一种二聚体融合蛋白及其应用的制作方法

本发明属于生物医药，具体涉及一种二聚体融合蛋白及其应用。

背景技术：

1、单克隆抗体(mab)已经广泛用于治疗多种人类疾病，包括癌症、自身免疫疾病、感染性疾病以及心血管疾病等。目前，存在超过30种单克隆抗体，包括鼠类、全人源化和嵌合抗体，它们已经被fda批准用于治疗用途。这些抗体大多数是单特异性抗体，其识别单一表位并且可被选择以便通过此单一表位激活或抑制靶分子的活性。

2、ceacam属于免疫球蛋白超家族黏附分子，其结构域高度糖基化，通常包括1-2个免疫球蛋白可变区样结构域(ndomain)和0-6个免疫球蛋白恒定区样结构域。ceacam涉及多种细胞功能，以细胞间的黏附功能为基础，通过信号转导调节细胞生长和分化，并在胰岛素稳态、血管生成及免疫调节中发挥重要作用。在人中，ceacam亚群由7个成员组成：ceacam1、ceacam3、ceacam4、ceacam5、ceacam6、ceacam7、ceacam8。ceacam基因家族成员参与各种各样的病理生理作用，包括作为微生物病原体的受体，它们在致癌、癌症检测、进展和转移中起重要作用。

3、ceacam5(简称为cea，又称为cd66e)是具有约180kda分子量的糖蛋白，编码cea蛋白。ceacam5含有经由糖基磷脂酰肌醇(gpi)锚与细胞膜连接的7个结构域，7个结构域包括单一n端ig可变域和与ig恒定域同源的6个结构域(a1-b1-a2-b2-a3-b3)。ceacam5在1965首次被描述为胃肠癌胚抗原，但截至目前，研究表明ceacam5在结肠直肠、胃、肺、乳腺、前列腺、卵巢、子宫颈和膀胱肿瘤细胞的表面上具有高表达，并在少数正常上皮组织(结肠中的柱状上皮和杯状细胞、胃中的黏液颈细胞和食道和子宫颈中的鳞状上皮细胞)中具有弱表达。例如，在前列腺癌和结直肠癌中，ceacam5的过度表达被证明可以作为肿瘤生物标志物。

4、ceacam6(也称为cd66c或nca-90)是与糖基磷酸肌醇(gpi)相连的细胞表面蛋白，具有一个n-结构域和2个c2样结构域，通过其具有各种膜受体(已鉴定其中的一些)的胞外结构域介导许多顺式或反式引导的ceacam相互作用。ceacam6在来自各种器官的粒细胞和上皮细胞上表达，并且与正常粘膜、癌症相比，ceacam6在增生性结肠息肉和腺瘤的增殖细胞中具有更广泛的表达区，在患有肺癌、胰腺癌、乳腺癌、结肠直肠癌和肝细胞癌的患者中发现ceacam6的相对高血清水平。ceacam6的过表达导致形态改变，类似于上皮-间充质转化，使得侵袭性增强，化学抗药性增强。先前的研究表明，使用ceacam6特异性sirna通过ceacam6沉默可实现肿瘤生长抑制，使用抗体片段抑制ceacam6功能可在体外影响细胞迁移，细胞侵袭和细胞粘附。这些研究结果表明，ceacam6是各种肿瘤的良好生物标志物。

5、此外，在多种恶性肿瘤，如乳房、胰腺、卵巢、结肠、肺和胃腺肿瘤中ceacam5/ceacam6亦被发现呈过度表达，并且与肿瘤的侵袭性和转移有关。

6、ceacam家族成员的胞外结构域由重复免疫球蛋白样(ig样)结构域构成，根据序列同源性，所述重复免疫球蛋白样(ig样)结构域已分为3种类型：a、b和n。ceacam5包含7个这样的结构域，即n、a1、b1、a2、b2、a3和b3。ceacam5a1、a2和a3结构域与b1、b2和b3结构域展示高序列同源性，人ceacam5的a结构域呈现84％至87％成对序列相似性，且b结构域呈现69％至80％成对序列相似性。此外，其结构中呈现a和/或b结构域的其他人ceacam成员(即ceacam1、ceacam6、ceacam7和ceacam8)展示与人ceacam5的同源性。具体而言，人ceacam6蛋白的a和b结构域分别展示与人ceacam5的a1和a3结构域和b1至b3结构域中任一种的序列同源性，该序列同源性甚至高于在人ceacam5的a结构域和b结构域中所观察到的序列同源性。

