9-芴基甲氧羰基-聚乙二醇-去铁胺偶联物及其应用

1.本发明涉及医药技术领域，具体领域为9-芴基甲氧羰基-聚乙二醇-去铁胺偶联物及其应用。


背景技术：

2.去铁胺(dfo)是一种由链霉素发酵产生的分子，可以结合体内游离的等离子铁和过量的铁，已经被fda批准用于治疗急性或慢性铁超载。口服去铁胺在胃肠道吸收较差，因此去铁胺必须通过肌肉注射、皮下注射或静脉注射途径给药，而对于慢性铁超载患者，一般选择皮下注射途径，静脉注射一般只用于急性铁中毒，严重心脏铁负荷等危及生命的症状。
3.与其他铁螯合剂相比，去铁胺相对安全、患者耐受性良好。尽管如此，去铁胺在给药时仍旧存在很多弊端。首先，去铁胺的半衰期极短(约为5.5分钟)且用药量大(51mg/kg/day)，决定了患者单次用药需要持续皮下注射8～12小时，每周至少五天，这给患者造成了极差的依从性。另一方面，去铁胺本身还具有一定毒性，如此大的给药量和给药频率会给患者造成一些副反应，如慢性去铁胺治疗可导致患者感音神经性听力丧失和视网膜病变，急性副作用包括胃肠道不适、过敏反应、皮肤变色和皮肤刺激等。此外，去铁胺还会增加特定病原体和侵入性真菌感染的风险。因此，减小去铁胺药物本身毒性，延长去铁胺半衰期，进而改善去铁胺的药物动力学和药效学性质可望提高患者用药依从性，降低药物相关的毒副作用。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供9-芴基甲氧羰基-聚乙二醇-去铁胺偶联物及其应用以解决上述背景技术中提到的减小去铁胺药物本身毒性，延长去铁胺半衰期，进而改善去铁胺的药物动力学和药效学性质可望提高患者用药依从性，降低药物相关的毒副作用的技术问题。
5.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：9-芴基甲氧羰基-聚乙二醇-去铁胺偶联物，9-芴基甲氧羰基-聚乙二醇-琥珀酰亚胺与去铁胺分子通过酰胺键连接得到9-芴基甲氧羰基-聚乙二醇-去铁胺偶联物，其结构式如下：
[0006][0007]
优选的，将9-芴基甲氧羰基-聚乙二醇-琥珀酰亚胺在催化剂的作用下与去铁胺反应，得到9-芴基甲氧羰基-聚乙二醇-去铁胺偶联物。
[0008]
优选的，所述催化剂为n，n-二异丙基乙胺。
[0009]
优选的，反应溶剂为无水n，n-二甲基甲酰胺。
[0010]
优选的，反应得到的9-芴基甲氧羰基-聚乙二醇-去铁胺偶联物通过液相纯化，得到分子量为1767-1768的偶联物。
[0011]
9-芴基甲氧羰基-聚乙二醇-去铁胺偶联物的应用，9-芴基甲氧羰基-聚乙二醇-去铁胺偶联物应用于延长去铁胺在生命体内循环时间。
[0012]
9-芴基甲氧羰基-聚乙二醇-去铁胺偶联物的应用，9-芴基甲氧羰基-聚乙二醇-去铁胺偶联物应用于改善铁超载治疗效果。
[0013]
9-芴基甲氧羰基-聚乙二醇-去铁胺偶联物的应用，9-芴基甲氧羰基-聚乙二醇-去铁胺偶联物应用于降低去铁胺毒性。
[0014]
本发明还提供了所述的9-芴基甲氧羰基-聚乙二醇-去铁胺偶联物的合成方法。具体方法如下：将9-芴基甲氧羰基-聚乙二醇-琥珀酰亚胺在催化剂的作用下与去铁胺反应，得到9-芴基甲氧羰基-聚乙二醇-去铁胺偶联物，并通过制备液相纯化，最后通过旋蒸得到最终产物。所述的催化剂为：n，n-二异丙基乙胺(dipea)；反应溶剂为：无水n，n-二甲基甲酰胺(dmf)。
[0015]
所述的9-芴基甲氧羰基-聚乙二醇
1000-琥珀酰亚胺，其结构式如下：
[0016][0017]
去铁胺的结构式如下：
[0018][0019]
