检测TLX1基因中目标区域的甲基化水平的试剂在制备食管癌诊断产品中的应用的制作方法

本发明涉及生物医学领域，具体而言，涉及检测tlx1基因中目标区域的甲基化水平的试剂在制备食管癌诊断产品中的应用。

背景技术：

1、食管癌是起源于食管黏膜上皮的恶性肿瘤，是临床常见的恶性肿瘤之一。食管癌的早期症状并不明显，且多为非持续性的，因而超过90％的食管癌患者在确诊时已进展至中晚期，患者预后差，生活质量低，总体的5年生存率不足20％。而早期食管癌(仅累及黏膜层和黏膜下浅层的病变)通常经内镜下微创治疗即可根治，患者5年生存率超过95％。因此，食管癌的早期发现、早期诊断和早期治疗是降低死亡率和提高生存率的主要策略。

2、目前，食管内镜及病理活检是诊断食管癌的金标准。但是，由于内镜检查操作难度比较大，对医师的技术水平要求较高，且患者对内镜检查存在一定的畏惧心理，其依从性较差。因此，完善现有的筛查和诊断方法，是实现食管癌诊治的关键步骤。

3、有鉴于此，特提出本发明。

技术实现思路

1、本发明实施例的目的包括提供检测tlx1基因位于chr10:101133915-101135295的区域或者该区域中的部分区域的甲基化水平的试剂在制备食管癌诊断产品中的应用，本发明实施例用tlx1基因中目标区域的甲基化水平的检测试剂制备食管癌诊断试剂盒，采用该试剂盒能够检出食管癌，为食管癌的筛查和诊断提供新的技术方案，该技术方案能够实现食管癌的无创或微创筛查和诊断。

2、在本发明的第一方面，提供检测tlx1基因中的目标区域的的甲基化水平的试剂在制备食管癌诊断产品中的应用；

3、以grch38.p14为参考基因组，所述目标区域为chr10:101133915-101135295或者chr10:101133915-101135295的部分区域。

4、在本发明的一些实施方式中，所述试剂通过如下方法中的一种或多种实现对所述目标区域的甲基化水平的检测：甲基化特异性pcr、亚硫酸氢盐测序法、甲基化特异性微阵列法、全基因组甲基化测序法、焦磷酸测序法、甲基化特异性高效液相层析法、数字pcr法、甲基化特异性高分辨率溶解曲线法、甲基化敏感性限制性内切酶法和荧光定量法。

