胞外表达人源Ly6d蛋白的重组表达质粒、重组细胞及构建方法与流程

胞外表达人源ly6d蛋白的重组表达质粒、重组细胞及构建方法
1.本技术为申请日为2021年12月28日的中国发明专利申请：一种人源ly6d重组蛋白细胞分泌表达方法及应用(申请号cn202111629570.3)的分案申请。
技术领域
2.本发明属于人源ly6d蛋白分泌表达技术领域，尤其涉及一种人源ly6d重组蛋白细胞分泌表达方法及应用。


背景技术：

3.淋巴细胞抗原-6(ly6)复合物是一组同种异体抗原，于40年前首次在小鼠的淋巴细胞中被发现，其主要成员有ly6a/d/e/k/h，ly6家族成员的进化十分保守。据报道，ly6家族成员在癌症中发挥着重要左右，ly6k可以导致乳腺癌细胞转移，临床分析表明，ly6k与非小细胞肺癌患者的肿瘤分化、淋巴结转移和tnm分期有关。ly6d作为ly6家族成员中最为重要的成员之一，常用于开发多种癌症类型的新型治疗剂。
4.ly6d基因在多种类型的癌症中表达增加，并与细胞的粘附有关，且发现其可以作为晚期前列腺癌的预后因素，与患者生存的不良结果呈正相关，这表明ly6d将被作为不良预后的标志物。
5.ly6d不仅在癌症中至关重要，相关研究显示，ly6d在b淋巴细胞分化的表型和转录组异质性方面做出了重要贡献，在b淋巴细胞的增殖分化过程中占据着举足轻重的地位。但是，目前关于ly6d蛋白分泌表达的研究很少。而膜蛋白的表达是体外表达技术的难点，因为会发生不表达或表达出来的蛋白不可溶的问题，也会存在表达在细胞内不分泌的困难，或者仅能得到极少量的蛋白，无法满足后续实验需求，较难发挥其生物学功能。


技术实现要素：

6.针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种人源ly6d重组蛋白细胞分泌表达方法及应用，目的在于解决现有技术中的一部分问题或至少缓解现有技术中的一部分问题。
7.第一方面，本发明实施例公开了一种用于在expi293f细胞中胞外表达人源ly6d蛋白的重组表达质粒，所述重组表达质粒包括基础质粒pcdna3.1以及在所述基础质粒的酶切位点插入的用于表达人源ly6d重组蛋白目的序列；所述目的序列的核苷酸序列包括：
8.atggaaaccgacacactgctgctgtgggtgctgttgttgtgggtgccaggctctaccggcctgcgctgccacgtgtgcaccagctccagcaactgcaagcattctgtggtctgcccggccagctctcgcttctgcaagaccacgaacacagtggagcctctgagggggaatctggtgaagaaggactgtgcggagtcgtgcacacccagctacaccctgcaaggccaggtcagcagcggcaccagctccacccagtgctgccaggaggacctgtgcaatgagaagctgcacaac。
9.在某些实施例中，所述目的序列的核苷酸序列包括：atggaaaccgacacactgctgctgtgggtgctgttgttgtgggtgccaggctctaccggcctgcgctgccacgtgtgcaccagctccagcaactgcaagcattctgtggtctgcccggccagctctcgcttctgcaagaccacgaacacagtggagcctctgagggggaatctggt
gaagaaggactgtgcggagtcgtgcacacccagctacaccctgcaaggccaggtcagcagcggcaccagctccacccagtgctgccaggaggacctgtgcaatgagaagctgcacaacgcaccaagcacctgtagcaagcccatgtgccccccccccgagctgcccggcggccccagcgtgttcatcttcccccccaagcccaaggacaccctgatgatcagccgcacccccgaggtgacctgcgtggtggtggacgtgagccaggacgaccccgaggtgcagttcacctggtacatcaacaacgagcaggtgcgcaccgcccgcccccccctgcgcgagcagcagttcaacagcaccatccgcgtggtgagcaccctgcccatcgcccaccaggactggctgcgcggcaaggagttcaagtgcaaggtgcacaacaaggccctgcccgcccccatcgagaagaccatcagcaaggcccgcggccagcccctggagcccaaggtgtacaccatgggccccccccgcgaggagctgagcagccgcagcgtgagcctgacctgcatgatcaacggcttctaccccagcgacatcagcgtggagtgggagaagaacggcaaggccgaggacaactacaagaccacccccaccgtgctggacagcgacggcagctacttcctgtacagcaagctgagcgtgcccaccagcgagtggcagcgcggcgacgtgttcacctgcagcgtgatgcacgaggccctgcacaaccactacacccagaagagcatcagccgcagccccggcaa。