7、il-10主要由激活的t细胞和抗原提呈细胞分泌，抗原识别的过程中，cd8+t细胞中的il-10受体(il-10r)表达上调。il-10由特异的细胞表面受体复合物介导多种活性，il-10受体包含两个不同的链，il-10r1和il-10r2，两条链均属于ii类细胞因子受体家族(crf2)。在细菌感染和组织损伤中，il10可以减少炎症反应，抑制t细胞(th17)和巨噬细胞引起的炎症反应(il-12/23)，降低肿瘤相关炎症反应。在肿瘤微环境中，il-10可以高效激活抗原特异性cd8+t细胞的增殖和毒性。

8、il-10抗肿瘤的作用机制为：a.可以激活肿瘤内部cd8+t细胞的活性和扩增；b.il10可以增加肿瘤内部抗原特异性t淋巴细胞的活性和扩增；c.il-10对肿瘤的排斥作用具有记忆功能，动物体内试验数据表明，给予il-10药物肿瘤消失后，再次给予小鼠接种肿瘤细胞，该肿瘤细胞不在小鼠体内生长，主要的原因为：il-10能够增强抗原特异性cd8+t细胞的存活率，起到肿瘤疫苗的作用；d.il10通过恢复终端耗竭t细胞的氧化磷酸化代谢来重新激活t细胞达到杀伤肿瘤细胞的目的。临床试验也证明，与pdl1抗体联合使用时，会增加肿瘤内部细胞pdl1特异性cd8+阳性细胞，产生持久的抗肿瘤效果。但目前暂未有以il-10为靶点的上市药物。

9、il-10可以促进针对特异性抗原的cd8+t细胞的扩增和存活期，而特异性抗原cd8+t细胞与免疫细胞对肿瘤的杀伤呈正相关性。虽然已有多项研究表明，免疫调节剂可用于在动物模型和癌症患者中施加抗肿瘤作用，然而，与免疫调节剂的应用相关的短半衰期和系统性毒性极大地限制了它们的使用。il-10与受体结合以后，启动stat3、stat1通路，这两条通路是il-10起生物功能的信号转导途径。

10、专利cn201380041222.1中提供了包含il-10的融合蛋白，公开了特定靶点和序列的优势结构。然而，这种融合蛋白的表达量低，纯度不高，il-10端的结合活性与信号激活能力弱，与癌细胞结合活性差，无法用于规模化工业生产。此外，该专利也没有公开其他靶点和序列的优势结构。

11、因此，有必要寻找既与il-10具有良好结合活性，又与肿瘤组织与正常组织差异化结合(即，与肿瘤细胞高度结合，与正常细胞微弱结合或不结合)，并且与周围健康组织交叉反应较小的抗ceacam5和ceacam6二聚体融合蛋白。

技术实现思路

1、本发明目的在于提供一种二聚体融合蛋白及其应用，该二聚体融合蛋白对ceacam5和ceacam6、il10均有较高的亲和力，且具有良好的抗肿瘤活性。

2、本发明提供了一种二聚体融合蛋白，所述二聚体融合蛋白包含：轻链和重链，所述轻链和重链复合以形成表现出对肿瘤抗原或免疫检查点的结合特异性的靶向部分；一个或多个免疫调节剂，所述免疫调节剂融合至所述重链的c端以形成多肽链；所述轻链、重链与免疫调节剂形成所述二聚体融合蛋白。

3、在一个实施方案中，所述肿瘤抗原为ceacam5和/或ceacam6。

4、在一个实施方案中，所述重链含一个或多个相同或者不同类型的免疫调节剂。在一个实施方案中，所述免疫调节剂增强免疫应答。在一个实施方案中，所述免疫调节剂降低免疫应答。在一个实施方案中，所述免疫调节剂可以是天然的免疫调节剂，也可以经过突变形成。在一个实施方案中，所述免疫调节剂为细胞因子、细胞因子受体、生长因子、激素或细胞外基质分子。在一个实施方案中，所述免疫调节剂选自il-1、il-2、il-2rα、il-2rβ、il-3、il-3rα、il-4、il-4rα、il-5、il-5rα、il-6、il-6rα、il-7、il-7rα、il-8、il-9、il-9rα、il-10、il-10r1、il-10r2、il-11、il-11rα、il-12、il-12rα、il-12rβ2、il-12rβ1、il-13、il-13rα、il-13rα2、il-14、il-15、il-15rαsushi、il-16、il-17、il-18、il-19、il-20、il-20r1、il-20r2、il-21、il-21rα、il-22、il-23、il-23r、il-27r、il-31r中的一种或多种。在一个实施方案中，所述免疫调节剂为il-10。在一个实施方案中，所述免疫调节剂是il-10或其二元复合物(il-10)2。在一个实施方案中，所述il-10含有如seq id no:2所示的氨基酸序列或具有至少80％同一性的氨基酸序列。

