一种高效酵母展示载体及酵母展示方法与流程

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种酵母展示载体及高效酵母展示方法。

背景技术：

1、酵母表面展示技术是继噬菌体展示技术发明之后发展起来的蛋白表面展示技术，可用于构建和筛选抗体文库。传统的噬菌体展示技术的主要原理是把目的蛋白质与噬菌体外壳蛋白质融合表达，然后通过固相或液相方法进行抗原筛选，但是其有以下缺点，一是其利用的是原核表达系统，不利于复杂蛋白的表达；二是其筛选抗体的过程近似于黑箱操作。wittrup于1997首次发表了酵母展示的文章，酵母展示技术是利用真核表达系统，具有与哺乳动物细胞类似的蛋白质修饰和折叠机制，且通过与流式细胞分选技术结合，研究人员可实时监控筛选过程，特别是针对抗体的亲和力或者阻断活性等性质进行精细的筛选。

2、通常来说，具有抗体功能活性结构的抗体，除了完整的全抗之外，还包括scfv、scfab、fab片段等。scfv是具有抗体活性的最小功能单位，其结构简单，便于改造和建库。单链fab(scfab)的抗体重链vh-ch1和vl-cl通过一个柔性氨基酸多肽连接子连接并实现scfab的重链vh-ch1和轻链匹配，fab是由重链vh-ch1结构域与轻链通过二硫键匹配组成的抗原结合片段。与scfv相比，scfab和fab的结构和亲和力都更接近于igg型式的全抗。而fab的结构则更加复杂，这导致fab表达系统的改造和建库都相对复杂和麻烦，其中涉及重链和轻链之间的匹配和二硫键形成。目前利用aga1-aga2酵母细胞表面展示系统产生fab片段的方法，主要为在一个表达质粒上利用两个完整的启动子和读码框分别表达fab的重链区和轻链，再将质粒转化到酵母细胞中诱导表达，将完整的fab展示到酵母表面。由于酵母本身对于蛋白质二硫键形成和修饰等能力较弱，因此经常产生稳定性差或低活性的fab或其片段。

3、鉴于现有技术的不足，酵母细胞表面展示抗体或其片段的效率较低以及其重链的vh-ch1结构域和轻链的有效组装和折叠能力较弱。因此，本领域仍需开发可以提高酵母表面展示抗体或其片段的重组载体，利用该载体可以加快抗体发现和抗体工程改造的进程。

技术实现思路

1、本发明发现在酵母表达载体中添加分子伴侣基因和亮氨酸拉链(leucinezipper，lz)基因，可以提高酵母表面展示fab或scfab的效率，特别是针对一些在酵母中低表达或难以正确折叠的fab片段。

2、在一方面，本发明提供了一种酵母展示载体，其特征在于，所述酵母展示载体包含分子伴侣基因和分别带有正、负电荷的亮氨酸拉链基因。

3、在一些实施方案中，其中一个亮氨酸拉链基因的3’末端连接有酵母锚定蛋白基因。

4、在一些实施方案中，所述的酵母展示载体还包含一个或多个多肽编码区编码被展示的多肽。

5、在一些实施方案中，所述多肽编码区包含编码抗体或抗原结合片段的多核苷酸。

6、在一些实施方案中，所述多肽编码区包含编码抗体或抗原结合片段的第一多肽的第一多核苷酸和编码抗体或抗原结合片段的第二多肽的第二多核苷酸。在一些实施方案中，所述第一多肽包含抗体或抗原结合片段的重链可变区，所述第二多肽包含抗体或抗原结合片段的轻链可变区。在一些实施方案中，所述第一多肽包含抗体或抗原结合片段的轻链可变区，所述第二多肽包含抗体或抗原结合片段的重链可变区。

7、在一些实施方案中，所述酵母展示载体包含分子伴侣基因、编码抗体或抗原结合片段的包含重链可变区的第一多肽的第一多核苷酸和编码抗体或抗原结合片段的包含轻链可变区的第二多肽的第二多核苷酸；其中，所述第一多核苷酸和第二多核苷酸的3’末端分别连接有带正、负电荷的亮氨酸拉链基因，其中一个亮氨酸拉链基因的3’末端连接有酵母锚定蛋白基因。

8、在一些实施方案中，所述酵母展示载体包含pyd1质粒骨架、分子伴侣基因、编码抗体或抗原结合片段的包含重链可变区的第一多肽的第一多核苷酸和编码抗体或抗原结合片段的包含轻链可变区的第二多肽的第二多核苷酸；所述第一多核苷酸和第二多核苷酸的3’末端分别连接有带正、负电荷的亮氨酸拉链基因，其中一个亮氨酸拉链基因的3’末端连接有酵母锚定蛋白基因。

9、在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段为fab。在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段为scfab。