10.第二方面，本发明实施例公开了第一方面所述的重组表达质粒的构建方法，其包括：
11.获得所述的目的序列的dna；
12.对所述dna进行pcr扩增，回收扩增产物；
13.将所述扩增产物和基础质粒同时进行酶切反应后同源连接，以得到所述重组表达质粒，所述扩增产物与所述基础质粒连接反应的摩尔比例为3:1～10:1；
14.其中，所述pcr扩增反应的体系以50μl计包括：25μl gloria high-fidelity pcr master mix with gc buffer、17μl ddh2o、1.5μldmso、1.5μl模板、2.5μl上游引物和2.5μl下游引物；所述上游引物的核苷酸序列包括ggttcccggtagcaccggtgctagcctgcgctgccacgtgt，所述下游引物的核苷酸序列包括
15.gctacaggtgcttggtgcgctagcgttgtgcagcttctcattgcacagg。
16.在某些实施例中，所述pcr扩增反应的步骤包括：94℃变性4min；94℃变性解链40s、58℃退火30s实现引物和模板的结合、72℃延伸1min；72℃处理10min；以及16℃冷却处理；其中，94℃变性解链40s、58℃退火30s实现引物和模板的结合和72℃延伸1min组成了35个循环处理。
17.第三方面，本发明实施例公开了一种用于人源ly6d蛋白胞外表达的重组细胞，所述重组细胞是以expi293f细胞为宿主，将第一方面的重组表达质粒或者第二方面所述的构建方法构建得到的重组表达质粒转入所述宿主得到的。
18.在某些实施例中，所述重组细胞于胞外表达255.67mg/1000ml cells的重组人源ly6d蛋白，所述重组人源ly6d蛋白大小为34.3kd。
19.与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：
20.本发明以pcdna3.1作为基础质粒，通过在其酶切位点插入目的序列，而目的序列在包括了信号肽的核苷酸序列、目的基因序列以及标签序列，通过将该重组表达质粒转入转入expi293f细胞构建的重组细胞，能够在胞外高表达人源ly6d，表达量达到255.67mg/1000ml cells，十分利于纯化和收集该重组蛋白，为其后续研究进行生产工作提供帮助。
附图说明
21.图1是表达质粒的目的片段扩增效果图；
22.图2是重组表达质粒的wb检测结果；
23.图3是转入了重组表达质粒的重组细胞的蛋白纯化效果图。
具体实施方式
24.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明，各实施例及试验例中所用的设备和试剂如无特殊说明，均可从商业途径得到。此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
25.根据本技术包含的信息，对于本领域技术人员来说可以轻而易举地对本发明的精确描述进行各种改变，而不会偏离所附权利要求的精神和范围。应该理解，本发明的范围不局限于所限定的过程、性质或组分，因为这些实施方案以及其他的描述仅仅是为了示意性说明本发明的特定方面。实际上，本领域或相关领域的技术人员明显能够对本发明实施方式作出的各种改变都涵盖在所附权利要求的范围内。
26.为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围，在本技术中所用的表示用量、百分比的所有数字、以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此，除非特别说明，否则在说明书和所附权利要求书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。本发明中，“约”指给定值或范围的10％以内，优选为5％以内。
27.本发明下述各实施例中未特别限定温度时，则均为常温条件。常温是指四季中自然室温条件，不进行额外的冷却或加热处理，一般常温控制在10～30℃，最好是15～25℃。
28.本发明中涉及的基因、蛋白或其片段可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、植物)中产生。
29.本发明披露了一种人源ly6d重组蛋白细胞分泌表达方法及应用。下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。
30.实施例1质粒构建
31.1、目的基因
32.本技术提供的目的基因序列如下，如seq id no.1所示：