5、在本发明的一些实施方式中，所述试剂包括检测所述目标区域的甲基化水平的检测引物对及其对应的检测探针。

6、在本发明的一些实施方式中，所述部分区域选自如下定义的区域1至区域11中的一个或者多个：

7、区域1为chr10:101133915-101134052，正链，

8、区域2为chr10:101134069-101134255，正链，

9、区域3为chr10:101134283-101134399，正链，

10、区域4为chr10:101134414-101134556，正链，

11、区域5为chr10:101134768-101134867，正链，

12、区域6为chr10:101134881-101134969，正链，

13、区域7为chr10:101135295-101135138，负链，

14、区域8为chr10:101134947-101134788，负链，

15、区域9为chr10:101134493-101134344，负链，

16、区域10为chr10:101134336-101134178，负链，

17、区域11为chr10:101134072-101133926，负链。

18、在本发明的一些实施方式中，所述试剂包括：

19、检测所述区域1的如seq id no.23和seq id no.24所示的检测引物对及其对应的如seq id no.25所示的检测探针；或/和，

20、检测所述区域2的如seq id no.26和seq id no.27所示的检测引物对及其对应的如seq id no.28所示的检测探针；或/和，

21、检测所述区域3的如seq id no.29和seq id no.30所示的检测引物对及其对应的如seq id no.31所示的检测探针；或/和，

22、检测所述区域4的如seq id no.32和seq id no.33所示的检测引物对及其对应的如seq id no.34所示的检测探针；或/和，

23、检测所述区域5的如seq id no.35和seq id no.36所示的检测引物对及其对应的如seq id no.37所示的检测探针；或/和，

24、检测所述区域6的如seq id no.38和seq id no.39所示的检测引物对及其对应的如seq id no.40所示的检测探针；或/和，

25、检测所述区域7的如seq id no.41和seq id no.42所示的检测引物对及其对应的如seq id no.43所示的检测探针；或/和，

26、检测所述区域8的如seq id no.44和seq id no.45所示的检测引物对及其对应的如seq id no.46所示的检测探针；或/和，

27、检测所述区域9的如seq id no.47和seq id no.48所示的检测引物对及其对应的如seq id no.49所示的检测探针；或/和，

28、检测所述区域10的如seq id no.50和seq id no.51所示的检测引物对及其对应的如seq id no.52所示的检测探针；或/和，

29、检测所述区域11的如seq id no.53和seq id no.54所示的检测引物对及其对应的如seq id no.55所示的检测探针。

30、在本发明的一些实施方式中，所述试剂还包括检测内参基因的检测引物对和所述检测引物对对应的检测探针。

31、在本发明的一些实施方式中，所述内参基因包括actb基因，所述actb基因对应seqid no.56和seq id no.57所示的检测引物对和seq id no.58所示的检测探针。

32、在本发明的一些实施方式中，检测的样本包括细胞样本、组织样本或者血液样本。

33、在本发明的一些实施方式中，所述食管癌为食管鳞癌。

34、在本发明的第二方面，提供一种食管癌诊断试剂盒，包括第一方面中所定义的试剂。

35、在本发明的一些实施方式中，所述诊断试剂盒还包括扩增试剂、将未甲基化的胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶的试剂、dna提取试剂、dna纯化试剂和质控品中的一种或者多种。

36、在本发明的一些实施方式中，所述扩增试剂包括扩增缓冲液、dntps、dna聚合酶和mg2+中的一种或者多种。

37、相对于传统技术，本发明具备如下有益效果：

38、发明人在研究食管癌的过程中发现，食管癌变与tlx1基因的甲基化相关，通过检测tlx1基因位于chr10:101133915-101135295的区域或者该区域的部分区域的甲基化水平，能够区分食管癌患者、食管良性病变患者和健康人，从而为食管癌的筛查和诊断提供新的技术方案，该技术方案能够实现食管癌的无创或微创筛查和诊断。

39、具体实施方式

40、下面结合实施方式和实施例，对本发明作进一步详细的说明。应理解，这些实施方式和实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，提供这些实施方式和实施例的目的是使对本发明公开内容理解更加透彻全面。还应理解，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方式和实施例，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下作各种改动或修改，得到的等价形式同样落于本技术的保护范围。此外，在下文的描述中，给出了大量具体的细节以便提供对本发明更为充分地理解，应理解，本发明可以无需一个或多个这些细节而得以实施。

41、除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述实施方式和实施例的目的，不是旨在于限制本发明。

42、术语

43、除非另外说明或存在矛盾之处，本文中使用的术语或短语具有以下含义：

44、本发明所使用的术语“和/或”、“或/和”、“及/或”的选择范围包括两个或两个以上相关所列项目中任一个项目，也包括相关所列项目的任意的和所有的组合，所述任意的和所有的组合包括任意的两个相关所列项目、任意的更多个相关所列项目、或者全部相关所列项目的组合。需要说明的是，当用至少两个选自“和/或”、“或/和”、“及/或”的连词组合连接至少三个项目时，应当理解，在本技术中，该技术方案毫无疑问地包括均用“逻辑与”连接的技术方案，还毫无疑问地包括均用“逻辑或”连接的技术方案。比如，“a及/或b”包括a、b和a+b三种并列方案。又比如，“a，及/或，b，及/或，c，及/或，d”的技术方案，包括a、b、c、d中任一项(也即均用“逻辑或”连接的技术方案)，也包括a、b、c、d的任意的和所有的组合，也即包括a、b、c、d中任两项或任三项的组合，还包括a、b、c、d的四项组合(也即均用“逻辑与”连接的技术方案)。

