与黄瓜绿斑驳花叶病毒侵染相关的靶点基因集及其应用

1.本发明涉及作物抗病研究技术领域，尤其涉及与黄瓜绿斑驳花叶病毒侵染相关的靶点基因集及其应用。


背景技术：

2.西瓜是世界范围内广泛栽培和食用的园艺作物，具有很高的经济价值。西瓜生产受到各种非生物和生物胁迫的危害，其中包括许多植物病毒。黄瓜绿斑驳花叶病毒(cgmmv)作为我国重要的植物检疫对象，其侵染引起西瓜果实的血瓤病严重影响西瓜的经济价值和食用价值，带来巨大经济损失。然而，关于cgmmv侵染西瓜导致血瓤症状的机制尚不明确，现有技术中未见相关研究。


技术实现要素：

3.本发明的目的在于提供与黄瓜绿斑驳花叶病毒侵染相关的靶点基因集及其应用，以解决现有技术中相关研究空白的问题。
4.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
5.本发明提供了与黄瓜绿斑驳花叶病毒侵染相关的靶点基因集，所述靶点基因集包括nip5；1、rap2-3、myb6、wrky12、h2a、xth23、pe/pei7、dnaj11、atps1、adc、pp2c73、cml48、sabp2、dir1、nimin-1、nac2、akr1、pdc1、sweet4、spds、sbt和tubb1；
6.所述nip5；1的核苷酸序列如seq id no.1所示；
7.所述rap2-3的核苷酸序列如seq id no.2所示；
8.所述myb6的核苷酸序列如seq id no.3所示；
9.所述wrky12的核苷酸序列如seq id no.4所示；
10.所述h2a的核苷酸序列如seq id no.5所示；
11.所述xth23的核苷酸序列如seq id no.6所示；
12.所述pe/pei7的核苷酸序列如seq id no.7所示；
13.所述dnaj11的核苷酸序列如seq id no.8所示；
14.所述atps1的核苷酸序列如seq id no.9所示；
15.所述adc的核苷酸序列如seq id no.10所示；
16.所述pp2c73的核苷酸序列如seq id no.11所示；
17.所述cml48的核苷酸序列如seq id no.12所示；
18.所述sabp2的核苷酸序列如seq id no.13所示；
19.所述dir1的核苷酸序列如seq id no.14所示；
20.所述nimin-1的核苷酸序列如seq id no.15所示；
21.所述nac2的核苷酸序列如seq id no.16所示；
22.所述akr1的核苷酸序列如seq id no.17所示；
23.所述pdc1的核苷酸序列如seq id no.18所示；
24.所述sweet4的核苷酸序列如seq id no.19所示；
25.所述spds的核苷酸序列如seq id no.20所示；
26.所述sbt的核苷酸序列如seq id no.21所示；
27.所述tubb1的核苷酸序列如seq id no.22所示。
28.本发明还提供了与黄瓜绿斑驳花叶病毒侵染相关的靶点基因集的应用，通过沉默spds、sbt和/或tubb1来提高作物对黄瓜绿斑驳花叶病毒的抗性。
29.优选的，所述沉默spds、sbt和/或tubb1的方法包括以下步骤：
30.将spds、sbt和/或tubb1克隆至vigs基因沉默载体中，得到重组载体；
31.将所得重组载体转化至根癌农杆菌中；
32.将根癌农杆菌接种至作物，实现基因沉默。
33.优选的，所述vigs基因沉默载体为pv190载体或trv载体。
34.优选的，所述接种采用叶片浸润法。
35.本发明还提供了与黄瓜绿斑驳花叶病毒侵染相关的靶点基因集的应用，通过过表达nip5；1、rap2-3、myb6、wrky12、h2a、xth23、pe/pei7、dnaj11、atps1、adc、pp2c73、cml48、sabp2、dir1、nimin-1、nac2、akr1、pdc1和/或sweet4来提高作物对黄瓜绿斑驳花叶病毒的抗性。
36.优选的，所述作物为葫芦科作物或茄科作物。
37.优选的，所述作物为西瓜或本生烟。
38.本发明的技术效果和优点：
39.本发明提供了22个与黄瓜绿斑驳花叶病毒侵染相关的靶点基因。本发明通过基于cgmmv的病毒诱导的基因沉默(vigs)pv190载体，沉默了上述基因在西瓜植株中的表达，证实了其在cgmmv侵染中的功能。本发明还利用trv沉默载体在本生烟上对12个上述西瓜基因的本生烟同源基因进行验证，与西瓜基因验证结果一致，为防控黄瓜绿斑驳花叶病毒提供依据和有效防控方法，具有重要理论和实践意义。
附图说明
40.图1为pv190载体沉默不同基因的西瓜果实中在45dpi的血瓤症状；
41.图2为qrt-pcr检测vigs处理后西瓜果实中单个基因的沉默效率；
42.图3为基因沉默西瓜植株在45dpi时果实中cgmmv rna和cp的积累
①
；
43.图4为基因沉默西瓜植株在45dpi时果实中cgmmv rna和cp的积累
②
；
44.图5为基因沉默西瓜植株在45dpi时果实中cgmmv rna和cp的积累
③
；
45.图6为基因沉默西瓜植株在45dpi时果实中cgmmv rna和cp的积累
④
；
46.图7为trv载体沉默不同基因的本生烟叶片在45dpi的花叶症状；
47.图8为qrt-pcr检测vigs处理后本生烟叶片中单个基因的沉默效率；c：
48.图9为qrt-pcr分析不同基因沉默本生烟在45dpi时叶片中cgmmv rna和cp的积累。
具体实施方式
49.下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
50.实施例1西瓜果实中pv190-vigs对22个基因的抗/感病作用鉴定
51.利用基于cgmmv的vigs载体(pv190)，分析22个基因在西瓜植株被cgmmv侵染过程中的功能。
52.分别为：