10、在一些实施方案中，所述抗原结合片段为fab，且所述第一多核苷酸和第二多核苷酸之间包含自剪切多肽p2a基因。

11、在一些实施方案中，所述抗原结合片段为scfab，且所述第一多核苷酸和第二多核苷酸之间包含连接子。在一些实施方案中，所述连接子为包含甘氨酸和丝氨酸的多肽。在一些实施方案中，所述连接子的序列为(gms)n，其中每个m独立为2、3、4或5，n独立为1、2、3、4或5。在一些实施方案中，所述连接子的序列为(ggggs)n，所述n独立为1、2、3、4或5。在一些实施方案中，所述连接子为60aa linker(seq id no:12：ggssgsgsgstgtsssgtgtsagttgtsastsgsgsgggggsggggsaggtatagas sgs)。

12、在一些实施方案中，所述亮氨酸拉链基因的3’末端通过连接子与酵母锚定蛋白基因连接。在一些实施方案中，所述连接子包含甘氨酸和丝氨酸残基。在一些实施方案中，所述连接子为包含甘氨酸和丝氨酸的多肽。在一些实施方案中，所述连接子的序列为(gms)n，其中每个m独立为2、3、4或5，n独立为1、2、3、4或5。在一些实施方案中，所述连接子的序列为(ggggs)n，所述n独立为1、2、3、4或5。在一些实施方案中，所述连接子的氨基酸序列如seqid no:19所示。

13、在一些实施方案中，所述酵母锚定蛋白为aga2p亚基。在一些实施方案中，所述酵母锚定蛋白为α-凝集素、flolp蛋白、cwp1p蛋白、cwp2p蛋白、或tip1p等。

14、在一些实施方案中，所述分子伴侣基因为pdi(protein disulfide isomerase，蛋白质二硫键异构酶)基因。在一些实施方案中，所述pdi基因表达的蛋白的氨基酸序列如seqid no:13所示。在一些实施方案中，所述分子伴侣为bip、或kar2等。

15、在一些实施方案中，所述带正电荷的亮氨酸拉链的氨基酸序列如seq id no:15所示，所述带负电荷的亮氨酸拉链的氨基酸序列如seq id no:14所示。在一些实施方案中，所述亮氨酸拉链为o'shea et al.,1993,current biology,3:658-667s所述亮氨酸拉链或其衍生物。在一些实施方案中，所述亮氨酸拉链为fos/jun亮氨酸拉链或其衍生物。

16、在一些实施方案中，所述第一多核苷酸和第二多核苷酸还包含信号肽基因。在一些实施方案中，所述信号肽基因编码的信号肽的氨基酸序列如seq id no:17所示。

17、在一些实施方案中，所述酵母锚定蛋白基因的3’末端和/或所述第二多核苷酸的3’末端连接的亮氨酸拉链基因的3’末端连接有蛋白检测标签基因。在一些实施方案中，所述蛋白检测标签选自his标签、myc标签、ha标签、v5标签、arg标签、avi标签、flag标签、3xflag标签、strep标签、nano标签、sbp标签、s标签、钙调蛋白结合肽、纤维素结合结构域、几丁质结合结构域、gst标签和mbp标签。在一些实施方案中，所述蛋白检测标签选自myc标签，v5标签和ha标签。

18、在一些实施方案中，所述酵母展示载体的骨架质粒为其他适于在酵母中表达抗体或抗原结合片段的载体，例如pesc-leu、pesc-leu2d、p4x3、p4x4、p4x5、p4x6，pctcon2，pyd1。在一个实施方案中，所述酵母展示载体的骨架质粒为pyd1。

19、在一些实施方案中，所述酵母展示载体包含编码分子伴侣的多核苷酸和包含编码抗体或抗原结合片段的第二多肽-带负/正电荷的亮氨酸拉链-任选的蛋白检测标签-自剪切多肽-抗体或抗原结合片段的第一多肽-带正/负电荷的亮氨酸拉链-连接子-酵母锚定蛋白-任选的标签的多核苷酸。

20、在一些实施方案中，所述酵母展示载体包含编码pdi的多核苷酸和编码sp2-vl-cl-(a-lz)-v5-p2a-sp1-vh-ch1-(b-lz)-3gs-aga2p-myc的多核苷酸。在一些实施方案中，可通过在vl两端设计酶切位点bamhi和bsiwi，和/或在vh两端设计酶切位点ncoi和afei在pyd-pdi-fab-lz载体上插入任意抗体的vl或vh。在一些实施方案中，所述酵母展示载体为pyd-pdi-fab-lz(载体图谱如图6所示)。

