一种功能化修饰MOF载体固定化漆酶及其制备方法和应用

一种功能化修饰mof载体固定化漆酶及其制备方法和应用
技术领域
1.本发明属于酶制备技术领域，尤其涉及一种功能化修饰mof载体固定化 漆酶及其制备方法和应用。


背景技术：

2.漆酶是一种胞外铜酶，属于铜蓝氧化酶，又名酚酶、多酚氧化酶、漆酶氧 化酶等，是纺织、食品、造纸工业中广泛使用的生物催化剂。目前为止，国内 外研究人员对漆酶的各类研究已有一百多年的历史，是人类所开发的最早的酶 之一，自1883年首次从漆树漆液发现后，有关漆酶的研究从未停止。最初研 究人员认为漆酶只存在与植物界，但是随着科学的发展、科研条件的逐步完善 以及生物学的深入发展，漆酶已经被证实广泛存在与植物、动物、真菌和细菌 中。
3.漆酶由约500个氨基酸(aa)残基的多肽序列组成，并与糖分子相连。 aa残基排列在三个类似的β-桶型结构域中，这些结构域与蓝色铜蛋白相关。 漆酶通常有一个中心铜原子，三个外部铜原子与其结构的特定位点结合，而没 有其他辅助因子。这些铜根据其光谱和顺磁性质可分为三类氧化还原基团： type-1(t1)，type-2(t2)和type-3(t3)。t1铜是一个单核铜，位于3域， 它与组氨酸、半胱氨酸等氨酸残基结合，是主要的氧化位点。一个t2铜和两 个t3铜排列在一个三核铜簇中，其中心嵌入在结构域1和3的界面处，在那 里它们与组氨酸配位，在此处发生分子氧的还原。组氨酸-半胱氨酸-组氨酸三 肽连接t1和t2/t3，半胱氨酸-半胱氨酸的二硫键结合结构域1和2，以及结 构域1和3，长环桥接结构域2和3，提供稳定的结构。
4.随着全球经济的快速发展，水污染成为一个令人担忧的环境问题。印染废 水进入生态循环对人类健康和环境造成了严重威胁。近年来，水环境中染料的 去除(尤其是有芳香结构，物理化学稳定性的cr，即刚果红)备受人们关注。 漆酶因其降解污染物的效率高和底物多样性且环境友好而吸引研究者的关注。 然而，游离漆酶存在抗环境稳定性差、循环利用性低、降解性能差等一系列问 题，限制了其实际应用。


技术实现要素：

5.有鉴于此，本发明的目的在于提供一种功能化修饰mof载体固定化漆酶 及其制备方法和应用，采用本发明提供的制备方法制备得到的功能化修饰 mof载体固定化漆酶提高了抗环境稳定性、循环利用性和降解性能等。
6.为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
7.本发明提供了一种功能化修饰mof载体固定化漆酶的制备方法，包括以 下步骤：
8.1)将方酸溶液与金属离子溶液和/或氨水混合得到沉淀，进行水热反应合 成cocu-mof-h或cocu-mof-nh2，得到的mof材料通过氢氧化钠溶液进 行碱刻蚀获得功能化修饰的mof材料；
9.所述金属离子溶液中含有铜离子和/或钴离子；
10.2)将所述步骤1)得到的功能化修饰的mof材料经超声分散到乙醇中， 通过硅烷化，经洗涤干燥后获得功能化修饰的硅烷化mof材料；将其分散到 水中，再与戊二醛混合，将所述混合物进行搅拌反应30min后，再加入一定量 漆酶溶液，经固定化反应后获得mof固定化漆酶；
11.所述混合物中戊二醛的质量百分含量为0.5～2.5％；
12.3)将所述步骤2)得到的功能化修饰的mof材料与漆酶混合，在ph值 为4、温度为60℃下反应结束后，离心、洗涤、冷冻干燥，得到功能化修饰 mof载体固定化漆酶；
13.所述功能化修饰的mof材料的质量与漆酶的体积比为50mg:5～10ml。
14.优选的，当所述步骤1)金属离子溶液中含有铜离子时，所述沉淀的制备 包括：将方酸与水、氨水、二水合氯化铜混合、水热反应，得到沉淀；
15.所述方酸的质量与水的体积、氨水的体积、二水合氯化铜的质量比为 433mg:10ml:0.75～1.25ml:649.5mg。
16.优选的，当所述步骤1)金属离子溶液中含有铜离子和钴离子时，所述沉 淀的制备包括：将方酸与水、六水合硝酸钴、二水合氯化铜混合、水热反应， 得到水热反应物；
17.将所述水热反应物与氢氧化钠溶液混合后进行刻蚀，得到功能化修饰的 mof材料；
18.将所述功能化修饰的mof材料分散到醇试剂中，得到悬浊液；
19.将所述悬浊液与3-氨基丙基三乙氧基硅烷混合、振荡反应，得到沉淀。
20.优选的，所述氢氧化钠的浓度为0.025-0.075mol/l；
21.所述水热反应物的质量与氢氧化钠溶液的体积比为0.5g:20ml；
22.所述刻蚀的时间为10-25min。
23.优选的，所述步骤1)水热反应的条件包括：温度为80℃，时间为8h； 所述水热反应在聚四氟乙烯的内胆中进行。
24.优选的，所述功能化修饰的mof材料的质量与醇试剂的体积比为 0.5g:50ml；
25.所述分散采用超声分散，所述超声分散的时间为30min；
26.所述醇试剂包括乙醇。
27.优选的，所述悬浊液与3-氨基丙基三乙氧基硅烷的体积比为100:1；
28.所述振荡反应的条件包括：温度为70℃，转速为180rpm，时间为10h。
29.优选的，所述步骤2)功能化修饰的硅烷化mof材料的质量与水的体积 比为50mg:10-15ml；
30.所述固定化反应时间为2-5h。
31.本发明还提供了上述技术方案所述的制备方法制备得到的功能化修饰 mof载体固定化漆酶。
32.本发明还提供了上述技术方案所述的功能化修饰mof载体固定化漆酶在 降解刚果红和活性蓝19中的应用。
33.本发明的有益效果为：
34.引入带有特定官能团或特定功能的物质实现mofs材料功能化修饰，有效 提升固定化平台的性能。预功能化处理添加氨水和低浓度碱刻蚀均会改变 mof形貌结构，增加粗糙度与表面活性位点，使更多的酶固定在载体材料表 面。mofs上的氨基功能化对漆酶有很
高的亲和力，对于提高酶载量与酶活性 有积极的作用。低浓度碱刻蚀材料固定化漆酶增强底物亲和力，提高酶促反应 速率，载体修饰后酶催化剂对cr的去除更加高效，快速，且六次循环后降解 效率仍保持90％。