45、本发明中涉及“多个”、“多种”、“多次”、“多元”等，如无特别限定，指在数量上大于2或等于2。例如，“一种或多种”表示一种或大于等于两种。

46、本发明中所使用的“其组合”、“其任意组合”、“其任意组合方式”等中包括所列项目中任两个或任两个以上项目的所有合适的组合方式。

47、本发明中，“合适的组合方式”、“合适的方式”、“任意合适的方式”等中所述“合适”，以能够实施本发明的技术方案、解决本发明的技术问题、实现本发明预期的技术效果为准。

48、本发明中，“优选”、“更好”、“更佳”、“为宜”仅为描述效果更好的实施方式或实施例，应当理解，并不构成对本发明保护范围的限制。

49、本发明中，“进一步”、“更进一步”、“特别”等用于描述目的，表示内容上的差异，但并不应理解为对本发明保护范围的限制。

50、本发明中，“可选地”、“可选的”、“可选”，指可有可无，也即指选自“有”或“无”两种并列方案中的任一种。如果一个技术方案中出现多处“可选”，如无特别说明，且无矛盾之处或相互制约关系，则每项“可选”各自独立。

51、本发明中，“第一方面”、“第二方面”、“第三方面”、“第四方面”等中，术语“第一”、“第二”、“第三”、“第四”等仅用于描述目的，不能理解为指示或暗示相对重要性或数量，也不能理解为隐含指明所指示的技术特征的重要性或数量。而且“第一”、“第二”、“第三”、“第四”等仅起到非穷举式的列举描述目的，应当理解并不构成对数量的封闭式限定。

52、本发明中，以开放式描述的技术特征中，包括所列举特征组成的封闭式技术方案，也包括包含所列举特征的开放式技术方案。

53、本发明中，涉及到数值区间(也即数值范围)，如无特别说明，可选的数值分布在上述数值区间内视为连续，且包括该数值范围的两个数值端点(即最小值及最大值)，以及这两个数值端点之间的每一个数值。如无特别说明，当数值区间仅仅指向该数值区间内的整数时，包括该数值范围的两个端点整数，以及两个端点之间的每一个整数，在本文中，相当于直接列举了每一个整数，比如t为选自1～10的整数，表示t为选自由1、2、3、4、5、6、7、8、9和10构成的整数组的任一个整数。此外，当提供多个范围描述特征或特性时，可以合并这些范围。换言之，除非另有指明，否则本文中所公开之范围应理解为包括其中所归入的任何及所有的子范围。

54、本发明中的温度参数，如无特别限定，既允许为恒温处理，也允许在一定温度区间内存在变动。应当理解的是，所述的恒温处理允许温度在仪器控制的精度范围内进行波动。允许在如±5℃、±4℃、±3℃、±2℃、±1℃的范围内波动。

55、本发明中，％(w/w)与wt％均表示重量百分比，％(v/v)指体积百分比，％(w/v)指质量体积百分数。

56、本发明中，“食管癌”是一种自下咽到食管胃交界部之间食管上皮来源的消化道恶性肿瘤。食管癌主要包括食管鳞状细胞癌和食管腺癌。

57、本发明中，术语“诊断”包括辅助诊断、复发风险评估、癌变风险和癌变程度的评估、预后判断等方面。

58、术语“基因”是指编码产生氨基酸多肽链的dna区段，它包括参与基因转录/翻译和转录/翻译调控的位于编码区和非编码区的序列，以及外显子和内含子序列。

59、术语“寡核苷酸”或“多核苷酸”或“核苷酸”或“核酸”是指具有两个或更多个脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的分子，优选多于三个，并且通常多于十个。确切的大小将取决于许多因素，而所述因素又取决于寡核苷酸的最终功能或用途。寡核苷酸可以任何方式产生，包括化学合成、dna复制、逆转录或其组合。dna的典型脱氧核糖核苷酸是胸腺嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶和鸟嘌呤。rna的典型核糖核苷酸是尿嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶和鸟嘌呤。