21、所述抗体或抗原结合片段可以靶向任何抗原，例如，所述抗原为tigit、4-1bb、ox40、pd-1、pd-l1、angpt2、aplp2、baff、bcma、ccr2、cd123、cd16、cd19、cd20、cd22、cd28、cd3、cd30、cd40、cd47、cd73、cdh17、cmet、csf1r、ctla-4、claudin18.2、dll4、egfr、fgfr1、gitr、her2、hgf、il-13、il-17、il-17a、il-1α、il-1β、il-4、il-4ra、il-5、il-6、il-6r、klb、lag-3、msln、psma、tfr、tgfβ、tim-3、trailr2、vegf、vista、icos，病毒相关抗原如新冠病毒抗原、il-1α(白介素il-1α)、il-1β(白介素il-1β)、il-13(白介素il-13)、tnf-α(肿瘤坏死因子α)、tnf-β(肿瘤坏死因子β)、tim-3(t cell immunoglobin domain and mucindomain-3)、lag3(淋巴细胞活化基因-3分子)、cd27(分化簇27)、btla(b和t淋巴细胞弱化因子)、cd137(分化簇137)、半乳糖凝集素9、cd48(分化簇48)、ccd70(分化簇70)、hvem(herpesvirus entry mediator)、和cc趋化因子亚组中的ccl1、ccl3、ccl5、ccl7、ccl8等。

22、在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段靶向ox40。在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段为11d4抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段包含的重链片段vh-ch1的氨基酸序列如seq id no:7所示，所述抗体或抗原结合片段包含的轻链包含的vl-cl的氨基酸序列如seq id no:8所示。

23、在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段靶向pd-l1。在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段包含的重链片段vh-ch1的氨基酸序列如seq id no:9所示，所述抗体或抗原结合片段包含的轻链包含的vl-cl的氨基酸序列如seq id no:10所示。

24、在另一方面，本发明提供一种宿主细胞，其包含上述酵母展示载体。在一些实施方案中，所述宿主细胞为酵母。在一些实施方案中，所述酵母细胞选自：酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)、毕赤酵母(pichia pastoris)、巴氏酵母(saccharomycespastorianus)、贝酵母(saccharomyces bayanus)、乳酸克鲁维酵母(kluyveromyceslactis)、马克斯克鲁维酵母(kluyveromyces marxianus)、粟酒裂殖酵母(schizosaccharomyces pombe)、白色假丝酵母(candida albicans)、树干毕赤酵母(pichia stipitis)、解脂耶氏酵母(yarrowia lipolytica)、多形汉逊酵母(hansenulapolymorpha)、红法夫酵母(phaffia rhodozyma)、产朊假丝酵母(candida utilis)、耐盐酵母(arxula adeninivorans)、汉逊德巴利酵母(debaryomyces hansenii)、多形德巴利酵母(debaryomyces polymorphus)、、西方许旺酵母(schwanniomyces occidentalis)或其衍生物。在一些实施方案中，所述酵母为酿酒酵母。在一些实施方案中，所述酵母为表达a-凝集素的aga1p亚基的酿酒酵母。在一些实施方案中，所述酵母为酿酒酵母eby100。

25、在另一方面，本发明提供一种酵母展示方法，包括将上述酵母展示载体转入酵母细胞，获得含有酵母展示载体的酵母，然后进行培养和诱导。在一些实施方案中，所述酵母为表达a-凝集素的aga1p亚基的酿酒酵母。在一些实施方案中，所述酵母为酿酒酵母eby100。

26、可以使用本领域已知的任何方法构建本发明的酵母展示载体。例如，合成编码目的蛋白(如本文所述分子伴侣、亮氨酸拉链、第一多肽和/或第二多肽)的核酸并在两端设计合适的酶切位点，将上述目的核酸片段通过酶切连接到载体如pyd1载体中。在一些实施方案中，可通过在vl两端设计酶切位点bamhi和bsiwi，和/或在vh两端设计酶切位点ncoi和afei在pyd-pdi-fab-lz载体上插入任意抗体的vl或vh。在一些实施方案中，所述酵母展示载体为pyd-pdi-fab-lz(载体图谱如图6所示)。

27、不限定所述分子伴侣基因、第一多核苷酸和第二多核苷酸在酵母展示载体中的相对位置，只要所述分子伴侣基因、第一多核苷酸和第二多核苷酸在导入酵母细胞后均能表达即可。可使用本领域已知的任何方法将酵母展示载体转化到酵母细胞中。

28、本发明的酵母展示载体能够解决一些在酵母中低表达或难以正确折叠的抗体的展示问题。在一些实施方案中，用编码目的抗体的第一多核苷酸和/或第二多核苷酸替换本文所述酵母展示载体中的对应的第一多核苷酸和/或第二多核苷酸以构成表达目的抗体的酵母展示载体。在一些实施方案中，在构建抗体库时，通过使设计的抗体库的多核苷酸文库或基因文库具有合适的限制性酶切位点，以将抗体库的多核苷酸文库或基因文库与本发明的酵母展示载体连接，使酵母表达展示更多折叠正确的抗体蛋白，以尽可能地避免某些克隆的丢失，保持原始库的多样性。

29、除非另外限定，否则本文中所用的全部技术与科学术语具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。本文所提及的全部出版物、专利申请、专利和其他参考文献通过引用的方式完整地并入作为参考。此外，本文中所述的材料、方法和例子仅是说明性的并且非意在是限制性的。