no 16所示的氨基酸序列相比，包括以下一个或多个位点突变：在第50位的精氨酸突变为赖氨酸(r50k)；和/或，在第76位的缬氨酸突变为丙氨酸(v76a)；和/或，在第99位的天冬酰胺突变为谷氨酸(d99e)；和/或，在第126位的亮氨酸突变为丝氨酸(l126s)；和/或，在第140位的亮氨酸突变为丝氨酸(l140s)；和/或，在第151位的组氨酸突变为酪氨酸(h151y)；和/或，在第168位的异亮氨酸突变为甲硫氨酸(i168m)；和/或，在第170位的赖氨酸突变为谷氨酸(k170e)；和/或，在第189位的酪氨酸突变为丝氨酸(y189s)；和/或，在第237位的天冬酰胺突变为天冬氨酸(n237d)。

113、在一个具体的实施方案中，所述p蛋白的位点突变包含在第50位的精氨酸突变为赖氨酸(r50k)。

114、在一个具体的实施方案中，所述p蛋白的位点突变包含在第76位的缬氨酸突变为丙氨酸(v76a)。

115、在一个具体的实施方案中，所述p蛋白的位点突变包含在第99位的天冬酰胺突变为谷氨酸(d99e)。

116、在一个具体的实施方案中，所述p蛋白的位点突变包含在第126位的亮氨酸突变为丝氨酸(l126s)。

117、在一个具体的实施方案中，所述p蛋白的位点突变包含在第140位的亮氨酸突变为丝氨酸(l140s)。

118、在一个具体的实施方案中，所述p蛋白的位点突变包含在第151位的组氨酸突变为酪氨酸(h151y)。

119、在一个具体的实施方案中，所述p蛋白的位点突变包含在第168位的异亮氨酸突变为甲硫氨酸(i168m)。

120、在一个具体的实施方案中，所述p蛋白的位点突变包含在第170位的赖氨酸突变为谷氨酸(k170e)。

121、在一个具体的实施方案中，所述p蛋白的位点突变包含在第189位的酪氨酸突变为丝氨酸(y189s)。

122、在一个具体的实施方案中，所述p蛋白的位点突变包含在第237位的天冬酰胺突变为天冬氨酸(n237d)。

123、在一个具体的实施方案中，所述p蛋白具有r50k的氨基酸取代。

124、在一个具体的实施方案中，所述p蛋白具有r50k、v76a的氨基酸取代。

125、在一个具体的实施方案中，所述p蛋白具有r50k、v76a、d99e的氨基酸取代。

126、在一个具体的实施方案中，所述p蛋白具有r50k、v76a、d99e、l126s的氨基酸取代。

127、在一个具体的实施方案中，所述p蛋白具有r50k、v76a、d99e、l126s、l140s的氨基酸取代。

128、在一个具体的实施方案中，所述p蛋白具有r50k、v76a、d99e、l126s、l140s、h151y的氨基酸取代。

129、在一个具体的实施方案中，所述p蛋白具有r50k、v76a、d99e、l126s、l140s、h151y、i168m的氨基酸取代。

130、在一个具体的实施方案中，所述p蛋白具有r50k、v76a、d99e、l126s、l140s、h151y、i168m、k170e的氨基酸取代。

131、在一个具体的实施方案中，所述p蛋白具有r50k、v76a、d99e、l126s、l140s、h151y、i168m、k170e、y189s的氨基酸取代。

132、在一个具体的实施方案中，所述p蛋白具有r50k、v76a、d99e、l126s、l140s、h151y、i168m、k170e、y189s、n237d的氨基酸取代。

133、在一个具体的实施方案中，所述p蛋白具有v76a、d99e、l126s、l140s、h151y、i168m、k170e、y189s、n237d的氨基酸取代。