53.多胺和植物激素途径：adc，核苷酸序列：atgccggccctagcttattgcgtggacgctgctgtagctcctcctcctggctacgcttttgctggggatagctctcttccgtcgccggtcttattttccggcggacctccggagactaccatcttcacctctccagactcttctcccacctctgaaaatttgtcttggtctccttctctttcttcttccctttacaaggttgacggatggggtgctccttatttctctgtcaatggttctgggaatatggctgttcgtccttatgggacagctactttgccccatcaggagattgatttgctcaaaattgtgaagaaggcttcagatccgatttgctctggcggtctcggcttgcagcttcctcttattgtgcgctttcccgatgtgcttaagaatcgccttgaatctctccagtcggcatttgattacgctattcaatctcagggatatggttctcattaccagggtgtttatccggtcaaatgtaaccaggacaggtttgttgttgaagatatcgtgaaattcggatctcctttccgttttggtcttgaagctgggtcgaaaccggagcttctcctggcaatgagctgtttgtgcaaagggaattcagatgcgcttttggtttgcaatggtttcaaggatgcggagtacatttctttggctcttattgccaggaagctttctctgaacacggtgattgttctcgaacaagaggaagaacttgatttggttattgatttgagcaagaggctctttgttcgtcctgtggttggcatgcgtgcgaagctgagaaccaaacattctggacattttggttctacctctggcgagaaagggaagtttggtcttacgaccacccagattcttcgggtggtaaggaagcttgaacaggccgatatgcttgattgccttcaattgctacattttcacattggatcccagatcccttccactgccctgctcgccgatggtgttggtgaggctgctcagatctattgtgaattggtccgtcttggtgccaacatgcgagttgtcgacattggaggtggtctgggtattgactatgacgggtcgaagtcttcggactctgagttatctgttgcttatggactcgaagagtatgcctctgcggttgttaatgcagtccgctgtgtatgcgaccgtaagtccgtgaagcacccaataatttgcagtgaaagtggccgagcaatcgtctctcatcactctgtcctgatattcgaggccgtttctgctagcagttatgaggccccatccatgagctcgcttgaacttcagtatcttgttgatgggctaacggacgatgctcgcatagattatcagaacctttcggctgcagcttatatgggtgagtataagacatgcttgttgtatgcagaccaattgaaacaacgctgcgttgagaaattcaaggatgggtgtttgggaatggaacaactagctgccgtggatggactttgtgctctcgtttcaaaggctgttggagagttggactctgtaaggacttaccatgtgaacctctctgttttcacatcaatcccagatttctggggtatcgaccagctgtttcctattgtccccattcatcgtcttgatcagagaccatcagtgagaggcgtgctgtctgatcttacctgtgacagtgatggtaagattgataagttcatcggtggtgagtcgagtttgccgttgcatgagctggaaggcaacggcaatttgtcaggtggaggaggtgggcgatactatcttgggatgtttctgggcggggcttatgaggaggctctcggtggtgttcacaacctgtttggtggcccaagtgtggttcgggtgatgcagagtgatggaccgcatagctttgcggtgactcgcactgtgcctgggccatcatgtggggatgtcctccgagtgatgcagcacgagcccgaactcatgttcgagaccctcaagcaccgagccgaagagtttgggcaggaggatgatgatggtggcgagggcatagccaatagcttggccatgtccttccggaacatgccttatttggctagcgcatcttcctgctgcagtgagactgattacaatggtgctgtggattctggtgctggcgatgccgagcagtggacttactgttatgcttga，如seq id no.10所示、pp2c73，核苷酸序列：atggtgcttttcccggaagtcattgaagaaatggtaagaaatatgtcgataaagaaaaagaataatgaagatgatggcggtaaagaagggggtcgagaagtaatgagtaaagagggaaaaagaaaaaaatccatgatttgtttatctggaagtgttaaaaccaccaagttcgatgatatggcttctgtttgctccaagagaggaaataaaggaattaatcaggattcgctcgttgtttgggaggattatggcaaccgaggagatgtagttttatgtggaatgtttgatgggcatgggccttggggccacatgattagcaaacaagtcagaaagtcactaccttctcaattacttaccaattggcaacaaaacctttccatgcaaaccgaccaaaaccatctctttcctttcaacctatggaagcaatc
ttgcttaaaaacttatgccgccattgatgaagagctcaagcaacaccctcgcattgattctttttacagtggcaccaccgctttaaccctcgttaaacaggggcgacaccttgttgttgcaaatgctggcgattcacgggctgtgttggcggtaacttctggtgatggctgcttgaaaccaattcaactctccgttgatttccgacctaatttgcctgaggaagctgaaagaataaaacaatcgaaagggagagtggtatgtttaaaagatgaacctggggtttatagggtgtggactcccgattcaaggactccaggattggcaatttctagagcttttggcgattattgcaccaaacagtatggtctcatttctgtgcctgatgtaagccatcgaatcatcactacttcagatcaatttgtcattgtcgccaccgatggggtatgggacgtcatgtcgaatcaagaagcggttcacatagtttcttcaacaccaaatagggaaatgtcggccaaaaggctagtggattgtgctgcacgtgcatggaaatcaaagaaacgagggtttgcaagggacgacatgtcggccatttgcctctttttacatgcttcacccgcagaaaatgattga，如seq