附图说明
35.图1为本发明设计思路与研究内容；
36.图2为cu-mof-nh2和lac-cu-mof-nh2(a-b)和cocu-mof-oh和 lac-cocu-mof-oh-aptes(c-d)的xrd图谱；
37.图3为cu-mof-nh2、lac-cu-mof-nh2、cocu-mof-oh与 lac-cocu-mof-oh-aptes的ftir图谱；
38.图4为不同氨水添加量的cu-mof-nh2(a-f)和cocu-mof-oh(g)的 扫描电镜图像；lac-cu-mof-nh2(h)和lac-cocu-mof-oh-aptes(i)的 clsm模式；
39.图5为lac-cu-mof-nh2(a)和lac-cocu-mof-oh-aptes(b)元素 分布；cu-mof-nh2(c)、lac-cu-mof-nh2(d)和lac-cocu-mof-oh-aptes (e)eds图谱；
40.图6为cu-mof-nh2、lac-cu-mof-nh2、cocu-mof-oh和 lac-cocu-mof-oh-aptes的tga分析；
41.图7为cu-mof-nh2、lac-cu-mof-nh2、cocu-mof-oh和 lac-cocu-mof-oh-aptes全谱(a-d)、c 1s(e-f)、o 1s(g-h)、co 2p(i)、 cu 2p(j-k)、n 1s(l-m)、cu lmm(n-o)的xps谱图；
42.图8为氨水添加量对lac-cu-mof-nh2(a)及刻蚀浓度及时间对 lac-cocu-mof-oh-aptes(b-c)酶载量及酶活的影响；lac-cu-mof-nh2(d-f) 和lac-cocu-mof-oh-aptes(g-i)固定化条件优化；
43.图9为ph(a-c)和温度(b-d)对漆酶活性的影响；
44.图10为游离漆酶、lac-cu-mof-nh2和lac-cocu-mof-oh-aptes在ph 值(a-b)，温度(c-d)，重复使用性(e-f)，储存时间(g-h)下的稳定性；
45.图11为ph＝7时lac-cu-mof-nh
2-t和lac-cocu-mof-oh-aptes-t一 级吸附动力学(a-b)与二级吸附动力学(c-d)；
46.图12为ph＝3.5时lac-cu-mof-nh
2-t和lac-cocu-mof-oh-aptes-t 一级吸附动力学(a-b)与二级吸附动力学(c-d)；
47.图13为lac-cu-mof-nh2和lac-cocu-mof-oh-aptes在ph＝3.5(a) 和ph＝7(b)下对cr降解动力学；lac-cu-mof-nh2和 lac-cocu-mof-oh-aptes对活性蓝19降解动力学(c)；lac-cu-mof-nh
2 (d)和lac-cocu-mof-oh-aptes在ph＝3.5下对cr循环降解特性(e)；
48.图14为cr降解路径分析。
具体实施方式
49.本发明提供了一种功能化修饰mof载体固定化漆酶的制备方法，包括以 下步骤：
50.1)将方酸溶液与金属离子溶液和/或氨水混合得到沉淀，进行水热反应合 成cocu-mof-h或cocu-mof-nh2，得到的mof材料通过氢氧化钠溶液进 行碱刻蚀获得功能化修饰的mof材料；
51.所述金属离子溶液中含有铜离子和/或钴离子；
52.2)将所述步骤1)得到的功能化修饰的mof材料经超声分散到乙醇中， 通过硅烷化，经洗涤干燥后获得功能化修饰的硅烷化mof材料；将其分散到 水中，再与戊二醛混合，将所述混合物进行搅拌反应后，再加入一定量漆酶溶 液，经负载后获得mof固定化漆酶；
53.所述混合物中戊二醛的质量百分含量为0.5～2.5％；
54.3)将所述步骤2)得到的功能化修饰的mof材料与漆酶混合，在ph值 为4、温度为60℃下反应2～5h，离心、洗涤、冷冻干燥，得到功能化修饰mof 载体固定化漆酶；
55.所述功能化修饰的mof材料的质量与漆酶的体积比为50mg:5～10ml。
56.本发明将方酸溶液与金属离子溶液混合、水热反应或与氢氧化钠溶液进行 刻蚀，得到沉淀；所述金属离子溶液中含有铜离子和/或钴离子。
57.在本发明中，当所述金属离子溶液中含有铜离子时，所述沉淀的制备优选 包括：将方酸与水、氨水、二水合氯化铜混合、水热反应，得到沉淀。在本发 明中，所述方酸的质量与水的体积、氨水的体积、二水合氯化铜的质量比优选 为433mg:10ml:0.75～1.25ml:649.5mg。本发明优选将方酸与水混合后再滴加氨 水，直至溶液透明澄清，再加入二水合氯化铜。
58.在本发明中，当所述金属离子溶液中含有铜离子和钴离子时，所述沉淀的 制备优选包括：将方酸与水、六水合硝酸钴、二水合氯化铜混合、水热反应， 得到水热反应物；将所述水热反应物与氢氧化钠溶液混合后进行刻蚀，得到刻 蚀物；将所述刻蚀物分散到醇试剂中，得到悬浊液；将所述悬浊液与3-氨基丙 基三乙氧基硅烷混合、振荡反应，得到沉淀。在本发明中，所述氢氧化钠的浓 度优选为0.05mol/l。在本发明中，所述水热反应物的质量与氢氧化钠溶液的 体积比优选为0.5g:20ml。在本发明中，所述刻蚀的时间优选为15min。在本 发明中，所述刻蚀物的质量与醇试剂的体积比优选为0.5g:50ml。在本发明中， 所述分散优选采用超声分散，所述超声分散的时间为30min。在本发明中，所 述醇试剂优选包括乙醇。在本发明中，所述悬浊液与3-氨基丙基三乙氧基硅烷 (aptes)的体积比优选为100:1。在本发明中，所述振荡反应的条件优选包 括：温度为70℃，转速为180rpm，时间为10h。在本发明中，所述振荡反应 结束后优选采用乙醇:水＝1:1洗涤多次，去除未结合的3-氨基丙基三乙氧基硅 烷，在室温下干燥，得到金属-mof-oh-aptes。
59.在本发明中，所述水热反应的条件优选包括：温度为80℃，时间为8h。 在本发明中，所述水热反应优选在聚四氟乙烯的内胆中进行。