5、在一个实施方案中，天然的il-10单体序列如seq id no:1所示。或为与seq idno:1有至少80％同一性的氨基酸序列。

6、在一个实施方案中，所述重链含有如seq id no:2所示的hcdr1、如seq id no:3所示的hcdr2、如seq id no:4所示的hcdr3的氨基酸序列或具有至少80％同一性的氨基酸序列；所述轻链含有如seq id no:5所示的lcdr1、如seq id no:6所示的lcdr2、如seq id no:7所示的lcdr3的氨基酸序列或具有至少80％同一性的氨基酸序列。

7、在一个实施方案中，所述重链的可变区的氨基酸序列如seq id no:8所示，或为与seq id no:8有至少80％同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述轻链的可变区的氨基酸序列如seq id no:9所示，或为与seq id no:9具有至少80％同一性的氨基酸序列。

8、在一个实施方案中，所述重链的氨基酸序列如seq id no:10，或为与seq id no:10有至少80％同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述轻链的氨基酸序列如seq idno:11所示，或为与seq id no:11具有至少80％同一性的氨基酸序列。

9、在一个实施方案中，所述免疫调节剂与所述特异性结合肿瘤抗原或免疫检查点的抗体的fc区域连接。在一个实施方案中，所述免疫调节剂通过多肽接头连接至fc区域。在一个实施方案中，所述多肽接头为5-30个氨基酸。在一个实施方案中，所述多肽接头为(ggggs)n，其中n＝1-6。在一个实施方案中，所述重链包含选自igg1、igg2、igg3和igg4的免疫球蛋白的恒定区。

10、本发明还提供了上述二聚体融合蛋白的制备方法，所述制备方法是将分别含上述轻链、重链、il-10质粒转入同一宿主细胞中进行重组表达。

11、在一个实施方案中，所述轻链、重链、il-10重组质粒的浓度比为1:0.5-2:0.5-2。在一个实施方案中，所述轻链、重链、il-10的重组质粒的浓度比为1:1:1。

12、在一个实施方案中，所述宿主细胞为哺乳动物细胞、细菌、真菌或昆虫细胞。在一个实施方案中，所述哺乳动物细胞为cho细胞、sp20细胞、nso细胞、cos细胞、bhk细胞、hek293细胞或perc6细胞。在一个实施方案中，所述哺乳动物细胞为cho细胞。

13、本发明提供了一种编码上述二聚体融合蛋白的核酸。本发明提供了一种含上述核酸的载体或质粒。本发明提供了一种表达上述载体或质粒的细胞。本发明还提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含上述的二聚体融合蛋白以及至少一种药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体。在一个实施方案中，所述药物组合物可以单独使用或与其他治疗剂联用，来提高疗效或减少潜在的副作用。

14、本发明还提供了上述二聚体融合蛋白在制备防治肿瘤疾病的药物方面的应用。在一个实施方案中，所述肿瘤疾病包括大肠癌、膜腺癌、肺癌、食管癌、前列腺癌、促结缔组织增生性小圆细胞肿瘤、卵巢癌、胃癌、胰腺癌、肝癌、肾癌、乳腺癌、非小细胞肺癌、黑色素瘤、肺泡横纹肌肉瘤、胚胎性横纹肌肉瘤、尤因肉瘤、肾母细胞瘤、神经母细胞瘤、神经节细胞瘤、髓母细胞瘤、高级别胶质瘤、弥漫性内在脑桥胶质瘤、多层菊形团胚胎性肿瘤中的一种或多种。

15、本发明还提供了上述二聚体融合蛋白在制备检测肿瘤相关抗原ceacam5、ceacam6和il-10受体分子的试剂或试剂盒方面的应用。