id no.11所示、spds，核苷酸序列：atggctgcggaatattccgtcgagtcggcggccgatgcggcggcgaagaaacctgagattgagaatggggtttccgcctcacaccccgattgtatttcctctgtaattcctggatggttttctgaaattagcccaatgtggcctggagaggctcactccttgaaggtggagaaggttttgtttcaagggaagtctgattaccagaacgttttggtctttcagtcatcaacttatgggaaggttctggttttggatggggtgattcagcttactgagagagatgaatgtgcttaccaagagatgatcacccacctcccactttgctcaattccaaaccccaaaaaggttctagttattggtggaggagatggcggtgtcttacgagaggtggctcgtcattcatctgttgagcagatagatatctgtgaaattgacaagatggtagttgacgtttccaaagaatttttccctcgcgtagctgttgggtatgaggatcctcgcgtcactcttcatgttggtgatggcgttgcatttctgaaggctgttcctgaaggcacttatgatgcaattatagtggattcttctgatcctattggtcctgcacaagagctttttgagaagcctttttttgcttcagttgccaaagctcttcgacctggaggtgttgtgtgtactcaggcagagagcatctggcttcacatgcatatcattgaagatattgttacaaactgccgccaaatattcaaaggctctgtcaactatgcatggactacagttcctacatatccaagtggagtgattgggtttatgctctgctcaactgagggaccttctgttgatttcaagcatccagtcaacccagtagaggtgaacggcatcgacaccgcgaagagtccgctcaagttttacaactccgagattcattcagcagctttctgtttgccttcttttgcgaagaagattattgattcaaaatga，如seq id no.20所示，rap2-3，核苷酸序列：atgtgcggtggtgccatcatctctgatttcattgaaagaaagcgaactcggaaacttagcaatgaatctctctggtcccacatcgaccctttctccgacctcctcggcctcaattattcccctgtgaaaagcgagaagcctaagaaaagagatcgagctacggcggcggtggcggtggagaagactccaaaagctcggaagaatttgtacagaggaatccggcaacggccgtggggaaaatgggcggcggagatccgggacccacgtaaaggagttcgtgtttggctcggcactttcaacaccgccgaggaagccgccagagcctacgatgaagcagccaaacggatccgaggagaaaaggccaagctcaactttgctccggcgccgccgtcttcgccgccgttaccggcggctcagcctcattccccggcgaaaaagcggtgcgttctccccgagttgactcggggtggctcaaacgccaccggtccgcctccgtgcagacgtgtggataactcgtgtgacagcgacgagttctactacggcgaggaattagcgagtttgagatccttcttgggattggatagcgaggagcaacaggcgagtcaattcggtggaaatggcgagtttgagcgagttgatgtagacctttggatgatggacgacatgtcgttgaatgagcagaagttgagtcagctggtgtaa，如seq id no.2所示；
54.免疫抗性途径：cml48，核苷酸序列：atggcgtctttctttgctagattcacttcctattccaattccagttccaattcgaattccaattccaattctaattcccatgctccatctgcaccctccgctccatcggcaccggaaacacaaggccatgaacattctcatggaaatgcttccctgtattactcggaacagcatcggccgcagccttatgggtctaattatggtggggtttcttcatatgggtcttatggttttcctccggggaccagccctgaggtaattaggagctttcaaatggtggatagggatggaagtggattcatcgatgaaaatgaattgcagcaagccctttcttctggctaccagaggtttagtcttaggaccgttcgtttgctcattttcttgttcagaaatccggttgattcctccagaatggggcctaatgagtttactgctttgtggaactgtcttggccaatggcgtggcatgtttgagagatatgatagagatagaag
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atggacccaatggaatgtcagtgacgaacttggcgccgtgggttacgacggttggagcaggtacgatcgatcggaatttcccggcggtggtgactctgggaaacggacgaaagatttccggggtatcgctctacgctggagcgccgttgaacggtacaatgtatccattggtttaccctgggaaatcaggagtgctctctgtttcgctctgtatggagaattcgctcgatcctaaggctgttgccggaaaaattgtgatctgcgacaggggaagtaatcccagagtggctaagggtttggtcgtgaagaaagccggcggcgtcggaatgattctagcaaacggaatctcaaacggcgaaggactcgtcggcgatgctcatcttcttcccgcctgcgcagttggctccgacgaaggcgatgccatgaaagcctacgcatcgtcctccgcaaatcccaccgccaccatcgccttccaaggcactataatcggaatcaaaccggcgccagttgtggcttcgttttccgccagagggccaaacggattaaacccagaaattctaaaaccagacttaatcgcaccaggggttaacattctcgccgcctggaccgacgccgttggtccaaccggtttggacttcgatacacgaaaaacagagttcaacatcttgtccggtacatcaatggcttgcccccatgtaagtggagctgctgctctgttgaaatcagctcacccagattggagtccagcagcgttaagatccgccatgatgaccaccgcaagtattaccgataatcgccgccaaccaatgacggaagaatccaccggaaaagcttcaacgccttacgatttcggtgccggacatgtaaatttggggctcgcaatggacccaggtctggtctacgacattacgaacgccgattacataaacttcttatgctcaatcgggtacggaccgaagatgattcaggtaataacaagaaaacccgtgacatgtccggcgaaaaaaccattaccggaaaatctcaattacccatcaatcgtagcagtattttctagtctatcaaaagggtggtcgacgaagtcgtttatccgaacggcgacgaacgtgggtccatcaaattcagtgtacagagctaaaatcgaagctccaaagggggttacagtgaaggtaaaaccatcgaaactggtattttcatcgacggtgaagaaacagagcttcgtagtggcaatatcagccgacaatcagaatctggctctgggcgatgtgggcgctgtttttggttggctttcttggtccgatggaaaacatgtggttcgtagcccactggtggtgacccaattagagcctttgtaa，如seq id no.21所示；
55.细胞壁和细胞膜功能：xth23，核苷酸序列：atgcaaatcaagctcgttcctggcaactctgccggcactgtcactgcctactacttgcgctcagaagggtcagcttgggatgaaattgatttcgagtttttgggtaatctgagcggccaaccttacactgttcacaccaatgtattcagccaaggaaagggaaacagagagcaacagtttcatctctggttcgacccaactgccgatttccacacctattcaattctctggaatcctcagcgcattgtcttctacgtggacgggacacccatcagagagttcaagaacaaggaatcaatcggcgttgcattccccaaaaatcaaccgatgaggcttcaatccagtctatggaacgccgatgactgggcaaccagaggtgggttagtgaagaccgattggtctcaagctccgttcaccgcatcttacagaaacttcaatgaaaacgcttgcatttggtcatcgggacagtcatcctgtggctcgaattcctcgccgacctccgacgacaagtcgtggtattctcaggagcttgattccgacagccaaggaaagctgaagtgggtacaaaacaactacatgatctataattactgcaccgatgctaaccgatttcctcagggtctgcctcccgaatgcaatgccactgcctga，如seq id no.6所示、pe/pei7，核苷酸序列：atggctgccagaacaaccaccgccgccgccttctactttctcatcctcatttccctttacatttccacttccgccgcccccaccggttcagtatgcagctcgactcgagacccatcctactgcaaatcggttctcccgaatcaaaccggcaatgtctactcgtacggacggtcgtcgttcagaaagtcactgtcgtcgtcgcagaaattcctccggctggtggagaaatacctcaggtcccgatcgtcgctgacagtgccggcggtgagggcgctggaggactgccagctgctggcgggactgaacattgattacttaacgacgtcgttccgggcggtgaactcgacgagcagaacgttgccggagatgaaggcggacgacgtgcagagtctgctgagtgcgatattgacgaatcaacagacttgtttggatggaattaaggcgacggcgggttcttggtcgctcaaaaatggcctttctctcccacttgctgctgacaccaagctctactctctgtccttggccttctttaccaaaggttgggttccaaagaagaagaaaaaaccgacatggaaagccgccggaagacaaggggggttcagaaatgggcgaatgtcactcaaaatgtccagccgaaccaaagcgatctacgagacggcgacccgccggaatctgttgcagatcgatgacggcggcgacgaccagattgcggtcagggacatcgtcgttgtcagtcaagacggcagcggaaatttcaccaccatcaatgaggcgattgcggcggcgc