60.本发明将得到的搅拌反应物与漆酶混合，在ph值为4、温度为60℃下反 应2～5h，离心、洗涤、冷冻干燥，得到功能化修饰mof载体固定化漆酶；所 述功能化修饰的硅烷化mof材料的质量与漆酶的体积比为50mg:5～10ml。
61.下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它 们理解为对本发明保护范围的限定。
62.实验测试方法：
63.1.材料表征
64.使用x射线衍射仪(xrd，miniflex600，rigaku，japan)表征样品的晶 体学特性，波长扫描范围为10
°‑
40
°
；傅立叶变换红外吸收光谱仪(ftir，nicolet5700_*，thermo nicolet corporation，usa)表征样品的表面官能团，光谱范 围为4000～400cm-1
；扫描电子
显微镜(sem，flexsem1000，hitachi，japan) 表征样品表面形态；热重分析仪(tga，mettler 851e，mettler toledo， switzerland)表征样品热稳定性，在n2氛围下从室温加热到800℃，气体流 速为10℃/min；x射线光电子能谱(xps，thermo escalab 250xi，thermoscientific，usa)表征样品的元素组成及元素化学态；激光共聚焦显微镜(clsm， lsm700，thermo scientific，usa)表征fitc荧光标记的漆酶在mof材料 中成功固定。
65.2.酶活测试
66.通过监测abts的氧化速率来测定游离酶和固定化酶的活性，一个单位的 漆酶活性定义为在实验条件下每分钟氧化1μmolabts所需的酶量，1u。
67.2.1游离酶
68.对于游离酶，反应体系中加入3.5ml乙酸-乙酸钠缓冲溶液(ph＝4.0)和 0.2ml漆酶样品，孵育30min，再加入0.3mlabts(5mm)。通过在420nm 波长处吸光度的变化，监测abts在40℃的氧化速度(ε
420
＝36000 l
·
mol-1
·
cm-1
)，使用公式(2-1)计算酶活性，实验平行进行3次。
[0069][0070]
式中δod/δt为单位时间内吸光度值的变化量；n为酶的稀释倍数；v
t
为酶促反应的总体积，4ml；v
l
为加入反应体系的酶液体积，ml；t为反应时 间，min；ε为底物abts在420nm处的消光系数36000l
·
mo1-1
·
cm-1
；l为比 色皿的光程，1cm。
[0071]
2.2固定化酶
[0072]
对于固定化漆酶，反应体系中加入3.7ml乙酸-乙酸钠缓冲溶液(ph＝4)， 孵育30min，再加入0.3mlabts(5mm)，通过在420nm波长处吸光度的变 化，监测abts在50℃的氧化速度，并使用公式(2-2)计算酶活性。
[0073][0074]
式中δod/δt为单位时间内吸光度值的变化量；n为酶的稀释倍数；v
t
为酶促反应总体积，4ml；v
l
为加入反应体系的酶液体积，ml；t为反应时间， min；ε为底物abts在420nm处的消光系数36000l
·
mo1-1
·
cm-1
；m0为固定 化漆酶的质量，g；l为比色皿的光程，1cm。
[0075]
3.酶载量
[0076]
考马斯亮蓝法测定反应前后上清液中的蛋白质总含量，并使用公式(2-3) 计算酶载量。
[0077][0078]
式中m1为酶的添加量，g；ma为固定后上清中酶的总量，g；m
t
为固定后 材料的总质量，g。
[0079]
4.最适条件测定
[0080]
在ph值为4.0-9.0和温度范围为20-60℃的条件下测定，游离漆酶和固定 化漆酶活性，实验平行进行了三次，使用公式(2-1)(2-2)计算酶活。
[0081]
5.稳定性研究
[0082]
5.1 ph和温度稳定性
[0083]
在ph值为4.0-9.0和温度范围为40-90℃的条件下孵育1h，游离漆酶和 固定化漆酶活性，实验平行进行了三次，使用公式(2-1)(2-2)计算酶活。
[0084]
5.2重复利用性
[0085]
将一定量的样品分散于3.7ml醋酸缓冲溶液(ph＝4)在50℃孵育，再加 入0.3mlabts。反应结束时，用蒸馏水洗涤mof上的abts
+
，然后加入缓 冲液和abts溶液，开始一个新的循环。循环过程重复六次，每组实验平行进 行三次。
[0086]
5.3储存稳定性
[0087]
将游离漆酶和固定化漆酶样品在4℃冰箱中保存30天，每隔5天测定残 留活性，实验平行进行了三次。
[0088]
6.吸附性能研究
[0089]
固定化酶lac-cu-mof-nh2、lac-cocu-mof-oh-aptes经80℃过夜热 处理，确保酶完全失活，命名为lac-cu-mof-nh
2-t、 lac-cocu-mof-oh-aptes-t。
[0090]
取50mg材料(lac-cu-mof-nh
2-t、lac-cocu-mof-oh-aptes-t)置 于100ml、100mg/l的cr溶液中，在40℃和150rpm条件下震荡，吸附平 衡后，取样过0.45μm滤膜后测定吸光值。计算吸附容量：
[0091][0092]
式中：c0为cr的初始浓度，mg/l；c
t
表示在时间t溶液中cr的浓度， mg/l；q
t
指每克材料上吸附的cr的质量，mg/g；m表示吸附材料的质量，g； v表示cr溶液的体积，ml。
[0093]
6.1吸附动力学
[0094]
将50mg样品加入100ml、100mg/l的cr溶液中，溶液ph分别调节 为3.5和7；将溶液在50℃下150rpm/min下震荡降解，每隔一段时间取样直 到平衡，然后根据公式(2-4)计算吸附量，根据文献报道的准一级动力学和 准二级动力学公式拟合吸附实验的动力学，公式如下：
[0095]
ln(q
e-q
t
)＝lnq