33.atggaaaccgacacactgctgctgtgggtgctgttgttgtgggtgccaggctctaccggcctgcgctgccacgtgtgcaccagctccagcaactgcaagcattctgtggtctgcccggccagctctcgcttctgcaagaccacgaacacagtggagcctctgagggggaatctggtgaagaaggactgtgcggagtcgtgcacacccagctacaccctgcaaggccaggtcagcagcggcaccagctccacccagtgctgccaggaggacctgtgcaatgagaagctgcacaac；其中，下划线为信号肽。
34.或者，本技术提供的目的基因序列如下，如seq id no.2所示：
35.atggaaaccgacacactgctgctgtgggtgctgttgttgtgggtgccaggctctaccggcctgcgctgccacgtgtgcaccagctccagcaactgcaagcattctgtggtctgcccggccagctctcgcttctgcaagaccacgaacacagtggagcctctgagggggaatctggtgaagaaggactgtgcggagtcgtgcacacccagctacaccctgcaaggccaggtcagcagcggcaccagctccacccagtgctgccaggaggacctgtgcaatgagaagctgcacaacgcaccaagcacctgtagcaagcccatgtgccccccccccgagctgcccggcggccccagcgtgttcatcttcccccccaagcccaaggacaccctgatgatcagccgcacccccgaggtgacctgcgtggtggtggacgtgagccaggacgacc
ccgaggtgcagttcacctggtacatcaacaacgagcaggtgcgcaccgcccgcccccccctgcgcgagcagcagttcaacagcaccatccgcgtggtgagcaccctgcccatcgcccaccaggactggctgcgcggcaaggagttcaagtgcaaggtgcacaacaaggccctgcccgcccccatcgagaagaccatcagcaaggcccgcggccagcccctggagcccaaggtgtacaccatgggccccccccgcgaggagctgagcagccgcagcgtgagcctgacctgcatgatcaacggcttctaccccagcgacatcagcgtggagtgggagaagaacggcaaggccgaggacaactacaagaccacccccaccgtgctggacagcgacggcagctacttcctgtacagcaagctgagcgtgcccaccagcgagtggcagcgcggcgacgtgttcacctgcagcgtgatgcacgaggccctgcacaaccactacacccagaagagcatcagccgcagccccggcaa；其中，前一段下划线为信号肽，后一段下划线标签。
36.2、基因克隆构建
37.(1)引物
38.使用primer5进行引物设计，对目的序列进行扩增，上游引物的核苷酸序列包括ggttcccggtagcaccggtgctagcctgcgctgccacgtgt(如seq id no.3所示：)，所述下游引物的核苷酸序列包括gctacaggtgcttggtgcgctagcgttgtgcagcttctcattgcacagg(如seq id no.4所示)。
39.(2)目的片段的扩增
40.1)pcr体系(50μl)(rk20705:武汉爱博泰克生物科技有限公司):
41.gloria high-fidelity pcr master mix with gc buffer25μlddh2o17μldmso1.5μl模板1.5μl上/下游引物2.5+2.5μl
42.pcr扩增反应程序：
[0043][0044]
pcr电泳效果图如图1所示。pcr产物回收参照康为世纪琼脂糖凝胶dna回收试剂盒操作。
[0045]
(3)同源重组和转化
[0046]
1)同源重组(货号：rm20523武汉爱博泰克生物科技有限公司)
[0047][0048]
标签在载体中的插入位点为nhei，可通过常规现有技术或委托第三方公司制备。
[0049]
载体酶切50μl体系:(酶切位点：ecori/xhoi)
[0050]
目的片段20μl
[0051]
ddh2o 20μl
[0052]
buffer 5μl
[0053]
ecori 2.5μl
[0054]
xhoi 2.5μl
[0055]
反应条件37℃3h。
[0056]
注：目的片段与载体比例根据回收后的浓度决定，摩尔比范围:3:1～10:1
[0057]
2)转化感受态细胞
[0058]
a.取预冷好的1.5mlep管，放在冰盒上，每管分装100μl-120μldh5
ɑ
感受态(感受态在-80℃冰箱中取，放在冰中融化)，加入10μl重组产物(预冷效果更佳)并轻柔的吸打搅拌，加好后冰上放置30min。(此过程在超净台中进行)