cgaacaactctgctccgtccgacgggtatttcttaatcttcgtgtcggccggaatttatgaagaatatgtgtcgattgcgaagaacaagaggtacttgatgatgatcggagatggcattaatcagaccgtcgtcaccggtaatcggagtgtcgttgacggctggaccaccttcaattccgccacgtttgcggtggtcggacctggattcgtagcagtaaacatgacattcagaaacaccgccggcgccataaagcatcaagccgtagccgtccggaatggcgccgacttatcaacattctacctctgcagcttcgaagcctaccaagacaccttatacacccattccctccgccaattctaccgcgactgcgacatctacggcaccgtcgacttcatcttcggcaacgccgccgtcgtcttccagaactgcaacatttacccacgcctcccgatgtccaaccagttcaacgccatcaccgcccagggccggaccgacccaaatcagaacaccggcacctccatctacaactgccgaatcacggcagccgacgatctggccaacaacagcggcgccggcgtcaagacgttcctagggcggccgtggaaggaatactcaaggacggtttatatgcagagctttatggatgatttgattgatccggagggatggagggcttggaatggggattttgctttgaacacttcgtattatgctgaatttgggaattttgggccgggatctaacacatcggagagggttaattggccgggatttcatttgattaatgataccgatgctggcaatttcacggcggggaattttgtgttggccgacgattggctgccgcagaccggcgttccctataccagcggcctcacggactag，如seq id no.7所示、tubb1，核苷酸序列：atgcgtgagattcttcacatccaaggtggccaatgtggcaaccagatcggtgctaagttctgggaagtggtttgtgcagagcacggcatcgaccccatcggtaagtatactggtgattccgatctacaacttgaccggattaatgtatactacaatgaagctagttgcggccgatttgtccctcgtgctgtgcttatggatctcgagcctggtgttatggatagtatcagatctggaccttacggtcaggtttttagacctgataacttcgtttttggtcagtctggtgctggaaacaactgggctaaaggtcattacaccgaaggtgccgagcttattgattctgttcttgatgttgttcgtaaggaggctgagaactgtgactgcctgcaagggtttcaggtgtgccattctttgggaggaggaaccggatctggaatgggaactcttctgatttccaagatcagagaagaataccctgatagaatgatgcttacgttctccgttttcccatctcctaaagtttctgatactgttgttgagccttacaacgcaaccctctctgttcatcagcttgttgaaaacgccgatgagtgtatggtgcttgataacgaggctctttacgatatttgcttccgcaccttgaagctgtccactccaagcttcggtgatcttaaccatctgatttctgctacaatgtccggtgtgacctgttgtttgcgattcccgggacagctcaactcagatcttaggaagcttgccgtcaatcttatcccctttcctcgtctacactttttcatggtgggttttgctccgctcacttcccgtggatcccagcaatacagagctcttacagtacccgagctcactcagcaaatgtgggatgctaagaatatgatgtgtgctgctgatccccgacatggtcgctatcttactgcctctgctatgtttaggggtaagatgagcaccaaggaagttgatgaacagatgatcaatgttcagaacaagaactcttcatacttcgtcgaatggatccccaacaatgtgaaatcgacagtctgtgacattcctccaactgggttgaaaatggcctcaactttccttggaaattcaacatcaatccaggagatgtttcgccgtgttagtgagcagtttactgctatgtttaggaggaaggctttcttgcattggtacacaggggagggtatggatgagatggagtttactgaggctgaaagcaatatgaatgatctggtttctgagtatcagcaataccaagatgctacggccgaagatgaagaatactacgaagatgaagatggtgtggaacatgacgaataa，如seq id no.22所示、nip5；1，核苷酸序列：atgccggaatcggatagtggaacgccggtagcatcggcgccggcgacgccggggacgccgggagggccgctgttttccggcctccgagtggattctctatcgtacgatcggaagtcaatgccgcggtgtaagtgcttgcccgtgaatgctcccacgtggggccaacctcacacgtgctttactgacttccctgctcctgatgtctctctcacccgcaagctgggagcagaatttgtgggaacattcatcttgatatttgctgcgacggcagggcccattgtcaaccaaaagtacaacggcgtcgagactctgatcggcaacgccgcgtgcgccggcctggcggtgatgatcgtaattctgtcaacgggacacatttccggcgcccatctgaacccgtcgctcaccattgcttttgcggccctccgccacttcccttgggttcaagttccggcctacatcgccgcccaggtctctgcctccatttgcgcctccttcgctctcaaaggtgttttccaccccttcatgtccggtggcgtcaccgtcccctctgtcagcactggccaagccttcgctcttgaatttatcatcactttcaatctcttgtttgtcgtcactgcggtcgccactgatactcgcgcggttggagagttggctggaattgca
