橡胶草高胶含量基因HRC1及其应用

本发明属于生物，具体涉及橡胶草高胶含量基因hrc1及其应用。

背景技术：

1、天然橡胶是一种以顺式-1,4-聚异戊二烯为主要成分的天然高分子化合物，世界上约有超过2500种不同的植物可生产类似天然橡胶的聚合物，但真正有商业应用价值的是巴西三叶橡胶树(hevea brasiliensis muell.arg.)。橡胶树的表面被割开时，树皮内的乳管细胞被割断，胶乳从乳管细胞中流出，经后期采集加工等过程，即制得市售的天然橡胶。天然橡胶在常温下具有较高的弹性、可塑性、耐屈挠性、良好的电绝缘性等，具有广泛的用途，在医疗卫生、交通运输、工业、农业、国防以及人们的日常生活中都离不开天然橡胶。由于橡胶树只能在热带和亚热带地区生长，受气候条件不适、病虫害严重、自动化程度低等影响，所产天然橡胶日趋短缺。

2、橡胶草(taraxacum kok-saghyz rodin，tks)是一种菊科蒲公英属多年生草本植物，原产于哈萨克斯坦及我国新疆等地，其多年生根部橡胶含量可高达干重的20％以上，而且胶的质量与巴西橡胶树所产橡胶相当，可直接用于生产橡胶制品。橡胶草喜冷凉气候，适应范围广，是很有发展前景的产胶植物。目前橡胶草大多是野生资源，通过基因工程改进其农艺性状、提高橡胶含量，可以实现橡胶草高胶种质的快速育种。

3、天然橡胶的生物合成是一种典型的植物类异戊二烯次生代谢途径，其合成前体主要由细胞质中的甲羟戊酸(mevalonate，mva)途径合成。首先是三分子乙酰coa经过乙酰coa酰基转移酶(acetyl-coa acetyltransferase，aact)和hmg-coa合成酶(3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-coa synthase，hmgs)催化完成两步缩合反应生成3-羟基-3-甲基-戊二酰coa(3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-coa，hmg-coa)，随后在hmg-coa还原酶(hmg-coareductase，hmgr)的作用下生成mva；mva在甲羟戊酸激酶(mevalonate kinase，mk)和磷酸甲羟戊酸激酶(phosphomevalonate kinase，mpk)的作用下被磷酸化，再经焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶(pytophosphomevalonate decarboxylase，mdc)催化脱羧生成异戊烯焦磷酸(isopentenyl pyrophosphate，ipp)。ipp由异构酶(isopentenyl pyrophosphateisomerase，ipi)催化形成二甲基烯丙基焦磷酸(dimethylallyl pyrophosphate，dmapp)，一分子ipp和一分子dmapp在异戊烯基焦磷酸转移酶催化下头-尾缩合形成牻牛儿基焦磷酸(geranyl pyrophosphate，gpp)，并在此基础上陆续加入ipp单位而得到其它异戊烯类化合物：法尼基焦磷酸(farnesyl pyrophosphate，fpp)和牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸(geranylgeranyl pyrophosphate，ggpp)。在质体中的mep(2-c-methyl-d-erythritol-4-phosphate)途径也能形成ipp和dmapp，与mva途径存在着一定程度的交叉，因此mep途径可能也是橡胶生物合成前体的来源。天然橡胶合成起始需要1分子反式构型的烯丙基焦磷酸(如dmapp、gpp、fpp或ggpp)作为起始物，在顺式-异戊烯基转移酶(cis-prenyltransferase，cpt)催化下，ipp的亚甲基与烯丙基焦磷酸二磷酸基团的解离产物作用重新生成1分子烯丙基焦磷酸末端基团，从而启动橡胶分子的生物合成，随后在小橡胶粒子蛋白(small rubber particle protein，srpp)及橡胶延伸因子(rubber elongationfactor，ref)的作用下，将成千上万个ipp掺入到聚异戊烯基焦磷酸长链上，形成不同大小的橡胶分子。对天然橡胶合成途径基因的表达进行调控可以提高天然橡胶合成的效率。

