一种XNA分子钳-多重荧光PCR法基因突变检测方法与流程

一种xna分子钳-多重荧光pcr法基因突变检测方法
技术领域
1.本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一种xna分子钳-多重荧光pcr法基因突变检测方法。


背景技术：

2.肺癌是严重危害人类健康的常见恶性肿瘤之一，其中80～85％的肺癌为非小细胞肺癌。非小细胞肺癌患者中存在多种基因突变类型，其中egfr、her2、kras、braf基因突变频率分别约为10～50％、1～4％、5～25％、1～2％，alk、ros1、ret、ntrk1、ntrk2、ntrk3基因融合发生频率分别约为3～7％、1％、1％、0.12％、0.02％、0.08％，met外显子14跳跃基因突变发生频率约为1％。大量临床研究表明，驱动基因突变状态是靶向药物治疗的重要疗效预测因子，在进行靶向治疗前需要对基因突变状态进行检测，并强烈建议进行更广泛的有效基因的状态检测，因此，对非小细胞肺癌患者的多基因突变联合检测可为患者提供更精准的治疗。
3.xna分子钳是一种新型的核酸分子低聚体，与靶dna序列杂交，可作为实时定量聚合酶链反应中的分子钳，xna分子钳检测可以使用液体活检和ffpe样本产生高灵敏度的结果。
4.这些基因突变或融合状态与靶向药物的疗效相关，然而，目前大多数试剂盒每次只能检测一种或几种基因突变，检测通量低，耗时长，对样本需求量大。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种xna分子钳-多重荧光pcr法基因突变检测方法，解决现有试剂盒对基因突变状态进行检测耗时长的问题。
6.为实现上述目的，本发明提供了一种xna分子钳-多重荧光pcr法基因突变检测方法：
7.制备待测样品；
8.提取所述待测样品中的dna和rna，并将所述rna逆转处理，得到crna，再将所述crna和所述dna混合后进行多重荧光pcr扩散，得到荧光样品；
9.通过荧光pcr扩增仪检测所述荧光样品，并显示所述荧光样品的ct值判定检测结果。
10.其中，所述制备待测样品的具体方式：
11.将各个来源于无肺病病史健康人群唾液与粪便样本均接种于培养基中，37℃静置厌氧培养20-40h；
12.分别取各个所述培养基中的培养液4ml进行离心，5500rpm，10min，离心后的菌体用ph为6.8的无菌生理盐水洗涤，洗涤后再次进行离心，5500rpm，10min，得到无菌纯水悬浮菌体；
13.将400ul的所述无菌纯水悬浮菌体，沸水浴10min，10000rpm离心15min，收集上清
液。
14.其中，提取所述待测样品中的dna和rna，并将所述rna逆转处理，得到crna，再将所述crna和所述dna混合后进行多重荧光pcr扩散，得到荧光样品的具体方式：
15.提取所述待测样品中的dna和rna，往提取到的所述rna加热入逆转录反应液，所述rna与所述逆转录反应液中的逆转录酶混合，得到crna；
16.将所述dna和所述crna分别与混合酶混合，并对混合的所述dna和所述crna进行多重荧光pcr扩散，得到所述荧光样品。
17.其中，所述pcr扩增的反应条件为94℃预变性3min，94℃变性10s，55℃退火30s，72℃延伸90s，整个体系做28个循环，72℃后延伸5min。
18.其中，所述荧光pcr扩增仪包括壳体、扩增仪本体、调温板和放置组件，所述扩增仪本体与所述壳体固定连接，且位于所述壳体内，所述调温板设置于所述壳体内，所述放置组件设置于所述调温板远离所述扩增仪本体一侧。
19.其中，所述放置组件包括放置板、顶杆、固定杆和滑块，所述顶杆设置于所述壳体靠近所述扩增仪本体一侧，所述放置板与所述壳体滑动连接，且位于所述壳体内，所述壳体具有卡槽，所述放置板具有滑槽，所述固定杆设置于所述滑槽内，所述滑块与所述固定杆固定连接，并贯穿所述放置板。
20.其中，所述固定杆包括滑杆和第一弹簧，所述滑杆与所述放置板滑动连接，且位于所述滑槽内，所述第一弹簧与所述滑杆固定连接，并与所述放置板固定连接，且位于所述滑杆和所述放置板之间。
21.本发明的一种xna分子钳-多重荧光pcr法基因突变检测方法，制备待测样品；提取所述待测样品中的dna和rna，并将所述rna逆转处理，得到crna，再将所述crna和所述dna混合后进行多重荧光pcr扩散，得到荧光样品；通过荧光pcr扩增仪检测所述荧光样品，并显示所述荧光样品的ct值判定检测结果，该方法引入多重荧光pcr扩散技术，通过采用特异性引物和探针技术，三色荧光通道检测模式，建立了实时pcr体系，可以同时检测多种融合基因和多种突变基因，具备特异性好，准确率高，快速廉价，解决现有试剂盒对基因突变状态进行检测耗时长的问题。
附图说明
22.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
23.图1是本发明提供的一种xna分子钳-多重荧光pcr法基因突变检测方法的流程图。
24.图2是本发明提供的荧光pcr扩增仪的结构示意图。
25.图3是本发明提供的荧光pcr扩增仪的的内部剖视图。
26.图中：1-壳体、2-卡槽、3-扩增仪本体、4-调温板、5-放置板、6-滑槽、7-滑杆、8-第一弹簧、9-滑块本体、10-拉杆、11-伸缩杆、12-第二弹簧。