gtcggagctacagtgatgcttaacattcttgtcgctgggccctcaagcggtggttcgatgaacccagttcgaactttgggccccgccgtggctgccggaaattacagagcattatgggtgtatctggtggcgccgacgctaggggcaatactcggtgccggaacttacactgccgttaagctgagagacgacgaagtggatgctccgtcgcaggtaaggagcttccggcgttga，如seq id no.1所示、sweet4，核苷酸序列：atggtttctgcagatgccattcgtacaattcttggaatcattggaaatgtcatctctctcttcttgtttctctccccagtacccacgtttattcaaatatggaagaagagatcagtggagcagtattcgccagtaccatatttggcgacgctgataaactgcatgatgtggacgttgtacgggctgccgatggtgcatccgggtagcctacttgtcgtgacgatcaacggatccggagtcgtaatcgagctcgtgtacattatattgttcttgatttatgccgatggaaagaagaagcggttgaaagtgttgttggtgatgttggttgaagtcatcttcgtggctctcttagcccttttggttctcaccttggctcatacctttcgccgtcgctccgctatcgttggcaccgtttgtattctctttaacatcatgatgtatgcttcacccttgaccgtcatgaaactggtgattaagacaaaaagcgtggaatatatgccgttttttctatcctttgcttcgttagccaacggcgtcgtttggactgcttacgcttgcatccgtttcgaccccttcatcacagtccccaacggcctcgggacattgtcggctctcgttcagcttattctctacgccaccttttacaaatctactcagcgccaaatcgccgaaagaaaagcccaaattcgtctctctgaagtcgtcgtcaacggcggctctctgccggacaagaccgccaacggcggagctgcaaccacccctgtttcagagaccacgcccacccgcaaggtttga，如seq id no.19所示；
56.能量和次级代谢：atps1，核苷酸序列：atggcgtccatggcgactcgtttcaccaaaaccccatccccatttcattctattcaaagaacttcttacacccatttgggcgctccgattaaagtctccattgctagctctaagtcgaagaagacccatctccgcctccgggtttccgccggtttgatccaaccggacggcggaaggctggtggagcttctagttgaggagcctctgaggggtctgaagaagaaggaagccttatccttgccaaggatcgagctttctagcatcgatattcaatgggttcatgtgctcagcgaaggatgggccagccctcttaccggattcatgagagaatccgagttcctccaaacgcttcatttcaattccctcaggcttccagatgggtctgtggcgaacatgtcagtccccattgttctggccattgacgatgcccaaaagcaccacatcggtgactccaccagtgtggctctctttgactccaagaacaaccccatcgctattctcaaagatatcgagatctacaagcaccctaaagaagaaaggattgctagaacgtggggcaccactgccccggggctcccttatgttgatcaagctataaccaatgctggtaactggctgataggaggcgacttagaggttatagagccaatcaagtacaatgatggccttgaccgttttcgacagtcacctgcagagctacgggaggaatttacccggcgaaatgcagatgcagtgtttgcatttcaacttcgaaacccagtacataacgggcatgcattactaatgactgatacccgccgtcgactgctcgagatgggatacaagaaccccattttgttgcttcatcctttgggtggctacaccaaggcagacgatgttccacttagttggcgaatgaagcaacatgagaaggtactcgaggatggtgttcttgatccagagacaacagtcgtctccatatttccctctccaatgcattatgcagggccaactgaggtgcagtggcatgcaaaggcaagaattaatgcaggagccaacttttacattgttggacgggacccagctggaatgggtcatcctactgagaaaagggatttatatgatgctgaccatgggaaaaaagtgttgagcatggcacctggactagagcggctaaacatccttcctttcagagttgctgcttatgataaaactcagggcaaaatggccttcttcgacccctctagagctcaggatttccttttcatatctggcaccaagatgagaacactagcgaagaataaagagaatccaccagaagggtttatgtgcccaggtggatggaaggtgttggttgaatattatgatagcttggtacctgcaagcagtggcagacttcctgaacctgaagctgttctggcgtag，如seq id no.9所示、dnaj11，核苷酸序列：atggcttcctcttttctcacttccttcacccactcctctcaccggccaaccgccgcctgcccctccgttcagaggccgaatccggcggtggtagcctcagcggccgggctgcgattcgggcgcgagttatcggttgggcgttcctcgttttacgaggtgcttgggattccgatgacagcttcttgccgggaaatcaaggcggcttaccgcaaactagcgagaacttgtcatccagacgtggtggcggagaattcggcggaggagtttattaagattcaggcggcgtatttgacattgtcggatccggataaaagggcggattacgacagggagatttacaaagc
