一种菌株及其应用

1.本发明涉及菌株技术领域，具体涉及一种colletotrichum aeschynomenes菌株及其应用。


背景技术：

2.根腐病是危害三七属植物最为严重的根部病害之一，主要侵染植物的根部，造成根部软化腐烂、萎蔫，进而造成大面积的植物死亡，严重影响三七属产业的健康发展。随着人们对生态环境保护意识的显著提高，以安全、无污染、低成本、高效的防治根腐病是保证中药材安全性和有效性的条件之一。因此筛选高效对抗病原菌的生防菌株并开发生防菌剂是当前三七属植物根腐病防治研究的热点。
3.植物内生菌是是指生活史的某一阶段或整个阶段存在于健康植物组织或器官内部并与宿主形成互利共生关系的细菌、真菌或放线菌等。内生菌不仅可以给植物提供所需的营养物质，促进植物生长，还参与植物的防卫功能，增强植物抗逆境和抗病害的能力。因此基于内生菌拮抗菌的筛选及生防菌剂的研发是根腐病防治的有效方法及途径。
4.本技术从三七分离的内生菌中筛选拮抗根腐病的生防菌，经过发酵培养，在盆栽试验下验证抗三七根腐效果，旨在为三七属植物开发特异性微生物菌剂奠定基础。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种菌株及其应用，对三七内生菌进行分离及鉴定，通过平板对峙试验筛选三七内生菌，形态学及分子生物鉴定拮抗菌株，单因素试验优选菌株发酵条件，通过盆栽试验验证菌剂防治效果。
6.为解决上述的技术问题，本发明采用以下技术方案：
7.一种菌株,本发明述菌株为colletotrichum aeschynomenes sf-1，该菌株保藏于：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏日期为：2022年4月21日；保藏编号为：cgmcc no.40133。
8.本发明所述菌株在抑制尖孢镰刀菌fusarium oxysporum的应用。
9.本发明所述菌株在降低三七幼苗根腐病的应用。
10.本发明所述菌株在生产iaa的应用。
11.本发明所述菌株在生产ga3的应用。
12.本发明所述菌株在促进三七生长的应用。
13.本发明所述菌株在促进三七幼苗株高中的应用。
14.本发明所述菌株在促进三七幼苗叶长中的应用。
15.本发明所述菌株在促进三七幼苗鲜重中的应用。
16.与现有技术相比，本发明的至少具有以下有益效果之一：1、本发明在无菌条件下，采用分离纯化的内生菌，通过平板对峙试验筛选拮抗菌株，形态学及分子生物鉴定，单因素试验优选菌株发酵条件。2、通过盆栽试验验证了菌剂防治效果以及上述的各类应用。
附图说明
17.图1为本发明菌株sf-1的形态图(左)与显微观察图(右)。
18.图2为本发明中平板对峙试验图。
19.图3为本发明菌株sf-1的its序列同源性系统发育树图。
20.图4为本发明菌株sf-1(colletotrichum aeschynomenes)在各因素条件下的生长曲线图。(注：不同小写字母表示差异达0.05水平的显著性。)
具体实施方式
21.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
22.一种菌株,本发明述菌株为colletotrichum aeschynomenes sf-1，该菌株保藏于：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏日期为：2022年4月21日；保藏编号为：cgmcc no.40133。
23.本发明所述菌株在抑制尖孢镰刀菌fusarium oxysporum的应用。
24.本发明所述菌株在降低三七幼苗根腐病的应用。
25.本发明所述菌株在生产iaa的应用。
26.本发明所述菌株在生产ga3的应用。
27.本发明所述菌株在促进三七生长的应用。
28.本发明所述菌株在促进三七幼苗株高中的应用。
29.本发明所述菌株在促进三七幼苗叶长中的应用。
30.本发明所述菌株在促进三七幼苗鲜重中的应用。
31.实施例1
32.内生菌从云南三七样品的根、茎、叶中分离得到。根腐病致病菌尖孢镰刀菌fusarium oxysporum由实验室分离并保存菌株。供试三七种子由盛实百草药业有限公司提供。
