技术特征：
1.一种原代上皮细胞的制备方法，其特征是，包括如下步骤：(1)上皮层组织的制备：将上皮组织用含有双抗的d-hanks液冲洗，放入中性蛋白酶ii中消化；取出上皮组织，剥离粘膜下层，获得上皮层组织；(2)上皮层组织的消化：将所述步骤(1)获得的上皮层组织，用含有双抗的d-hanks液冲洗，切分为组织块，而后放入胶原酶i型和透明质酸酶的混合消化液中消化；(3)细胞培养体系的构建：向所述步骤(2)中的混合消化液中加入含有胎牛血清的dmem培养基，经过滤后，离心，弃去上清液，d-pbs重悬沉淀后再次离心，得到沉淀物；将沉淀物使用角化细胞培养基重悬，培养，获得原代上皮细胞。2.根据权利要求1所述的原代上皮细胞的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，将上皮组织用含有双抗的d-hanks液冲洗3遍，放入2.5mg/ml的中性蛋白酶ii溶液中，4℃消化8小时。3.根据权利要求1所述的原代上皮细胞的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，用含有双抗的d-hanks液冲洗上皮层组织3次，使用手术刀将上皮层组织分割为1x1mm2的组织块，而后放入2mg/ml胶原酶i型与1mg/ml透明质酸酶的混合消化液中，37℃消化0.5～4小时，期间每半小时使用移液枪吹打1次。4.根据权利要求1所述的原代上皮细胞的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中，向消化液中加入含有胎牛血清的dmem培养基，移液枪充分吹打，经100μm细胞滤网过滤后离心5分钟，弃去上清液，d-pbs重悬沉淀后再次离心5分钟，沉淀使用角化细胞培养基重悬，接种于孔板上进行细胞培养。5.根据权利要求1所述的原代上皮细胞的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述角化细胞培养基使用如下成份制成：dmem/f12培养基、表皮生长因子egf添加剂、胰岛素、转铁蛋白、hepes缓冲液、glutamax溶液、青霉素-链霉素溶液。6.根据权利要求5所述的原代上皮细胞的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述角化细胞培养基使用如下浓度的成份制成：dmem/f12培养基、50ng/ml表皮生长因子egf添加剂、5μg/ml胰岛素、5μg/ml转铁蛋白、10mmolml hepes缓冲液、1x glutamax溶液、15mg/ml青霉素-链霉素溶液。
技术总结
本发明涉及一种原代上皮细胞的制备方法，其解决了现有技术中无法兼顾获取效率与细胞活性及干性维持的技术问题，包括如下步骤：将组织使用含有双抗的d-Hanks液冲洗，放入中性蛋白酶II中；取出组织，剥离粘膜下层，获得上皮层组织，并使用含有双抗的d-Hanks液冲洗；将上皮组织分割为组织块，而后放入胶原酶I型和透明质酸酶的混合消化液中保存；向混合消化液中加入含有胎牛血清的DMEM培养基，经过滤后，离心，弃去上清液，d-PBS重悬沉淀后再次离心，得到沉淀物；将沉淀物使用角化细胞培养基重悬，培养，获得原代上皮细胞。本发明可用于原代上皮细胞的制备领域。皮细胞的制备领域。皮细胞的制备领域。
技术研发人员：邓旭亮 陈一铭 黄颖 胡哲文
受保护的技术使用者：北京大学口腔医学院
技术研发日：2022.07.12
技术公布日：2022/9/20