tcaattggtttcggtttcggtttcgggtttgtcgtctcggacgggggtttcgagttattccggttactgtacacggcggaattgggaatccgatcaatgttggtaa，如seq id no.8所示、akr1，核苷酸序列：atggcagaggggcaaggagttcagattcccagggtgcaactaggaagtcagggacttgaggtctcaaaattgggatttggatgtatgggcttaactggtgtctacaattcttgtgtatctgatgaagatggtatctcaatactaaaggaagctttcaataggggaatcacttttttcgattcagccgacgtatatggacctcattctaatgaaatcctggttggaaaggcgctgaaacagttaccaagagaaaaggttcagattgccactaagtttgggattacaaggattggaagttctatgacagtgaatggaaccccagagtatgtgcggtcatgttgtgaggctagcttgaaacgccttgatatagattacatcgatctatattatcaacatcgcactgatacatcaatacccatagaagaaactatgagtgaactgaaaaaacttgtgcaagagggaaagatcaaatatataggtttatctgaagctagtccagacaccataaagagggcacatgcagttcatcctattacagcactacagatggaatggtccatctggacacgtgacatcgaggaggagattattcctctttgcagagagctaggcataggcatcgttccttacagccctcttggtcgaggcttctttgctggtaaagcagttgtggaaagtttacctgttggcagtcacttggctacacatcctcgatttgttgaagaaaacttggagaagaacaagcacttttacaaacgaatagagaagcttgctgaaaagcaccattgctctcctgctcaacttgcccttgcatgggttctcgagcaaggagatgatgttgttccaattccaggcacaaccaagataaagaatttggatgagaacattggttcattgagagtgaggctcaacaaagacgacctgaacgaaatttctgaggctgtacccgaaagcgaggtagctggaaatagaacttatgatagcatgactcatgcaacatggaaatatgctaccacaccccaaaagtga，如seq id no.17所示。
57.碳循环：pdc1，核苷酸序列：atggaatctgctaattcaattggctctggggttcctcccacttcagttccagtgccggtggctcccaatgcctcaagcggcacgctcggcagtcacctcgctcggcggctcgtcgagattggagtcagggatgtgttctctgttcctggggatttcaatttgacccttttggatcacttgatctccgagccccaactgaacttgatcggctgctgcaacgagctcaacgccggctacgccgccgacggctatgctcgagccaagggcgtgggtgcctgtgtggtcactttcaccgttggtgggcttagcgtgttgaacgctattgctggtgcttacagtgagaatttgcctgtgatttgcattgtgggtggcccaaattccaacgattatggcactaacaggatcttgcatcatacaattggacttcctgatttcacccaagagcttcgatgttttcaaacagtcacctgttaccaagcgattgtgaatgatttggatggtgcgcacgagttgatggacactgcaatttcaactgctttaaaggagagcaaaccagtttatatcagcataagttgcaatcttcctggaatttctcatccaacttttgctagagatcctgttcccttctttcttgctccaaaaataagcaaccaatgggggttggaagcagcagttgaagcaactgcaagttttctgaacaatgcagtgaagccagtgattgtggggggtcccaagctaagagtggcaaaggcacaacgagcctttgtcgagctcgccgatgcaagtggatatccgatcgccgttatgccgtccggaaaagggctggtgccagagcatcatccacagttcatagggacgtattggggcgctgtcagcaccagcttctgtggagagatagttgaatcagctgatgcttatgtcttcgttgggcctattttcaatgattacagctctgttgggtactctttgcttgtcaaaaaggagaaagctgtgatggtgaatgtgaaccgtgtgaccatcggcaatgggccatcctttggctgggttttcatggctgattttctatctgcattggccaaaaggttgaagaaaaaccccactgctcttgagaatcatcgccgaatttacgtccctcctggtatgcctctcaactatgcagaggacgaacctttacgagtcaatgttctcttcaaacatattcagcaaatgttgtctggtgacactgcggtaattgctgaaactggtgattcatggttcaactgtcagaagctttgtcttcctgaaaattgcggctatgaattccaaatgcaatatggatctattggatggtcagttggagccactttgggatatgctcaggccactaaagataagcgtataatcgcctgtattggtgatgggagtttccaggttacggctcaagatatttcaacaatgattagatgtgggcaaaggaccatcatcttcctcatcaacaatggcggatatacaattgaagtagagattcatgatggtccatacaatgttatcaagaactggaattatactggattggttgatgccatccacaatggtgaaggaaagtgctggactatcaaggtacgaacagaacaagaattaatagaagcaattgcgacggcgagcgatgaacacaaagaatctttgtgtttcatcgaagttttggtgcacaaagatgacacgagcaaagaactactag
aatggggatctcgtgtggcttctgccaatggtcgccctcccaatcctcaataa，如seq id no.18所示；
58.使用基因特异性引物扩增出22个选定基因的部分序列(约260bp片段)，引物序列如表1所示：
59.表1西瓜基因片段扩增引物信息
60.61.62.63.[0064][0065]