e-k1t
ꢀꢀꢀ
(2-5)
[0096][0097]
式中，qe表示吸附平衡时吸附剂上cr的吸附量，mg/g；q
t
表示时间t时 吸附到材料上的cr吸附量，mg/g；k1是准一级吸附动力常数，min-1
；k2表示 准二级动力学常数，g/(mg
·
min)。
[0098]
7.固定化酶吸附降解染料
[0099]
取50mg固定化酶置于100ml、100mg/l cr溶液中，溶液ph分别调节 为3.5和7；将溶液在50℃下150rpm/min下震荡降解，每隔一段时间取样过 0.45μm滤膜后测定吸光值。
[0100]
循环实验操作：将使用过的催化剂离心，经去离子水洗涤后，冷冻干燥， 将回收的催化剂，按照降解实验相同方法重复测试，得到循环实验结果，循环 降解6次。
[0101]
8.数据分析
[0102]
试验共设3个重复，测定重复平均值和标准差，使用microsoft excel 2019 和origin 2021对数据进行方差分析。
[0103]
实施例1
[0104]
实验方法：
[0105]
1.水热法合成mof
[0106]
cocu-mof-h的合成：方酸(259mg，2.27mmol)在80℃下溶解在15ml 去离子水中，六水合硝酸钴(396.3mg，1.362mmol)和二水合氯化铜(155.3 mg，0.908mmol)室温下溶解在5ml去离子水中，将含铜溶液加入到方酸溶 液中，待有沉淀析出，将其转移到聚四氟乙烯的内胆中，80℃水热8h。
[0107]
2.功能化修饰mof合成
[0108]
cu-mof-nh2的合成：方酸(433mg，3.80mmol)室温下加入10ml去离 子水搅拌，再滴加适量的氨水，直至溶液透明澄清，加入二水合氯化铜(649.5 mg，3.80mmol)，待有沉淀析出，将其转移到聚四氟乙烯的内胆中，80℃水 热8h。
[0109]
cocu-mof-oh的合成：取0.5g的cocu-mof-h样品加入低浓度的naoh， 刻蚀一定时间，抽滤分离，清洗至中性，烘干，收集备用。
[0110]
3.功能化修饰mof固定化漆酶
[0111]
cocu-mof-oh硅烷化修饰：采用表面活性剂3-氨基丙基三乙氧基硅烷 (aptes)对材料进行硅烷化。将合成的材料(0.5g)加入在50ml乙醇中， 超声分散30min，获得均匀的悬浊液。然后在70℃加入0.5mlaptes，摇床 180rpm的剧烈搅拌下进行10h，最后用乙醇：水＝1：1洗涤多次，去除未结 合的aptes，并在室温下干燥，获得cocu-mof-oh-aptes。
[0112]
cu-mof-nh2、cocu-mof-oh-aptes固定化漆酶：取50mg样品分散在 去离子水中，加入一定量25％的戊二醛，搅拌反应30min，再加一定量的漆 酶溶液，控制总体积为20ml，待反应结束，离心洗涤，冻干，4℃冰箱冷冻 保存，获得lac-cu-mof-nh2、lac-cocu-mof-oh-aptes。
[0113]
性能测试结果：
[0114]
1结构与形貌分析
[0115]
1.1 xrd
[0116]
cu-mof-nh2(a-b)和cocu-mof-oh(c-d)的xrd谱图如图2所示。 图2中a显示随着氨水添加量的逐渐增加cu-mof-nh2的主峰先增强后发生 位移再减弱，由原来与cu-mof-h相同的23
°
转变到12
°
。从图2中c看出随 着刻蚀碱浓度逐渐增大cocu-mof-oh的主峰先增强后减弱，并且在12.3
°
处 出现新的小峰强度不断增强。综合分析经过预功能化添加氨水处理与合成后修 饰碱刻蚀处理，材料结构均会成为mof晶体与金属氢氧化物的复合物。 cocu-mof-oh经过aptes硅烷化得到的cocu-mof-oh-aptes与 cocu-mof-oh衍射角一致，说明硅烷化不改变mof的晶体结构。经过 cu-mof-nh2与lac-cu-mof-nh2、cocu-mof-oh与 lac-cocu-mof-oh-aptes的xrd图谱比较发现，固定化酶不改变mof材 料的晶体结构。
[0117]
1.2 ftir
[0118]
cu-mof-nh2、lac-cu-mof-nh2、cocu-mof-oh与 lac-cocu-mof-oh-aptes的ftir光谱表征如图3。3000-3400cm-1
处的宽吸 收峰归因于o-h。样品在3400cm-1
和1550cm-1
处的特征吸收带分别归因于表 面吸附水的拉伸和弯曲振动。在1600-1300cm-1
区域观察到两个强吸收带，可 以归因于方酸阴离子的羧基对称和不对称的伸缩振动，而方酸阴离子是通过双 齿配位与铜钴离子结合的。在1500cm-1
处观察到的强吸收带，可归因于c＝c 和c＝o。mof在
450-830cm-1
的吸收峰归因于co-o和cu-o。cu-mof-h经 过预功能化氨水处理合成的cu-mof-nh2峰出现在3371、1479、1000-1168cm-1
， 这可以归因于n-h伸缩振动、c-n反对称伸缩振动以及nh2和nh耦合模式， 说明氨水改性成功。酶固定化后这些对应位置峰都有所增强，并且3000-3700 cm-1
的峰变宽，说明酶固定化的成功。aptes改性后的cocu-mof-oh表面 1140cm-1
和1030cm-1
处的带峰分别对应si-o-m纵向光学和横向光学拉伸模 式，在1100cm-1
处的峰值与si-o-c模式有关。在2800-3000cm-1
区域的条带 属于ch2拉伸。漆酶固定化后1620cm-1
处的吸收峰增强归因于酰胺i带c＝o 伸缩振动。3300cm-1-3500cm-1
吸收峰增强归因于酰胺ii带n-h伸缩振动，由 此证实该漆酶被成功地固定在mof载体材料上。
[0119]
1.3 sem
[0120]