[0059]
b.42℃热水浴90s(严格控制时间)
[0060]
c.冰上5min
[0061]
d.加入800μl无抗lb/sob培养基(此过程在超净台中进行)
[0062]
e.37℃，220rmp摇床中复苏45min(严格控制时间)
[0063]
f.5000rmp离心3min,集菌。
[0064]
g.倒掉上清液，留大概200μl菌液，用移液器吸打混匀后加入相应抗性的平板中，倒入4-6颗玻璃珠，轻晃平板将菌液涂布均匀，倒掉玻璃珠，将平板倒置放在37℃培养箱过夜培养。(此过程在超净台中进行)。
[0065]
(4)菌液pcr鉴定
[0066]
1)菌落pcr鉴定:20μl体系(rk20604，武汉爱博泰克生物科技有限公司)
[0067][0068]
表中的首/尾通用测序引物包括：f:gacctccatagaagacaccg(如seq id no.5所示)，r:aaaggagcaacatagttaag(如seq id no.6所示)。
[0069]
pcr仪扩增反应程序：95℃/5min,(95℃/30s,58℃/30s,68℃/1min)35cycle,68℃/5min
→
4℃∞。
[0070]
(5)测序
[0071]
挑选正确的阳性克隆采用载体通用引物进行测序验证，测序正确后的重组表达质粒进行后续的蛋白表达。
[0072]
实施例2蛋白表达
[0073]
真核细胞hek293f分为瞬时转染和稳定转染，瞬时转染质粒dna进入细胞后不被整合到染色体中，以游离状态表达外源基因。瞬时转染周期短，能够快速获得目的蛋白，能够应用于研发阶段的摸索和大规模高通量筛选蛋白。expi293f(人肾胚上皮细胞)作为哺乳动物细胞高密度表达系统，被广泛应用于表达重组dna蛋白等生物制品的研究开发和规模化生产。
[0074]
一、瞬时转染
[0075]
从上述实施例提供的阳性克隆菌液中提取重组表达质粒，得其浓度为1510ng/μl的悬液，按照如下步骤进行细胞转染：
[0076]
(1)在培养基中转染前一天以1.3e6细胞/ml分离细胞,细胞体积27ml；
[0077]
(2)在转染之前，将所有试剂置于室温下；
[0078]
(3)转染前，将细胞密度调节到2.6e6/ml；
[0079]
(4)在无菌试管中用1.5ml opti-mem稀释总质粒dna(ug)30ug；
[0080]
(5)将90μl pei(1mg/ml，ph7.1)加入稀释的1.5ml opti-mem中，混匀静置5min；
[0081]
(6)将pei的混合溶液加入到dna的混合溶液中，翻转或移液混合(混匀的过程要求缓慢进行)；
[0082]
(7)在室温下孵育20分钟(不要超过)；
[0083]
(8)将dna/pei混合物加入细胞中，通过轻轻旋转将它们充分混合,混合后细胞总体积30ml；
[0084]
(9)转染后16-20小时第一次补料1.5ml，96小时后测活率及密度；
[0085]
(10)收获转染后的细胞，收集上清液添加10mm aebsf进行亲和纯化。
[0086]
二、wb验证表达
[0087]
1、样品制备：
[0088]
(1)取hek293f转染后细胞100μl 3000r/min离心10min；
[0089]
(2)离心后取上清20μl加20μl 2*loading buffer制样，97℃加热10min，命名为上清(supernatant)；
[0090]
(3)沉淀使用100μl pbs进行悬浮后20μl加20μl 2*loading buffer制样，97℃加热10min，命名为细胞(cell)；
[0091]
2、wb检测
[0092]
(1)取上样5μl进行sds-page电泳：根据目的蛋白的分子量的大小选择合适的分离胶浓度。电泳采用恒压模式，5％浓缩胶80v，当marker开始分离大约25min，调至120v，溴酚蓝至分离胶底部终止电泳；
[0093]
(2)转膜：组装顺序：转膜夹黑色面(负极)－海绵垫－3层滤纸－胶－膜－3层滤纸－海绵垫－红色面(正极)。转膜时间：200ma、90-180min；
[0094]
(3)封闭：转膜完成后标记并洗去转膜液(tbst、5minx2次)；清洗干净的膜放入盛有3％脱脂牛奶(tbst配制)的容器中，室温封闭60-90min；
[0095]
(4)6his-tag一抗孵育：封闭完成后，倒掉封闭液。加入用3％脱脂牛奶(tbst配制)1:7000稀释的一抗溶液，摇床上平缓摇动，室温孵育2h或4℃孵育过夜(4℃孵育后需室温再孵育15-30min)。一抗孵育完成后，倒掉一抗溶液；用tbst漂洗膜4次，每次5min；
[0096]
(5)二抗孵育：一抗孵育完成前，将对应一抗种属的酶标二抗1：5000稀释到实验需要的量(tbst稀释)。将清洗好的膜放入盛有二抗溶液的容器中，摇床上缓慢摇动，于室温孵育60-80min。二抗孵育完成后，倒掉二抗溶液；用tbst漂洗膜4次，每次5min；
[0097]