用限制性内切酶bamhⅰ(takara，大连，中国)单酶切pv190载体，使用clonexpress ii一步克隆试剂盒(vazyme，南京，中国)将pcr产物单独克隆到载体中。构建的质粒分别转化到根癌农杆菌gv3101菌株(上海唯地生物技术有限公司，上海，中国)中，用含有卡那和利福平的液体lb培养基培养，并用浸润缓冲液稀释至od
600
＝1.0。在12叶期西瓜植株(大约在结实前一周)的下位叶4片真叶上浸润连有特异性基因片段vigs载体的农杆菌菌液。以携带pv190 vigs空载体、携带266bp gfp基因片段的pv190-gfp载体和携带300bp西瓜pds基因片段的pv190-pds载体浸润后的植株作为对照。在45dpi采集果实样品，分析基因沉默效率和cgmmv积累量，pv190载体沉默不同基因的西瓜果实中在45dpi的血瓤症状如图1所示，qrt-pcr检测vigs处理后西瓜果实中单个基因的沉默效率如图2所示。
[0066]
northernblot和westernblot分析不用基因沉默西瓜植株在45dpi时果实中cgmmv rna和cp的积累，方法如下：
[0067]
northernblot检测西瓜果实中cgmmv病毒积累量，从9个西瓜混合样品中提取总rna，rna样本在含5％甲醛的1.5％变性琼脂糖凝胶中分离。rna通过毛细管作用被转移到n
+
尼龙膜(amersham，弗莱堡，德国)，用dignorthern starterkit(roche，曼海姆，德国)合成的地高辛标记的rna探针与n+尼龙膜杂交，加入cdp-star(roche)显色液显色，使用tanon 5200化学发光成像系统(tanon，上海，中国)对标记信号进行可视化成像；western blot检测中，使用植物蛋白提取试剂盒(takara，上海，中国)从上述样品中提取总蛋白，使用bicinchoninic acid(bca)protein assay kit(takara)进行定量，然后用12％的sds-page凝胶电泳分离。将分离的蛋白转移到0.20μm聚偏氟乙烯(pvdf)膜(millipore，比勒利卡，美国)。聚偏氟乙烯膜用牛血清白蛋白封闭，之后在1/4000稀释cgmmv cp单克隆抗体溶液中孵育2h，1/5000稀释山羊抗小鼠碱性磷酸酶抗体(sigma
–
aldrich，圣路易斯，美国)中孵育1h，加入cdp-star(roche)显色液显色，使用tanon 5200化学发光成像系统(tanon，上海，中国)对标记信号进行可视化成像，结果如图3～6所示。
[0068]
由结果可知，西瓜中pds沉默导致西瓜果肉白化，qrt-pcr分析得基因沉默效率在40～92％之间。其中，沉默nip5；1、rap2-3、myb6、wrky12、h2a、xth23、pe/pei7、dnaj11和atps1会造成西瓜血瓤症状极为严重，且有大量cgmmv积累，而沉默adc、pp2c73、cml48、sabp2、dir1、nimin-1、nac2、akr1、pdc1和sweet4也会加重西瓜血瓤症状，且积累了较多的cgmmv。此外，与pv190和pv190-gfp处理的西瓜相比，沉默spds、sbt和tubb1没有引起西瓜果实的血瓤症状，且果实中积累cgmmv较少。据此可推断spds、sbt和tubb1参与了cgmmv侵染和血瓤症状的形成，而nip5；1、rap2-3、myb6、wrky12、h2a、xth23、pe/pei7、dnaj11、atps1、
adc、pp2c73、cml48、sabp2、dir1、nimin-1、nac2、akr1、pdc1和sweet4可能参与了西瓜抗cgmmv侵染的过程。
[0069]
实施例2本生烟中trv-vigs对12个西瓜同源基因的抗/感病作用验证
[0070]
选择上述西瓜基因同源的12个本生烟基因：rap2-3、myb48、wrky11、xth28、adc、cml36、nac2、h2a和atps1、spds、tub和dnaj20，用基于trv-vigs载体进行沉默。利用primemax dna聚合酶(takara)和特异性引物，从本生烟的cdna中分别扩增出12个基因的部分序列，片段长度约330bp，引物信息如下表2所示：
[0071]
表2本生烟基因片段扩增引物信息
[0072]
[0073]
[0074][0075]
pcr产物经bamh i和xho i酶(takara)切后分别克隆到ptrv2质粒中。这些新构建的连接基因片段的ptrv2质粒和ptrv1质粒分别转化到根癌农杆菌gv3101菌株中。携带ptrv1的农杆菌与等量携带基因片段新质粒的农杆菌混合繁殖后，稀释至od
600
＝0.5。将这些混合菌液浸润到9-10叶期的本生烟植株的叶片中。浸润10天后，用cgmmv粗提液摩擦接种未浸润的本生烟上位叶。以含有311bp gfp基因部分序列的ptrv2片段的农杆菌浸润植株作为对照。
[0076]
接种cgmmv 9天后对本生烟植株进行症状监测和叶片采样，trv载体沉默不同基因的本生烟叶片在45dpi的花叶症状如图7所示。
[0077]
用qrt-pcr法检测基因沉默效率和cgmmv积累量，结果如图8～9所示。检测基因和病毒特异性引物如下表3所示：
[0078]
表3检测本生烟基因相对表达量和cgmmv病毒积累的引物信息
[0079]
[0080]
[0081][0082]
结果显示，nbpds沉默导致本生烟叶片出现明显的白化症状，qrt-pcr分析得基因沉默效率在48～90％之间。其中，沉默nbrap2-3、nbmyb48、nbwrky11、nbxth28和nbdnaj20会使本生烟植株叶片表现出严重的花叶症状，且有大量cgmmv积累，而沉默nbadc、nbcml36、nbnac2、nbh2a和nbatps1的植株也表现出花叶症状，在幼叶中积累了较多的cgmmv。此外，与trv-gfp处理的植株相比，沉默nbspds和nbtub没有引起花叶症状，且叶片中cgmmv积累较少。因此，结果与西瓜pv190vigs基因沉默试验结果基本一致，支持了基因对cgmmv的抗/感染功能验证的结果。
[0083]
由以上实施例可知，本发明提供了22个与黄瓜绿斑驳花叶病毒侵染相关的靶点基因。通过基于cgmmv的病毒诱导的基因沉默(vigs)pv190载体，沉默了上述基因在西瓜植株中的表达，证实了其在cgmmv侵染中的功能。本发明还利用trv沉默载体在本生烟上对12个上述西瓜基因的本生烟同源基因进行验证，与西瓜基因验证结果一致，为防控黄瓜绿斑驳花叶病毒提供依据和有效防控方法，具有重要理论和实践意义。
[0084]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。