具体实施方式
27.下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
28.请参阅图1至图3，本发明提供一种xna分子钳-多重荧光pcr法基因突变检测方法，包括以下步骤：
29.s1制备待测样品；
30.具体方式：
31.s11将各个来源于无肺病病史健康人群唾液与粪便样本均接种于培养基中，37℃静置厌氧培养20-40h；
32.s12分别取各个所述培养基中的培养液4ml进行离心，5500rpm，10min，离心后的菌体用ph为6.8的无菌生理盐水洗涤，洗涤后再次进行离心，5500rpm，10min，得到无菌纯水悬浮菌体；
33.s13将400ul的所述无菌纯水悬浮菌体，沸水浴10min，10000rpm离心15min，收集上清液。
34.s2提取所述待测样品中的dna和rna，并将所述rna逆转处理，得到crna，再将所述crna和所述dna混合后进行多重荧光pcr扩散，得到荧光样品；
35.具体的，所述pcr扩增的反应条件为94℃预变性3min，94℃变性10s，55℃退火30s，72℃延伸90s，整个体系做28个循环，72℃后延伸5min，所述pcr扩增反应体系为：2
×
taq pcr mix 10μl，ddh2o 9μl，上游引物f1 0.4μl，下游引物r1 0.4μl和样本模板0.2μl，漩涡混匀后闪离5s，置于pcr核酸扩增仪上反应。
36.具体方式：
37.s21提取所述待测样品中的dna和rna，往提取到的所述rna加热入逆转录反应液，所述rna与所述逆转录反应液中的逆转录酶混合，得到crna；
38.s22将所述dna和所述crna分别与混合酶混合，并对混合的所述dna和所述crna进行多重荧光pcr扩散，得到所述荧光样品。
39.s3通过荧光pcr扩增仪检测所述荧光样品，并显示的ct值判定检测结果。
40.具体的，利用特异性引物和探针进行pcr反应，突变由fam/rox/cy5信号指示，内控由vic信号指示，通过计算
△
ct值的大小进行判断，反应管的
△
ct值≤cut off值时，则样本为该反应管对应信号突变阳性，反之则为阴性或低于试剂盒的检测下线。
△
ct值＝ct值突变位点-ct值内控。
41.进一步的，所述荧光pcr扩增仪包括壳体1、扩增仪本体3、调温板4和放置组件，所述扩增仪本体3与所述壳体1固定连接，且位于所述壳体1内，所述调温板4设置于所述壳体1内，所述放置组件设置于所述调温板4远离所述扩增仪本体3一侧；所述放置组件包括放置板5、顶杆、固定杆和滑块，所述顶杆设置于所述壳体1靠近所述扩增仪本体3一侧，所述放置板5与所述壳体1滑动连接，且位于所述壳体1内，所述壳体1具有卡槽2，所述放置板5具有滑槽6，所述固定杆设置于所述滑槽6内，所述滑块与所述固定杆固定连接，并贯穿所述放置板5；所述固定杆包括滑杆7和第一弹簧8，所述滑杆7与所述放置板5滑动连接，且位于所述滑槽6内，所述第一弹簧8与所述滑杆7固定连接，并与所述放置板5固定连接，且位于所述滑杆
7和所述放置板5之间。
42.在本实施方式中，所述壳体1对所述扩增仪本体3、所述调温板4和所述放置组件提供安装条件，所述扩增仪本体3利用聚合酶链反应技术对所述dna和所述crna进行扩增，所述调温板4连接冷却液源和热水源，对装有所述dna和所述crna的试管进行加热和冷却，所述放置板5用于放置装有所述dna和所述crna的试管，可同时放置多个试管进行检测，往所述壳体1内放置试管时，将试管放入所述放置板5内，检测员利用手部向中间拉动所述滑块，所述滑块滑动将所述固定杆收入所述放置板5内，检测员再并将所述放置板5放入所述壳体1内，松开所述滑块并下压所述放置板5，使所述放置板5在所述壳体1内滑动挤压所述顶杆，待所述滑槽6和所述卡槽2处于同一水平面时，所述第一弹簧8推动所述滑杆7滑出所述滑槽6，所述滑杆7插入所述卡槽2内，从而将所述放置板5固定，从所述壳体1内取出试管时，检测员再次向中间滑动所述滑块，所述滑块滑动使得所述滑杆7缩回所述滑槽6，将所述滑杆7与所述壳体1分开，所述顶杆复位将所述放置板5顶起，便于检测员将所述放置板5从所述壳体1内取出。
43.进一步的，所述滑块包括滑块本体9和拉杆10，所述滑块本体9与所述滑杆7固定连接，且贯穿所述放置板5，所述拉杆10与所述滑块本体9固定连接，且位于所述滑块本体9一侧。
44.在本实施方式中，所述拉杆10的设置，便于检测员滑动所述滑块本体9，所述滑块本体9滑动控制所述滑杆7的滑动。
45.进一步的，所述顶杆包括伸缩杆11和第二弹簧12，所述伸缩杆11与所述壳体1固定连接，且位于靠近所述扩增仪本体3一侧，所述第二弹簧12套设于所述伸缩杆11上。
46.在本实施方式中，所述放置板5下压时，所述放置板5推动所述伸缩杆11，使得所述伸缩杆11和所述第二弹簧12压缩，取出试管时，所述滑杆7与所述壳体1分开，所述第二弹簧12复位带动所述伸缩杆11伸长，从而将所述放置板5顶起。
47.以上所揭露的仅为本发明一种较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，本领域普通技术人员可以理解实现上述实施例的全部或部分流程，并依本发明权利要求所作的等同变化，仍属于发明所涵盖的范围。