(6)曝光：用镊子将膜从tbst中取出，适当控干，置于凝胶托盘。用ecl solutionⅰ和solutionⅱ等体积混合，均匀加至膜上，完全覆盖。底物与膜反应约30s，置于化学发光成像系统仪。设置的曝光时间为3s；10s；30s；60s；120s。
[0098]
wb检测目的包括：蛋白表达大小是否正确；与高表达样本比较，获取蛋白表达量高/低信息；对于wb中无条带的项目，通过强曝光，如果可以出来条带判定为低表达，无条带的判断为无表达。
[0099]
wb验证结果如图2，重组表达质粒转入的蛋白在胞内外均有表达。
[0100]
三、细胞上清液液的纯化
[0101]
将wb验证重组表达质粒有分泌表达的细胞上清液采用如下步骤纯化。
[0102]
1、实验材料
[0103]
纯化柱polv-prep@chromatographycolumns：bio-rad731-1550；at protein a diamond(上海博格隆)。
[0104]
2、操作流程
[0105]
(1)孵育
[0106]
取出灭菌的10ml纯化柱管，用无内毒素水冲洗柱管1-2次。从4℃冰箱取出protein a基质，用移液器吸取0.5ml基质加入纯化柱管中，待乙醇流完后(商品化基质用20％乙醇保存)，用无内毒素水清洗6个柱体积。柱体积是指纯化柱中基质的体积，而非柱管的体积。用binding buffer平衡填料6个柱体积。将平衡好的基质加入上清管中，用封口膜封口，置于
旋转培养器上，20rpm，4℃，4hr-过夜。
[0107]
(2)流穿
[0108]
孵育结束后，将离心管配平离心，600rpm，10min，4℃。
[0109]
将离心后的上清倒入新的离心管中，即为流穿。同时留约5ml的上清用于悬浮基质，将基质转移至纯化柱管中，待流穿流完(此次流穿不用收集)。
[0110]
(3)洗杂与洗脱
[0111]
a、向纯化柱管中加入3ml washing buffer洗柱，洗下基质中的杂蛋白。重力流，流出液用灭菌的5ml ep管收集，ep管需要插在冰上保持低温。流完后用g250检测(取100μl g250于96孔板中，加入10μl正在滴出的洗脱液)，如果g250变蓝，继续加入3ml washing buffer洗柱，直到g250不变蓝，结束washing buffer预洗脱。
[0112]
b、加入0.5ml elution buffer 1洗柱，洗下与基质结合的蛋白。重力流，流出液用1.5ml无内毒素的ep管收集，收集管需放置在冰盒上保持低温，并预先加入0.5ml的1m tris(ph8.0)用于调节蛋白溶液的ph。流完后用g250检测(取100μl g250于96孔板中，加入10μl正在滴出的洗脱液)，如果g250变蓝，继续洗脱，直到g250不变蓝，结束elution buffer 1预洗脱。
[0113]
c、加入0.5ml elution buffer 2洗柱，洗下与基质结合的蛋白。重力流，流出液用1.5ml无内毒素的ep管收集，收集管需放置在冰盒上保持低温，并预先加入0.5ml的1m tris(ph8.0)用于调节蛋白溶液的ph。流完后用g250检测(取100μl g250于96孔板中，加入10μl正在滴出的洗脱液)，如果g250变蓝，继续洗脱，直到g250不变蓝，结束elution buffer洗脱。
[0114]
d.加入0.5ml elution buffer3洗柱，洗下与基质结合的蛋白。重力流，流出液用1.5ml无内毒素的ep管收集，收集管需放置在冰盒上保持低温，并预先加入0.5ml的1m tris(ph8.0)用于调节蛋白溶液的ph。流完后用g250检测(取100μl g250于96孔板中，加入10μl正在滴出的洗脱液)，如果g250变蓝，继续洗脱，直到g250不变蓝，结束elution buffer洗脱。
[0115]
e.将上面收集的流穿与洗脱液制样，一般为2*制样，即20μl蛋白+20μl 2*loading，进行sds-page电泳。
[0116]
(4)fc-tag标签纯化用缓冲液
[0117]
缓冲液名称成分binding bufferpbs,ph7.4washing bufferpbs,ph7.4elution buffer 10.1m甘氨酸，150mm nacl,ph4.0elution buffer 20.1m甘氨酸，150mm nacl,ph3.0elution buffer 30.1m甘氨酸，150mm nacl,ph2.2
[0118]
结果如图3。重组表达质粒转入expi293f细胞后得到的重组细胞的胞外表达物中分离纯化得到了分子量为34.4kd的目的蛋白，经过wb验证及亲和纯化成功鉴定为ly6d重组蛋白，蛋白纯度高，表达量约为255.67mg/1000ml cells，为其后续研究进行生产工作提供帮助。
[0119]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精
神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。