为观察样品表观形貌，在相同尺度(10.0μm)下观察样品的sem扫描图 像，结果如图4。cu-mof-nh2(图4中a-f)随着氨水量的增加材料形貌发生 转变，从原来的片层结构转变为块状结构，这与xrd结果一致，cocu-mof-oh (g)也是表面粗糙的块状立方体结构。lac-cu-mof-nh2(h)和 lac-cocu-mof-oh-aptes(i)的共聚焦激光显微镜表征表明fitc标记的漆 酶固定在材料颗粒的表面，证明了酶固定化的成功。
[0121]
1.4 eds
[0122]
如图5lac-cu-mof-nh2(a)和lac-cocu-mof-oh-aptes(b)元素分 布分析表明，材料组成的各元素分布均匀，且固定化后材料表面略显粗糙，但 是不改变整体的形貌结构，与xrd固定化前后不改变晶体结果的表征结果一 致。cu-mof-nh2(a)eds图谱中氨水改性引入了n，说明氨基功能化成功， lac-cu-mof-nh2(b)和lac-cocu-mof-oh-aptes(c)中n含量增加，使 由于酶的固定的引入的氨基与酰胺基。
[0123]
1.5 tga
[0124]
为分析材料的热稳定性，进行tga表征，结果如图6所示。cu-mof-nh2、 lac-cu-mof-nh2、cocu-mof-oh和lac-cocu-mof-oh-aptes一样有三个 阶段的失重，分别对应于客体水分子的损失、配位水的去除、对应于连续相变。 cu-mof-nh2、lac-cu-mof-nh2、cocu-mof-oh和 lac-cocu-mof-oh-aptes最终质量分别保持为47.31％、43.57％、42.58％、 38.47％不变。结果表明，由于酶分子的分解，固定化酶的最终质量剩余小于载 体的质量剩余，也验证了酶固定化的成功，而且经过载体修饰有效改变了 cu-mof-h与cocu-mof-h的热稳定性。
[0125]
1.6 xps
[0126]
为确定cu-mof-nh2、lac-cu-mof-nh2、cocu-mof-oh和 lac-cocu-mof-oh-aptes的元素组成以及各元素的主要存在形式进行xps 分析，结果如图7所示。lac-cu-mof-nh2(图7中b)、 lac-cocu-mof-oh-aptes(图7中d)与cu-mof-nh2(图7中a)、 cocu-mof-oh(图7中c)的全谱比较发现，n 1s峰增加，这归因于被固定 漆酶的氨基与酰胺基，从而验证了漆酶被成功固定。图7中e-f描述了 cu-mof-nh2、lac-cu-mof-nh2、cocu-mof-oh和 lac-cocu-mof-oh-aptes的c1s光谱，均在284.8、286.3和288.8ev处有 峰，分别对应于c-c、c-o和c＝o。o 1s光谱(图7中g-h)在531.8、533.2 和536.2ev处有峰，它们分别与c-o、表面吸附氧或配位晶格氧(c-o-cu) 以及配位h2o中的氧相关。co 2p光谱(图7中i)有两个双自旋轨道(782.3、 797.3ev和784.3、799.3ev)和两个双卫星峰(788.4、803.4ev和790.5、805.5 ev)，从而证实了mof结构中存在co
2+
和co
3+
。cu 2p(图7中j-k)光谱中 三个自旋轨道双峰分别是2p 1/2
(953.5、955.6和960.6ev)和2p 3/2(934.1、 936.4和940.8ev)，以及两个cu
2+
卫星峰(963.7和944.5ev)。cu-mof-nh
2 (图7中l)的n1s仅在400.0ev处出峰，对应于功能化-nh2；lac-cu-mof-nh
2 (图7中l)和lac-cocu-mof-oh-aptes(图7中m)的均在400.0ev和402.0 ev出峰，分别对应于氨基与酰胺基。lac-cu-mof-nh2和 lac-cocu-mof-oh-aptes铜的俄歇谱分析(图7中n-o)拟合两个峰(916.8 ev和917.7ev)，这表明在mof材料中，由于电子离域现象，存在cu
+
和cu
2+
， mof结构含有cu-o和cu-cu两种结合方式，金属离子均呈现多个价态。酶 固定化后c、o含量增多，与eds数据分析结果一致，并且各种存在形式分 布发生微妙变化；固定化前后cu、co的价态分布有较大差距，一价含量显著 升高，说明酶是通过氨醛缩合和金属配位固定于载体材料之上。
[0127]
2固定化条件优化
[0128]
2.1氨水添加量
[0129]
lac-cu-mof-nh2(图8中a)随着氨水量的增加，酶载量先增加再维持 稳定，酶活性先增加后减小。0.75-1.00ml是快速变化阶段，酶载量由100.39 mg/g提升至128.48mg/g，提升了27.98％。由xrd分析可知在这个阶段材料 晶型与晶面发生变化，sem可以清晰看到，在此阶段，材料由原来的光滑片 层转变为表面粗糙的块状结构，增加了材料的表面粗糙度与表面活性官能团的 数量，所以酶活性与酶载量才会持续增加。
[0130]
2.2刻蚀浓度及时间
[0131]
随着刻蚀碱浓度的增加，lac-cocu-mof-oh-aptes(图8中b)酶载量 与酶活性均先增加后减小，0.05mol/l最佳，酶载量达到127.84mg/g。随着刻 蚀时间增加(图8中c)酶载量与酶活性均先增加后减小，15min时最佳，酶 载量达到127.84mg/g，0.75-1.00ml是快速变化阶段，酶载量由100.39mg/g 提升至135.47mg/g。
[0132]
2.3戊二醛浓度
[0133]
交联剂浓度对于酶载量以及固定酶的活性有很大的影响。如图8中d和图 8中g所示，lac-cu-mof-nh2和lac-cocu-mof-oh-aptes的相对酶活与酶 载量随着戊二醛浓度的变化趋势相同，均先增加后减小。戊二醛终浓度为2.5％ 时lac-cu-mof-nh2的酶载量达到135.32mg/g，且此时达到最大酶活，所以 选择2.5％戊二醛为实验终浓度；戊二醛浓度为1％时 lac-cocu-mof-oh-aptes的酶载量达到134.58mg/g，且此时达到最大酶活， 所以选择1％戊二醛为实验终浓度。由此可以看出，修饰后载体材料有更多的 活性位点可以与戊二醛连接。戊二醛的浓度过低，不能有效利用载体材料的结 合位点，造成浪费，戊二醛浓度过高，在交联的过程中会影响酶的空间结构， 造成酶三维构象的改变，从而使酶失活，所以合适的交联剂浓度的选择至关重 要。