134、在一个具体的实施方案中，所述p蛋白具有d99e、l126s、l140s、h151y、i168m、k170e、y189s、n237d的氨基酸取代。

135、在一个具体的实施方案中，所述p蛋白具有l126s、l140s、h151y、i168m、k170e、y189s、n237d的氨基酸取代。

136、在一个具体的实施方案中，所述p蛋白具有l140s、h151y、i168m、k170e、y189s、n237d的氨基酸取代。

137、在一个具体的实施方案中，所述p蛋白具有h151y、i168m、k170e、y189s、n237d的氨基酸取代。

138、在一个具体的实施方案中，所述p蛋白具有i168m、k170e、y189s、n237d的氨基酸取代。

139、在一个具体的实施方案中，所述p蛋白具有k170e、y189s、n237d的氨基酸取代。

140、在一个具体的实施方案中，所述p蛋白具有y189s、n237d的氨基酸取代。

141、在一个具体的实施方案中，所述p蛋白具有n237d的氨基酸取代。

142、在本技术中，野生型vsv病毒indiana muddsummer亚型p蛋白包含如seq id no 16所示的氨基酸序列。

143、在一个具体的实施方案中，所述n蛋白包含如seq id no 17所示的氨基酸序列。

144、一种重组溶瘤病毒，所述重组溶瘤病毒包含上述m蛋白；或上述m蛋白和g蛋白；或上述m蛋白、g蛋白和n蛋白；或上述m蛋白、g蛋白、n蛋白和p蛋白；所述重组溶瘤病毒还包括l蛋白；所述l蛋白与seq id no 18所示的氨基酸序列相比，包括以下一个或多个位点突变：在第87位的丝氨酸突变为脯氨酸(s87p)；和/或，在第487位的异亮氨酸突变为苏氨酸(i487t)。

145、在一个具体的实施方案中，所述l蛋白的位点突变包含在第87位的丝氨酸突变为脯氨酸(s87p)。

146、在一个具体的实施方案中，所述l蛋白的位点突变包含在第487位的异亮氨酸突变为苏氨酸(i487t)。

147、在一个具体的实施方案中，所述l蛋白具有s87p、i487t的氨基酸取代。

148、在本技术中，野生型vsv病毒indiana muddsummer亚型l蛋白包含如seq id no 18所示的氨基酸序列。

149、在一个具体的实施方案中，所述l蛋白包含如seq id no 19所示的氨基酸序列。

150、在一些具体的实施方案中，所述重组溶瘤病毒是以棒状病毒为基础，进行定点突变后获得的。

151、在一些具体的实施方案中，所述重组溶瘤病毒是以vesicular stomatitis virus(简称“vsv”)病毒为基础，进行定点突变后获得的。

152、在一些具体的实施方案中，所述重组溶瘤病毒是以vsv病毒indiana muddsummer亚型为基础，进行定点突变后获得的。

153、在一些具体的实施方案中，所述重组溶瘤病毒还包含或表达外源目的蛋白。

154、在一些具体的实施方案中，所述重组溶瘤病毒包含核酸分子；所述核酸分子包含编码所述具有位点突变的m蛋白的核酸序列、和/或编码所述具有位点突变的g蛋白的核酸序列、和/或编码所述具有位点突变的n蛋白的核酸序列、和/或编码所述具有位点突变的p蛋白的核酸序列、和/或编码所述位点突变的l蛋白的核酸序列、和编码所述细胞因子的核酸序列。

155、在一些具体的实施方案中，所述核酸分子中，所述编码细胞因子的核酸序列位于编码所述具有位点突变的g蛋白的核酸序列与编码所述位点突变的l蛋白的核酸序列之间。

156、在一些具体的实施方案中，所述核酸分子中，所述编码细胞因子的核酸序列位于编码所述具有位点突变的m蛋白的核酸序列、和/或编码所述具有位点突变的g蛋白的核酸序列、和/或编码所述具有位点突变的n蛋白的核酸序列、和/或编码所述具有位点突变的p蛋白的核酸序列、和/或编码所述位点突变的l蛋白的核酸序列之间。