33.试剂耗材：马铃薯200g，葡萄糖20g(国药集团化学试剂有限公司，批号20180327)，琼脂13g(国药集团化学试剂有限公司，批号20180722)。spin kit for soil试剂盒(mpbio公司，批号20200731)，真菌通用引物(北京擎天生物科技有限公司，批号20200824)，乳酸酚棉蓝染色液(福州飞净生物科技有限公司，批号20200526)。
34.试验仪器：dl-cj-1np
‑ⅱ
型无菌操作台(北京东联哈尔仪器制造有限公司)，fr-2l型三目荧光显微镜(北京世纪科信科学仪器有限公司)，2720型聚合酶链式反应仪(美国applied公司)，dyy-8c型电泳仪(北京六一仪器厂)，dh420型电热恒温培养箱(北京科伟永兴仪器有限公司)。
35.一、内生菌分离
36.利用纯培养法培养内生真菌。分离纯化方法如下：取新鲜健康的三七根、茎、叶，流水冲洗干净后表面消毒处理，用灭过菌的手术刀对组织进行切块，切成0.5cm大小接种于pda培养基，置25℃培养，待长出菌斑，将不同的菌落分别挑至pda培养基中，逐步分离纯化，直至得到纯化的单菌株。
37.二、根腐拮抗菌的筛选
38.采用平板对峙法筛选病原菌尖孢镰刀菌的拮抗菌株，用直径1.00cm打孔器取出尖孢镰刀菌菌饼转到新的pda培养基中，同时内生真菌培养在pda固体培养基距离中心2.50cm处的4个点，筛选具有拮抗作用的菌株。只接种尖孢镰刀菌菌丝块的pda平板作为对照。于28℃培养箱中培养5d，每个菌株3次重复，测定其培养皿中尖孢镰刀菌菌落直径，并计算抑菌率。抑菌率＝(对照菌落直径-处理菌落直径)/(对照菌落直径-菌饼直径)
×
100％。
39.三、拮抗功能菌的鉴定
40.挑取生长状况良好的菌丝、孢子制成临时装片，于显微镜下观察菌丝形态、孢子形状、孢子隔膜及隔膜数量等性状，并依据《真菌鉴定手册》进行形态鉴定。
41.spin kit for soil(mpbio)试剂盒提取内生真菌的总dna，使用真菌通用引物its1/its2扩增its2 rrna基因片段。测序结果与ncbi数据库中序列比对，利用blast在线工具进行同源比对分析，使用mega7.0软件构建系统发育树(图3)。
42.四、拮抗菌株适宜发酵条件筛选
43.单因素试验考察培养时间、摇瓶转速、温度及初始ph对菌株发酵的影响。活菌数用平板稀释涂布法统计，方法参考《微生物学实验》，每组3次重复。
44.五、生防菌剂效果验证
45.将灭菌的腐殖土装入塑料材质的育苗盘，筛选出芽一致且表面消毒的三七种子播于育苗盘。播种后浇无菌水，每天8h光照处理，保证三七正常出苗和生长。播种60d待三七出苗后，保留生长健康且大小一致的种苗组进行试验。试验共设3个处理。处理如下：
①
阴性对照组；
②
阳性对照组；
③
接生防菌+病原菌(生防菌接种2周后病原菌接种)。采取灌根法对三七进行接种，病原菌与生防菌调节浓度均为1
×
108cfu/ml，接种量为50μl，用移液枪沿根茎打到三七植株根部并每组浇灌无菌水10ml。接种28d后，统计不同处理下三七苗的生长及发病率，病情指数分级]。每组生物学重复36株三七幼苗。
46.发病率＝病株数/株数总和
×
100％
47.病情指数＝∑(病级株树
×
代表级数)/(株数总和
×
最高代表级值)
×
100
48.防治效果＝(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数
×
100％
49.六、结果
50.菌株形态和分子鉴定
51.内生菌sf-1培养期间生长较慢，28℃培养两天长出初白色菌丝，菌丝体较细呈絮状，菌落圆整，培养5d后，单菌丝在培养基上形成一个边缘整齐的灰白色圆形菌落，中心灰黑色(图1)。显微镜下，内生菌sf-1的大型分生孢子呈镰刀形或长柱型；分生孢子梗细长。参照《真菌鉴定手册》所列的真菌形态学特征对该菌株进行对比，初步鉴定为刺盘孢属(colletotrichum)。
52.菌株sf-1的its rrna基因序列为：
[0053][0054]