[0134]
2.4固定化时间
[0135]
交联时间是控制酶固定化纳米颗粒效率的另一个关键参数。如图8中e和 图8中h所示，lac-cu-mof-nh2和lac-cocu-mof-oh-aptes的相对酶活随 着固定化时间的延长均先增加后减小。当固定时间为3h时lac-cu-mof-nh2的酶载量达到181.73mg/g，且此时达到最大酶活，所以选择3h为 lac-cu-mof-nh2固定化时间；当固定时间为2h时 lac-cocu-mof-oh-aptes的酶载量达到137.28mg/g，且此时达到最大酶活， 所以选择2h为lac-cocu-mof-oh-aptes固定化时间。随着固定化时间的延 长酶载量并没有提高，反而由于实验过程的机械搅拌，残余戊二醛等因素，降 低酶活性。
[0136]
2.5酶添加量
[0137]
为充分利用漆酶，避免漆酶的浪费，研究漆酶加入量对固定化效果的影响。 随着酶用量的增加，酶载量和酶活性均有所增加。当漆酶用量为7ml时， lac-cu-mof-nh2(图8中f)漆酶的酶载量达到161.80mg/g，相对酶活达到 100％。当漆酶用量为5ml时，lac-cocu-mof-oh-aptes(图8中i)漆酶的 酶载量达到129.92mg/g，相对酶活达到93.37％。继续添加酶，固定化酶活性 和酶载量增长幅度不大，趋于稳定，提高酶的添加量提高成本但对提高材料性 能没有作用，因此lac-cu-mof-nh2酶添加量选择7ml， lac-cocu-mof-oh-aptes酶添加量选择5ml。
[0138]
实施例2
[0139]
制备方法：
[0140]
1.水热法合成mof
[0141]
cocu-mof-h的合成：方酸(259mg，2.27mmol)在80℃下溶解在15ml 去离子水中，六水合硝酸钴(396.3mg，1.362mmol)和二水合氯化铜(155.3 mg，0.908mmol)室温下溶解在5ml去离子水中，将含铜溶液加入到方酸溶 液中，待有沉淀析出，将其转移到聚四氟乙烯的内胆中，80℃水热8h。
[0142]
2.功能化修饰mof合成
[0143]
cu-mof-nh2的合成：方酸(433mg，3.80mmol)室温下加入10ml去离 子水搅拌，再滴加1ml氨水，直至溶液透明澄清，加入二水合氯化铜(649.5mg， 3.80mmol)，待有沉淀析出，将其转移到聚四氟乙烯的内胆中，80℃水热8h。
[0144]
cocu-mof-oh的合成：取0.5g的cocu-mof-h样品加入20ml 0.05mol/lnaoh溶液，刻蚀15min，抽滤分离，清洗至中性，烘干，收集备用。
[0145]
3.功能化修饰mof固定化漆酶
[0146]
cocu-mof-oh硅烷化修饰：采用表面活性剂3-氨基丙基三乙氧基硅烷 (aptes)对材料进行硅烷化。将合成的材料(0.5g)加入在50ml乙醇中， 超声分散30min，获得均匀的悬浊液。然后在70℃加入0.5mlaptes，摇床 180rpm的剧烈搅拌下进行10h，最后用乙醇：水＝1：1洗涤多次，去除未结 合的aptes，并在室温下干燥，获得cocu-mof-oh-aptes。
[0147]
cu-mof-nh2、cocu-mof-oh-aptes固定化漆酶：取50mg样品分散在 去离子水中，加入2ml 25％的戊二醛，搅拌反应30min，加入5ml的漆酶溶液， 控制总体积为20ml，待反应3h结束后，离心洗涤，冻干，4℃冰箱冷冻保 存，获得lac-cu-mof-nh2、lac-cocu-mof-oh-aptes。
[0148]
性能测试结果：
[0149]
1.最适条件测试
[0150]
1.1 ph
[0151]
图9中a显示了不同ph条件对游离漆酶和固定化酶活性的影响。游离 漆酶最佳酶活为100％，固定化酶对ph的敏感性降低，lac-cu-mof-nh2的最高酶活达到359.08％和lac-cocu-mof-oh-aptes最高酶活达到 325.67％。lac-cu-mof-nh2和lac-cocu-mof-oh-aptes均在ph＝4时活 性达到最大值，适宜ph范围显著变宽。添加氨水功能化与低浓度碱刻蚀， 均有效提高了固定化酶的活性。随着ph的增加，酶活性逐渐降低，这可能 是cu
2+
对骨架表面性质的影响，溶液中oh-浓度的增加影响了活性中心的 t2/t3铜结构，阻碍了漆酶的催化反
应，破坏了蛋白的构象。
[0152]
1.2温度
[0153]
温度对游离漆酶和固定漆酶活性的影响如图9中b所示。游离漆酶的最 适温度为50℃，lac-cu-mof-nh2和lac-cocu-mof-oh-aptes的最适温 度为60℃。显然，适当提高温度降低固定化漆酶的空间位阻，使得固定化 漆酶的最佳温度高于游离漆酶。此外，由于功能化材料提供了更多的共价结 合位点，功能化后材料的相对活性均显著上升，酶与材料结合更加稳固，维 持酶的空间构象，固定化漆酶的温度敏感性明显低于游离漆酶。当温度上升 到70℃时，游离漆酶仍有55.48％的活性，lac-cu-mof-nh2的活性维持在 103.62％，lac-cocu-mof-oh-aptes的活性维持在123.01％，且均优于修 饰前的材料。上述结果表明，固定化保存了酶的活性，由于mof载体对酶 空间结构的束缚维持了酶的空间构象，使漆酶具有更强的耐热能力，且合适 的修饰载体的方法更有益于酶的固定化。
[0154]
2.稳定性研究
[0155]
2.1 ph稳定性
[0156]