60、术语“甲基化”为dna化学修饰的一种形式，能够在不改变dna序列的前提下，改变遗传表现。dna甲基化是指在dna甲基转移酶的作用下，在基因组cpg二核苷酸的胞嘧啶第5号碳位共价结合一个甲基基团。dna甲基化能引起染色质结构、dna构象、dna稳定性及dna与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达。

61、术语“甲基化水平”指的是一段dna序列中一个或多个cpg二核苷酸中的胞嘧啶是否发生甲基化、或发生甲基化的频率/比例/百分数，既代笔定性的概念又代表定量的概念。在实际应用中，可根据实际情况采用不同的检测指标比较dna甲基化水平。如在一些情况下，可根据样本检测的ct值进行比较；在一些情况下，可计算样本中基因甲基化的比例，即甲基化分子数/(甲基化分子数+非甲基化分子数)×100，然后再进行比较；在一些情况下，还需要对各个指标进行统计学上的分析整合，得出最终的判定指标。

62、术语“引物”是指可以用在扩增方法(例如聚合酶链式反应pcr)中，基于与目标基因或其一部分区域相对应的多核苷酸序列来扩增目的序列的寡核苷酸。通常，用于扩增多核苷酸序列的pcr引物中的至少一个对于该多核苷酸序列是序列特异性的。引物的确切长度取决于很多因素，包括温度、引物来源以及所用方法等。例如，对于诊断和预后应用，根据靶序列的复杂度，寡核苷酸引物通常含有至少10、15、20、25或更多个核苷酸，但是也可以含有更少的核苷酸。在本公开内容中，术语“引物”是指能与目标dna分子的双链杂交或能与目标dna分子中位于待扩增核苷酸序列两翼的区域杂交的一对引物。

63、术语“taqman探针”是指包含5’荧光基团和3’淬灭基团的一段寡核苷酸序列。当探针与dna上的相应位点结合时，因为荧光基团附近存在淬灭基团，探针不会发出荧光。在扩增过程中，如果探针与被扩增的链结合，dna聚合酶(如taq酶)的5’-3’核酸外切酶活性会消化探针，荧光基团远离淬灭基团，其能量不被吸收，即产生荧光信号。每经过一个pcr循环，荧光信号也和目的片段一样，有一个同步的指数增长的过程。

64、在本发明提及的所有文献都在本技术中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。除非和本技术的发明目的和/或技术方案相冲突，否则，本发明涉及的引用文献以全部内容、全部目的被引用。本发明中涉及引用文献时，相关技术特征、术语、名词、短语等在引用文献中的定义也一并被引用。本发明中涉及引用文献时，被引用的相关技术特征的举例、优选方式也可作为参考纳入本技术中，但以能够实施本发明为限。应当理解，当引用内容与本技术中的描述相冲突时，以本技术为准或者适应性地根据本技术的描述进行修正。

65、随着精准医学时代的到来，液体活检技术由于其创伤小、易取样等优点，为肿瘤的临床诊断和治疗提供了新的选择。已有研究发现，在食管癌中，抑癌基因dna分子启动子区域cpg岛的高甲基化是一件频繁发生的事件，又考虑到dna分子的甲基化通常发生在癌症的早期，因而利用dna分子甲基化状态的改变等特征可以用来诊断或辅助诊断早期食管癌。但是，目前尚无商业化的食管癌甲基化诊断试剂或试剂盒问世，急需无创或微创的、便捷的食管癌筛查或诊断手段。

66、本发明的第一方面

67、在本发明的第一方面，提供检测tlx1基因中的目标区域的甲基化水平的试剂在制备食管癌诊断产品中的应用；

68、以grch38.p14为参考基因组，所述目标区域为chr10:101133915-101135295或者chr10:101133915-101135295的部分区域。

69、在本发明的一些实施方式中，所述试剂通过如下方法中的一种或多种实现对所述目标区域的甲基化水平的检测：甲基化特异性pcr、亚硫酸氢盐测序法、甲基化特异性微阵列法、全基因组甲基化测序法、焦磷酸测序法、甲基化特异性高效液相层析法、数字pcr法、甲基化特异性高分辨率溶解曲线法、甲基化敏感性限制性内切酶法和荧光定量法。