优选的，在催化剂的作用下，9-芴基甲氧羰基-聚乙二醇-琥珀酰亚胺和去铁胺分子的反应在无水n,n-二甲基甲酰胺中进行。反应温度为55℃，反应时间为24小时。
[0020]
9-芴基甲氧羰基-聚乙二醇-去铁胺偶联物的合成反应如下：
[0021][0022]
本发明的有益效果是：
[0023]
本发明所合成的9-芴基甲氧羰基-聚乙二醇
1000-去铁胺偶联物与等摩尔浓度的去铁胺有着相当的铁螯合能力，聚乙二醇具有良好的生物相容性和高度的亲水性，其偶联药物毒性明显低于游离药物，9-芴基甲氧羰基-聚乙二醇
1000-去铁胺偶联物的毒性要明显低于同浓度的去铁胺，在形成9-芴基甲氧羰基-聚乙二醇
1000-去铁胺偶联物后，去铁胺的毒性明显降低，芴基甲氧羰基作为氨基的保护基团，与hsa的疏水腔非共价结合，9-芴基甲氧羰基-聚乙二醇
1000-去铁胺偶联物进入体内后可以迅速与hsa结合，9-芴基甲氧羰基-聚乙二醇
1000-去铁胺偶联物与hsa的结合物可以通过白蛋白的再循环途径逃避细胞内溶酶体的降解，且hsa的分子量和其表面的负电荷可以阻止肾脏的排泄，9-芴基甲氧羰基-聚乙二醇
1000-去铁胺偶联物在体内停留时间得以延长，同时酰胺键会断裂，逐渐释放游离去铁胺长达6小时，说明对去铁胺进行结构修饰后得到的9-芴基甲氧羰基-聚乙二醇
1000-去铁胺偶联物可以成功延长去铁胺在体内的半衰期，9-芴基甲氧羰基-聚乙二醇
1000-去铁胺偶联物清除血浆内多余铁的能力比去铁胺有明显提高，9-芴基甲氧羰基-聚乙二醇
1000-去铁胺偶联物相比于去铁胺的减毒效果明显更好。
附图说明
[0024]
图1为实施例中去铁胺、9-芴基甲氧羰基-聚乙二醇
1000-琥珀酰亚胺、以及9-芴基甲氧羰基-聚乙二醇
1000-去铁胺偶联物的1h-nmr谱图；
[0025]
图2为实施例中9-芴基甲氧羰基-聚乙二醇
1000-去铁胺偶联物(fmoc-peg
1000-dfo)和dfo的hplc谱图，其中a:dfo b:fmoc-peg
1000-dfo；
[0026]
图3为实施例中9-芴基甲氧羰基-聚乙二醇
1000-去铁胺偶联物(fmoc-peg
1000-dfo)和dfo的铁离子螯合能力图；
[0027]
图4为实施例中9-芴基甲氧羰基-聚乙二醇
1000-去铁胺偶联物(fmoc-peg
1000-dfo)和dfo的24h细胞毒mtt实验结果；
[0028]
图5为实施例中9-芴基甲氧羰基-聚乙二醇
1000-去铁胺偶联物(fmoc-peg
1000-dfo)和dfo的48h细胞毒mtt实验结果；
[0029]
图6为实施例中9-芴基甲氧羰基-聚乙二醇
1000-去铁胺偶联物(fmoc-peg
1000-dfo)和dfo的72h细胞毒mtt实验结果；
[0030]
图7和图8为实施例中9-芴基甲氧羰基-聚乙二醇
1000-去铁胺偶联物(fmoc-peg
1000-dfo)和dfo的药物动力学实验结果；
[0031]
图9为实施例中9-芴基甲氧羰基-聚乙二醇
1000-去铁胺偶联物(fmoc-peg
1000-dfo)和dfo的药效学实验结果；
[0032]
图10为实施例中9-芴基甲氧羰基-聚乙二醇
1000-去铁胺偶联物(fmoc-peg
1000-dfo)和dfo的肝组织病理表现实验结果。
具体实施方式
[0033]
下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0034]
实施例：9-芴基甲氧羰基-聚乙二醇
1000-去铁胺偶联物的合成
[0035]