游离漆酶和固定化漆酶的ph稳定性研究结果如图10中a、b所示。在不 同ph条件下孵育1h，随着ph的不断升高，游离酶活性不断下降，固定化酶 活性先增加后降低。游离漆酶在ph＝3时稳定性最高，lac-cu-mof-nh2和 lac-cocu-mof-oh-aptes在ph＝3.5时稳定性最好。在整个ph范围内，均 高于游离酶。从变化趋势来说，固定化酶活性衰减趋势更加平缓，这说明相对 游离漆酶，固定化酶有更好的ph稳定性。
[0157]
2.2温度稳定性
[0158]
适当的温度能有效地提高酶催化反应的速率，温度过低时，会抑制酶的活 性中心，温度过高时，改变酶空间结构，破坏酶活性中心，甚至使酶变性失活。 因此，在进行酶催化反应时，较高热稳定性的酶是稳定进行酶催化反应的前提。 游离酶和固定化酶的热稳定性研究结果如图10中c-d所示，在不同温度条件 下孵育1h，随着温度的升高，相对酶活性先升高后降低。游离酶在80℃活性 完全丧失，lac-cu-mof-nh2保留30.54％，lac-cocu-mof-oh-aptes仍保 留33.13％的活性。分析结果表明，固定化酶显著提高了酶的热稳定性，这是 由于固定化载体限制酶的运动和构象的变化，保护酶免受热变性影响。
[0159]
2.3循环稳定性
[0160]
lac-cu-mof-nh2和lac-cocu-mof-oh-aptes循环稳定性研究结果如 图10中e、f所示。游离酶最大的缺点是可重复利用性和可回收性差，固定化 酶有效克服这一缺点，实现酶的再次利用。随着循环次数增多，酶活性逐渐降 低。经过6次循环后，lac-cu-mof-nh2保留127.81％的活性； lac-cocu-mof-oh-aptes保留264.02％的相对活性，实现了多次循环使用， 由此可得，修饰载体材料极大提升酶的循环稳定性。
[0161]
2.4储存稳定性
[0162]
游离漆酶、lac-cu-mof-nh2和lac-cocu-mof-oh-aptes的贮藏稳定性 研究结果如图10中g、h所示，经过30天的储藏期后所有样品的活性均在不 断降低。储存30天游离酶保留35.99％的活性，lac-cu-mof-nh2保持69.80％； lac-cocu-mof-oh-aptes相对活性仍然在125.72％。在贮藏过程中，游离酶 活性逐渐下降，但固定化酶具有较好的稳定性。由于酶分子分散固定在载体表 面，可以有效避免使用和回收过程中酶分子团聚导致的失活，而且功能化修饰 后材料固定化酶储存稳定性显著提升。
[0163]
3.吸附动力学
[0164]
吸附动力学是研究吸附剂对cr吸附过程的重要手段，反应吸附的传质速 率，lac-cu-mof-nh
2-t和lac-cocu-mof-oh-aptes-t动力学拟合结果以及 相关参数如图11、图12，拟合参数如表1所示。lac-cu-mof-nh
2-t和 lac-cocu-mof-oh-aptes-t对cr的吸附可分为三个阶段：快速期、缓慢期、 稳定期。快速期溶液中cr浓度较高，吸附剂表面有大量的活性位点，有助于 cr快速吸附在吸附剂表面；缓慢期活性位点和cr浓度均逐渐下降，所以吸 附速率也会随之变慢；稳定期吸附剂表面吸附位点达到饱和，吸附曲线逐渐平 缓。无论中性条件还是酸性条件，吸附量均随着温度的升高而增大。 cu-mof-nh
2-t对cr吸附量受溶液ph影响较大，-nh2功能化有利于改善表 面电荷，表现出良好的ph调控特性，提升吸附容量。ph＝7二级动力学拟合 度(图11中c)更高，吸附过程化学作用占据主要作用；ph＝3.5时一级动力 学(图12中a)与二级动力学(图12中c)拟合度均达到0.9以上，物理吸 附与化学吸附均占据重要作用。在50℃和ph为7条件下吸附量最大为 134.00mg
·
g-1
。lac-cocu-mof-oh-aptes-t对cr吸附量受溶液ph影响较 小，ph＝7(图11中d)与ph＝3.5(图12d)二级动力学拟合度均达到0.9以 上，在吸附污染物的过程中同时发生物理吸附或化学吸附。在50℃和ph为7 条件下吸附量最大为182.021mg
·
g-1
。
[0165]
表1 lac-cu-mof-nh
2-t、lac-cocu-mof-oh-aptes-t吸附cr的动力学参 数
[0166][0167][0168]
4.固定化酶降解染料
[0169]
本实施例制备的lac-cu-mof-nh2和lac-cocu-mof-oh-aptes固定化 酶和游离酶在ph＝3.5、50℃和ph＝7、50℃的条件下对cr的降解效率。实 验结果表明，在ph＝3.5、50℃条件下，游离漆酶经过3h对cr的去除率达 到11.52％，lac-cu-mof-nh2和lac-cocu-mof-oh-aptes cr的1h对cr 去除率达到95％以上(见图13中a)。在ph＝7、50℃条件下，经过3h，
游离 漆酶对cr的去除率仅为9.10％，lac-cu-mof-nh2对cr的去除率达到81.44％， lac-cocu-mof-oh-aptes对cr的去除率达到96.99％(见图13中b)。如 图13中c，经过6h，lac-cu-mof-nh2对活性蓝19的去除率达到44.09％， lac-cocu-mof-oh-aptes对活性蓝19的去除率达到57.39％，说明 lac-cocu-mof-oh-aptes对染料有较好的处理效果。
[0170]
催化剂的稳定性对于高效、快速的处理废水有着重要的作用，同时也是判 断催化剂品质的一个重要因素。ph＝3.5，50℃条件下lac-cu-mof-nh2循环 降解cr的实验结果如图13中d所示，循环6次后对cr的降解率仍在84.63％ 以上。ph＝3.5，50℃条件下lac-cocu-mof-oh-aptes循环降解cr的实验 结果如图13所示，循环6次后对cr的降解率仍在89.18％以上。
[0171]