157、第二方面，本技术提供一种重组溶瘤病毒表达载体，采用如下技术方案：

158、一种重组溶瘤病毒表达载体，所述重组溶瘤病毒表达载体能够表达上述重组溶瘤病毒。

159、第三方面，本技术提供一种病毒生产细胞，采用如下技术方案：

160、一种病毒生产细胞，所述病毒生产细胞能够产生上述重组溶瘤病毒。

161、第四方面，本技术提供一种疫苗，采用如下技术方案：

162、一种疫苗，所述疫苗是利用上述充重组溶瘤病毒制备的。

163、第五方面，本技术提供一种药物组合物，采用如下技术方案：

164、一种药物组合物，所述药物组合物包括上述重组溶瘤病毒、或上述疫苗，以及任选地药学上可接受的载剂。

165、第六方面，本技术提供上述重组溶瘤病毒、上述重组溶瘤病毒表达载体、上述病毒生产细胞、上述疫苗、上述药物组合物的制备方法。

166、第七方面，本技术提供上述重组溶瘤病毒、上述重组溶瘤病毒表达载体、上述病毒生产细胞、上述疫苗、上述药物组合物在制备用于预防和/或治疗疾病和/或病症的药物中的用途。

167、在一些具体的实施方式中，所述重组溶瘤病毒、所述重组溶瘤病毒表达载体、所述病毒生产细胞、所述疫苗和/或所述药物组合物用于持续杀伤异常增生性细胞的方法中。

168、在一些具体的实施方式中，所述异常增生性细胞选自肿瘤细胞或肿瘤组织的相关细胞。

169、第八方面，本技术提供上述重组溶瘤病毒、上述疫苗、上述药物组合物在制备用于治疗肿瘤的药物中的用途。

170、在一些具体的实施方式中，所述肿瘤包括实体瘤或血液瘤。

171、在一些具体的实施方式中，所述肿瘤包括但不限于急性淋巴母细胞白血病、急性b淋巴细胞白血病、慢性非淋巴细胞白血病、非霍奇金淋巴瘤、肛门癌、星形细胞瘤、基底细胞癌、胆管癌、膀胱癌、乳癌、乳腺癌、宫颈癌、慢性骨髓增生性肿瘤、结直肠癌、子宫内膜癌、室管膜瘤、食道癌、弥漫性大b细胞淋巴瘤、感觉神经母细胞瘤、尤文肉瘤、输卵管癌、胆囊癌、胃癌、胃肠道类癌瘤、肝细胞癌、下咽癌、卡波西肉瘤、肾癌、郎格罕细胞增生症、喉癌、肝癌、肺癌、黑色素瘤、默克尔细胞癌、间皮瘤、口腔癌、神经母细胞瘤、非小细胞肺癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、胰腺神经内分泌肿瘤、咽癌、垂体瘤、前列腺癌、直肠癌、肾细胞癌、视网膜母细胞瘤、皮肤癌、小细胞肺癌、小肠癌、鳞状颈癌、睾丸癌、胸腺瘤、甲状腺癌、子宫癌、阴道癌和血管肿瘤。

172、综上所述，本技术具有以下有益效果：

173、本技术提供的重组溶瘤病毒均对异常增生性(肿瘤)llc细胞、4t1细胞、mc38细胞以及hela细胞具有较好的侵染能力、体外杀伤能力，且在llc细胞、4t1细胞、mc38细胞以及hela细胞内均不容易清除。并且，本技术提供的重组溶瘤病毒均对正常mef细胞的侵染能力较差，体外杀伤能力较差，且本技术提供的重组溶瘤病毒在正常mef细胞内均容易清除。因此，本技术提供的重组溶瘤病毒能够较好的用于肿瘤、癌症等细胞的侵染和杀伤，且在肿瘤、癌症等细胞内不易清除，进一步提高了重组溶瘤病毒对肿瘤、癌症等细胞的治愈率；同时，上述提供的重组溶瘤病毒不会损伤正常细胞，且在正常细胞内时更加容易清除，进一步保证了正常细胞的安全性。