称取dfo(26.2716mg，0.04mmol)置于7ml二甲基甲酰胺(dmf)中，55℃条件下加热并搅拌直至dfo完全溶解，然后称取fmoc-peg
1000-nhs(53.6mg，0.04mmol)溶解在1ml dmf中，将其加入到dfo溶液中，最后向其中加入20μl的dipea调节反应体系为弱碱性，在55℃条件下氮气保护反应24h后，将反应液减压旋干。通过高效液相法(hplc)确定新化合物的生成后，用制备液相色谱仪对反应后的混合物进行分离纯化，最后减压旋干得到9-芴基甲氧羰基-聚乙二醇
1000-去铁胺偶联物。采用核磁共振氢谱来确认实施例1中化合物的结构，结果如图1所示，波谱解析如下：1.2ppm、1.4ppm、1.5ppm分别对应去铁胺分子中(a)、(b)、(c)处的h，另外，7.325ppm、7.397ppm、7.658ppm、7.882ppm分别对应9-芴基甲氧羰基-聚乙二醇
1000-琥珀酰亚胺结构中(d)、(e)、(f)、(g)处的h；2.883ppm对应9-芴基甲氧羰基-聚乙二醇
1000-琥珀酰亚胺结构中(h)处的h。
[0036]
分别取(6.56mg 0.01mmol)去铁胺和(17.67mg 0.01mmol)9-芴基甲氧羰基-聚乙二醇
1000-去铁胺偶联物(偶联物与去铁胺游离药有等量的去铁胺)，分别溶于10ml的蒸馏水中，将两种溶液与等量的10mm硫酸亚铁铵溶液混合均与并孵育30分钟，使用高效液相色谱法进行检测。结果如图2所示，从图2中可以得出，在与9-芴基甲氧羰基-聚乙二醇
1000-琥珀酰亚胺结合后，去铁胺的保留时间由2.2分钟延长到3.2分钟，而且无去铁胺的峰存在，表明9-芴基甲氧羰基-聚乙二醇
1000-去铁胺偶联物合成及纯化的成功。
[0037]
纯化后的9-芴基甲氧羰基-聚乙二醇
1000-去铁胺偶联物在水中的溶解度达到35.34mg/ml(0.02mmol/ml)。分别取(6.56mg 0.01mmol)去铁胺和(17.67mg0.01mmol)9-芴基甲氧羰基-聚乙二醇
1000-去铁胺偶联物(偶联物与去铁胺游离药有等量的去铁胺)，分别溶于10ml的蒸馏水中，将两种溶液与等量的10mm硫酸亚铁铵溶液混合均与并孵育30分钟，采用紫外可见光分光光度法在波长430nm处测定吸光度来考察铁离子螯合能力。结果如图3所示，去铁胺螯合铁离子的特征吸收峰在430nm，9-芴基甲氧羰基-聚乙二醇
1000-去铁胺偶联物螯合铁离子后吸收峰也在430nm处。因此，本发明中合成的9-芴基甲氧羰基-聚乙二醇
1000-去铁胺偶联物与等摩尔浓度的去铁胺有着相当的铁螯合能力。
[0038]
细胞毒性采用mtt法检测细胞毒性，采用的样品分别为去铁胺和9-芴基甲氧羰基-聚乙二醇
1000-去铁胺偶联物。将上述的样品分别溶于dmem培养基中配制成去铁胺等效浓度为1mm的溶液，用于接下来的细胞毒实验时，使用dmem完全培养基稀释成去铁胺等效浓度为500μm、250μm、200μm、100μm、50μm、10μm、1μm的溶液。对照组采用等体积的dmem培养基。将raw246.7小鼠单核巨噬细胞接种于96孔板种，密度为每孔3
×
103个，培养12小时后弃去培养基更换为上述含有不同浓度的去铁胺和9-芴基甲氧羰基-聚乙二醇
1000-去铁胺偶联物的dmem完全培养基。继续分别培养24小时、48小时和72小时，然后采取mtt法检测细胞毒性。细胞毒性mtt检验结果如图4、5和6所示，从图中可以看出，9-芴基甲氧羰基-聚乙二醇
1000-去铁胺偶联物的毒性要明显低于同浓度的去铁胺。这表明，在形成9-芴基甲氧羰基-聚乙二醇
1000-去铁胺偶联物后，去铁胺的毒性明显降低。
[0039]