菌株sf-1序列经its序列比对后，与colletotrichum aeschynomenes icmp 17673(登录号nr_166015.1)的序列相似度为99.22％，且与其在系统发育树同一分支，结合菌体形态特征，鉴定菌株sf-1为colletotrichum aeschynomenes。
[0055]
拮抗根腐病作用
[0056]
通过平板对峙试验，发现菌株sf-1(colletotrichum aeschynomenes)对根腐病尖孢镰刀菌具有很强的抑菌活性，菌落直径1.40cm，抑菌率为73.33％(图2和表1)。
[0057]
表1菌株sf-1(colletotrichum aeschynomenes)抑菌率(％)
[0058][0059][0060]
促生作用
[0061]
对菌株sf-1(colletotrichum aeschynomenes)的iaa和ga3含量测定(表2)，菌株sf-1(colletotrichum aeschynomenes)发酵液iaa的产量为40.25mg
·
l-1
，ga3的产量为26.38mg
·
l-1
。
[0062]
表2菌株sf-1(colletotrichum aeschynomenes)发酵液产iaa和ga3的含量
[0063][0064]
发酵条件
[0065]
菌剂c.aeschynomenes的活菌数随着培养时间的增加而增加(24～72h)，当培养时间大于72h，活菌数增加缓慢，因此72h为其最适发酵时间(图4a)。菌剂的活菌数随温度的升高而增加(24～26℃)，当温度大于26℃，c.aeschynomenes菌剂活菌数趋于稳定而后数量减少，选取26℃为最适培养温度(图4b)。菌剂sf-1(colletotrichum aeschynomenes)的活菌
数随转速的增加而增加(0～120r
·
min-1
)，当转速大于120r
·
min-1
后，活菌数趋于稳定，故选取120r
·
min-1
为其最适摇瓶发酵转速(图4c)。菌剂的活菌数随ph的增加表现先增加后减少，当ph为6.5时，c.aeschynomenes活菌数数量达到最大值，因此选取6.5为其最适的初始发酵ph(图4d)。结果表明，c.aeschynomenes适宜的初始发酵条件为：72h，26℃，120r
·
min-1
，ph 6.5。
[0066]
菌株sf-1(colletotrichum aeschynomenes)在各因素条件下的生长曲线为：
[0067]
盆栽试验1
[0068]
接种c.aeschynomenes生防菌剂28d后，与阳性对照组(病菌组)相比，菌剂显著降低了三七幼苗根腐病的发病率(64.07％)和病情指数(56.31％)(表3)；与阴性对照组相比，显著促进了三七幼苗的株高(41.01％)、叶长(47.09％)和鲜重(47.06％)。
[0069]
表3菌剂对三七根腐病的防治及生长的影响
[0070][0071]
数据表明：本发明中分离的内生菌鉴定为colletotrichum aeschynomenes，该菌株具有抑制根腐病尖孢镰刀菌和促进植物生长的功能。菌株发酵条件为：72h，26℃，120r
·
min-1
，ph6.5，菌落直径为1.40cm，抑菌率为73.08％，iaa和ga3的产量分别为40.25mg/l和26.38mg/l。盆栽试验结果表明，接种c.aeschynomenes生防菌剂28d后，显著降低了三七幼苗根腐病的发病率(64.07％)和病情指数(56.31％)，且显著促进了三七幼苗的株高(41.01％)、叶长(47.09％)和鲜重(47.06％)。本发明中内生菌colletotrichum aeschynomenes可抑制根腐病尖孢镰刀菌和促进植物生长的作用，为药用植物根腐病的防治提供新的供选菌株，同时为药用植物微生物菌剂开发提供材料。
[0072]
尽管这里参照本发明的多个解释性实施例对本发明进行了描述，但是，应该理解，本领域技术人员可以设计出很多其他的修改和实施方式，这些修改和实施方式将落在本技术公开的原则范围和精神之内。更具体地说，在本技术公开、附图和权利要求的范围内，可以对主题组合布局的组成部件和/或布局进行多种变型和改进。除了对组成部件和/或布局进行的变形和改进外，对于本领域技术人员来说，其他的用途也将是明显的。