70、在本发明的一些实施方式中，所述试剂包括检测所述目标区域的甲基化水平的检测引物对及其对应的检测探针。

71、在本发明的一些实施方式中，所述部分区域选自如下定义的区域1至区域11中的一个或者多个：

72、区域1为chr10:101133915-101134052，正链，

73、区域2为chr10:101134069-101134255，正链，

74、区域3为chr10:101134283-101134399，正链，

75、区域4为chr10:101134414-101134556，正链，

76、区域5为chr10:101134768-101134867，正链，

77、区域6为chr10:101134881-101134969，正链，

78、区域7为chr10:101135295-101135138，负链，

79、区域8为chr10:101134947-101134788，负链，

80、区域9为chr10:101134493-101134344，负链，

81、区域10为chr10:101134336-101134178，负链，

82、区域11为chr10:101134072-101133926，负链。

83、在本发明的一些实施方式中，所述试剂包括：

84、检测所述区域1的如seq id no.23和seq id no.24所示的检测引物对及其对应的如seq id no.25所示的检测探针；或/和，

85、检测所述区域2的如seq id no.26和seq id no.27所示的检测引物对及其对应的如seq id no.28所示的检测探针；或/和，

86、检测所述区域3的如seq id no.29和seq id no.30所示的检测引物对及其对应的如seq id no.31所示的检测探针；或/和，

87、检测所述区域4的如seq id no.32和seq id no.33所示的检测引物对及其对应的如seq id no.34所示的检测探针；或/和，

88、检测所述区域5的如seq id no.35和seq id no.36所示的检测引物对及其对应的如seq id no.37所示的检测探针；或/和，

89、检测所述区域6的如seq id no.38和seq id no.39所示的检测引物对及其对应的如seq id no.40所示的检测探针；或/和，

90、检测所述区域7的如seq id no.41和seq id no.42所示的检测引物对及其对应的如seq id no.43所示的检测探针；或/和，

91、检测所述区域8的如seq id no.44和seq id no.45所示的检测引物对及其对应的如seq id no.46所示的检测探针；或/和，

92、检测所述区域9的如seq id no.47和seq id no.48所示的检测引物对及其对应的如seq id no.49所示的检测探针；或/和，

93、检测所述区域10的如seq id no.50和seq id no.51所示的检测引物对及其对应的如seq id no.52所示的检测探针；或/和，

94、检测所述区域11的如seq id no.53和seq id no.54所示的检测引物对及其对应的如seq id no.55所示的检测探针。

95、优选地，所述部分区域包括选自所述的区域3、区域8、区域9和区域10中的一个或者多个。进一步优选地，所述部分区域为所述区域3。发明人进一步发现，利用tlx1基因中的所述区域3、所述区域8、所述区域9或者所述区域10的甲基化水平进行食管癌早期的诊断效果明显较好，灵敏度和特异性均较高。因此，用检测区域3、区域8、区域9和区域10中的一个或者多个区域甲基化水平的试剂所制备的食管癌诊断产品，还进一步解决了食管癌早期检出率低的问题，为早期食管癌的临床诊断提供一种高灵敏度、高特异性的无创或者微创方案。

96、在本发明的一些实施方式中，所述试剂还包括检测内参基因的检测引物对和所述检测引物对对应的检测探针。

97、在本发明的一些实施方式中，所述内参基因包括actb基因，所述actb基因对应seqid no.56和seq id no.57所示的检测引物对和seq id no.58所示的检测探针。

98、在本发明的一些实施方式中，检测样本包括细胞样本、组织样本或者血液样本。

99、在本发明的一些实施方式中，所述食管癌为食管鳞癌。

100、本发明的第二方面

101、本发明提供一种食管癌诊断试剂盒，包括第一方面中所定义的试剂。

102、在本发明的一些实施方式中，所述诊断试剂盒还包括扩增试剂、将未甲基化的胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶的试剂、dna提取试剂、dna纯化试剂和质控品中的一种或者多种。

103、在本发明的一些实施方式中，所述扩增试剂包括扩增缓冲液、dntps、dna聚合酶和mg2+中的一种或者多种。