9-芴基甲氧羰基-聚乙二醇
1000-去铁胺偶联物的药代动力学试验
[0040]
取6只雄性健康大鼠，体重180-200g，随机分为2组，每组3只，按照去铁胺等效剂量50mg/kg称取去铁胺和9-芴基甲氧羰基-聚乙二醇
1000-去铁胺偶联物并溶于适量的生理盐水中，通过尾静脉注射的方式给药，按时眼眶取血，离心获得血浆，通过高效液相色谱仪测
定血浆中药物的浓度。药代动力学试验结果如图7所示，药代动力学研究参数如表1所示；从图7和8中可以看出，在尾静脉注射给药后的30分钟内，游离的去铁胺就已经全部被代谢掉了，而9-芴基甲氧羰基-聚乙二醇
1000-去铁胺偶联物进入体内后可以迅速与hsa结合，同时酰胺键会断裂，逐渐释放游离dfo长达6小时，说明对dfo进行结构修饰后得到的9-芴基甲氧羰基-聚乙二醇
1000-去铁胺偶联物可以成功延长dfo在体内的半衰期。
[0041]
表1药代动力学参数
[0042][0043]
9-芴基甲氧羰基-聚乙二醇
1000-去铁胺偶联物在治疗铁超载方面的试验
[0044]
选取健康的balb/c雌性小鼠，分笼饲养，造模前一天将小鼠称重。配制含铁量为35％的右旋糖酐铁溶液(dextran/fe，生理盐水)，将该溶液过滤除菌后，对小鼠实施尾静脉注射，剂量为150mg/kg，以建立小鼠铁超载模型。在注射右旋糖酐铁后的第八天，将小鼠随机分成3组，每组5只，分别为对照组(control组)，dfo组和fmoc-peg
1000-dfo组，本文还设立了一组健康小鼠作为空白组(blank组)。dfo组和fmoc-peg
1000-dfo组对应的剂量分别为150mg/kg和403mg/kg，control组和blank组给予等体积生理盐水。每组小鼠按剂量每两天尾静脉注射给药一次，共给药五次。开始给药后，小鼠开始喂养缺铁饲料，在最后一次给药七天后，将所有小鼠摘眼球采血并将血液置于涂有肝素的采血管中，13000rpm/min条件下离心5min，取上清备用。采用竞争酶联免疫吸附法(elisa)测定小鼠血浆中铁蛋白，结果如图9所示，从blank组和control两组对比结果看出，control组血浆内fe含量显著提升，说明小鼠铁超载模型建立成功；另外两组结果显示，dfo和fmoc-peg
1000-dfo都能够使小鼠血浆铁蛋白含量下降，但fmoc-peg
1000-dfo组的铁蛋白含量更低一些，且与dfo组对比有显著性差异，说明9-芴基甲氧羰基-聚乙二醇
1000-去铁胺偶联物清除血浆内多余铁的能力比去铁胺有明显提高。
[0045]
除此之外，本发明还对小鼠的肝组织病理表现进行试验，将肝组织脱水并包埋在石蜡中，使用组织样品切片机将包埋的样本切成4μm的薄片，使用苏木紫(hematoxylin)和伊红(eosin)对样品进行染色，最后将染好色的切片标本置于显微镜下观察，结果见图10所示：control组的切片组织可见广泛性气球样变，肝细胞胞质消失，胞核位于中央，细胞呈气球样肿胀(箭头1)，有大量炎性细胞(箭头2)出现；fmoc-peg
1000-dfo组的切片组织的细胞呈气球性肿胀(箭头1)，但没有发现任何炎性浸润；dfo组的切片组织的细胞呈气球性肿胀(箭头1)，除此之外，在中央静脉周围发现有炎性细胞聚集，形成炎性小灶(箭头2)。这说明去铁胺和9-芴基甲氧羰基-聚乙二醇
1000-去铁胺偶联物都可以减轻铁超载造成的肝毒性，但是9-芴基甲氧羰基-聚乙二醇
1000-去铁胺偶联物的减毒效果明显更好。
[0046]
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。