技术实现思路

1、我们从前期构建的橡胶草sare(sense/antisense rna expression)突变体库中发现了一株橡胶含量增多的突变体c112。该突变体植株早花，叶片数增多，根干重变化不大，根中乳管数量变化不大。通过分析c112突变体中的插入位点，发现并分离了一个与休眠/生长素抑制相关的基因。该基因来自橡胶草测序品系1151，在橡胶草的根、叶、花、种子等器官中都有表达，在胶乳中表达量最高。在橡胶草中过表达该基因可以提高根中的天然橡胶含量，因此将该基因命名为hrc1(high natural rubber content 1)基因。

2、基于上述研究成果，本发明提供一种核酸分子，其包含如下(a1)-(a5)的任一核苷酸序列：

3、(a1)seq id no:1所示的核苷酸序列；

4、(a2)seq id no:3所示的核苷酸序列；

5、(a3)与seq id no:1和3所示的核苷酸序列中的至少一个具有至少90％序列一致性的核苷酸序列；

6、(a4)编码seq id no:2所示的氨基酸序列的核苷酸序列；

7、(a5)编码与seq id no:2所示的氨基酸序列具有至少90％序列一致性的氨基酸序列的核苷酸序列；

8、其中所述核酸分子能够赋予包含所述核酸分子的橡胶草高橡胶含量。

9、包含上述核酸分子的表达盒、载体或宿主菌也属于本发明的保护范围。

10、所述载体可以是克隆载体，包含橡胶草高胶含量基因hrc1以及质粒复制所需的其它元件。所述载体也可以是表达载体，包含橡胶草高胶含量基因hrc1以及能够使蛋白成功表达的其它元件。在一些实施例中，所述表达载体为插入了橡胶草高胶含量基因hrc1的pb7wg2d载体。

11、所述宿主菌可以是包含克隆载体的宿主菌，例如e.coli dh5α，通过在适当的条件下培养细菌，使橡胶草高胶含量基因hrc1得到复制；也可以是包含表达载体的宿主菌，例如根癌农杆菌agl1，通过根癌农杆菌介导的遗传转化技术将表达载体转入橡胶草受体材料中，获得转基因橡胶草植株。

12、上述核酸分子在培育高橡胶含量的橡胶草植株中的应用也属于本发明的保护范围。

13、上述核酸分子在天然橡胶生产中的应用也属于本发明的保护范围。

14、本发明还提供一种获得高橡胶含量的橡胶草植株的方法，其特征在于，包括：增强橡胶草中蛋白质的编码基因的表达，得到高橡胶含量的橡胶草植株；所述蛋白质为如下(b1)或(b2)：

15、(b1)氨基酸序列如seq id no:2所示的蛋白质；

16、(b2)seq id no:2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加获得的具有相同功能的蛋白质。

17、所述蛋白质的编码基因为上述核酸分子。

18、在本发明的一些实施例中，通过向橡胶草受体材料中导入包含上述核酸分子的过表达载体，获得高橡胶含量的橡胶草植株。

19、在本发明的一些实施例中，所述过表达载体通过农杆菌介导到所述橡胶草受体材料中。

20、所述橡胶草受体材料可以是橡胶草1151品系。

21、本发明还提供一种生产天然橡胶的方法，包括：采用任一上述方法获得高橡胶含量的转基因橡胶草植株，培养所述转基因橡胶草植株并提取根中的天然橡胶。

22、本发明还提供一种蛋白质，为如下(b1)或(b2)：

23、(b1)氨基酸序列如seq id no:2所示的蛋白质；

24、(b2)seq id no:2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加获得的具有相同功能的蛋白质。

25、本发明分离的hrc1基因属于休眠/生长素抑制蛋白基因家族，具有一个auxinrepress保守结构域，编码一个大小为13.3kd的完整的休眠/生长素相关蛋白(dormancy/auxin associated protein,drm/arp)，其氨基酸序列如seq id no:2所示。实验结果显示，橡胶草1151品系中过表达hrc1基因可以提高橡胶草根中天然橡胶的含量，并且在橡胶含量升高突变体c112的根中部分天然橡胶合成途径关键酶基因表达量升高，表明hrc1基因参与了天然橡胶合成途径中部分关键酶基因的表达调控。因此，hrc1基因可用于提高橡胶草根中橡胶含量的遗传改良，为高胶含量橡胶草新品种的培育提供了新的基因资源，为研究天然橡胶合成途径的调控提供了新思路。