在前人研究的基础上，及本发明的结果，提出了一种可能有效的漆酶降解 途径(图14)。第一步可能是cr电子转移到漆酶活性中心，cr形成缺电子 中心，偶氮键不对称裂解形成中间产物。第二步，cr代谢物可能被脱硫，胺 类被氧化。最后将苯环打开氧化，最终转化为无机物实现矿化。
[0172]
实施例3
[0173]
制备方法：
[0174]
1.水热法合成mof
[0175]
cocu-mof-h的合成：方酸(259mg，2.27mmol)在80℃下溶解在15ml 去离子水中，六水合硝酸钴(396.3mg，1.362mmol)和二水合氯化铜(155.3 mg，0.908mmol)室温下溶解在5ml去离子水中，将含铜溶液加入到方酸溶 液中，待有沉淀析出，将其转移到聚四氟乙烯的内胆中，80℃水热8h。
[0176]
2.功能化修饰mof合成
[0177]
cu-mof-nh2的合成：方酸(433mg，3.80mmol)室温下加入10ml去离 子水搅拌，再滴加1.25ml氨水，直至溶液透明澄清，加入二水合氯化铜(649.5 mg，3.80mmol)，待有沉淀析出，将其转移到聚四氟乙烯的内胆中，80℃水 热8h。
[0178]
cocu-mof-oh的合成：取0.5g的cocu-mof-h样品加入20ml 0.05mol/lnaoh溶液，刻蚀20min，抽滤分离，清洗至中性，烘干，收集备用。
[0179]
3.功能化修饰mof固定化漆酶
[0180]
cocu-mof-oh硅烷化修饰：采用表面活性剂3-氨基丙基三乙氧基硅烷 (aptes)对材料进行硅烷化。将合成的材料(0.5g)加入在50ml乙醇中， 超声分散30min，获得均匀的悬浊液。然后在70℃加入0.5mlaptes，摇床 180rpm的剧烈搅拌下进行10h，最后用乙醇：水＝1：1洗涤多次，去除未结 合的aptes，并在室温下干燥，获得cocu-mof-oh-aptes。
[0181]
cu-mof-nh2、cocu-mof-oh-aptes固定化漆酶：取50mg样品分散在 去离子水中，加入2ml 25％的戊二醛，搅拌反应30min，加入7ml的漆酶溶液， 控制总体积为20ml，待反应2h结束后，离心洗涤，冻干，4℃冰箱冷冻保 存，获得lac-cu-mof-nh2、lac-cocu-mof-oh-aptes。
[0182]
性能测试结果：
[0183]
1.固定化酶载量及酶活
[0184]
测得本实施例获得的lac-cu-mof-nh2和lac-cocu-mof-oh-aptes酶 载量分别达到162.65mg/g和136.38mg/g，具有较高的酶活。
[0185]
2.稳定性研究
[0186]
游离漆酶最佳酶活为100％，固定化酶对ph的敏感性降低， lac-cu-mof-nh2的最高酶活达到355.36％和lac-cocu-mof-oh-aptes最高 酶活达到332.68％。lac-cu-mof-nh2和lac-cocu-mof-oh-aptes均在ph＝4 时活性达到最大值，适宜ph范围显著变宽。
[0187]
经过6次循环后，lac-cu-mof-nh2保留126.22％的活性；lac-cocu-mof-oh-aptes保留269.32％的相对活性，实现了多次循环使用， 由此可得，修饰载体材料极大提升酶的循环稳定性。贮藏稳定性研究结果表明 储存30天lac-cu-mof-nh2保持67.96％；lac-cocu-mof-oh-aptes相对活 性仍然在123.58％。
[0188]
3.吸附动力学性能
[0189]
lac-cu-mof-nh
2-t在50℃和ph为7条件下吸附量最大为136.23mg
·
g-1
。 lac-cocu-mof-oh-aptes-t在50℃和ph为7条件下吸附量最大为 180.68mg
·
g-1
。
[0190]
4.固定化酶降解染料
[0191]
本实施例制备的lac-cu-mof-nh2和lac-cocu-mof-oh-aptes固定化 酶和游离酶在ph＝3.5、50℃；ph＝7、50℃的条件下对cr的降解效率。实验 结果表明，在ph＝3.5、50℃条件下，lac-cu-mof-nh2和 lac-cocu-mof-oh-aptes的1h对cr去除率达到96％以上。在ph＝7、50℃ 条件下，经过3h，lac-cu-mof-nh2对cr的去除率达到82.69％， lac-cocu-mof-oh-aptes对cr的去除率达到96.86％。经过6h， lac-cu-mof-nh2对活性蓝19的去除率达到43.65％， lac-cocu-mof-oh-aptes对活性蓝19的去除率达到62.36％，说明 lac-cocu-mof-oh-aptes对染料有较好的处理效果。
[0192]
ph＝3.5，50℃条件下lac-cu-mof-nh2循环6次后对cr的降解率仍在 83.89％以上。ph＝3.5，50℃条件下lac-cocu-mof-oh-aptes循环6次后对 cr的降解率仍在90.23％以上。
[0193]
实施例4
[0194]
制备方法：
[0195]
1.水热法合成mof
[0196]
cocu-mof-h的合成：方酸(259mg，2.27mmol)在80℃下溶解在15ml 去离子水中，六水合硝酸钴(396.3mg，1.362mmol)和二水合氯化铜(155.3 mg，0.908mmol)室温下溶解在5ml去离子水中，将含铜溶液加入到方酸溶 液中，待有沉淀析出，将其转移到聚四氟乙烯的内胆中，80℃水热8h。
[0197]
2.功能化修饰mof合成
[0198]
cu-mof-nh2的合成：方酸(433mg，3.80mmol)室温下加入10ml去离 子水搅拌，再滴加1.0ml氨水，直至溶液透明澄清，加入二水合氯化铜(649.5 mg，3.80mmol)，待有沉淀析出，将其转移到聚四氟乙烯的内胆中，80℃水 热8h。
[0199]
cocu-mof-oh的合成：取0.5g的cocu-mof-h样品加入20ml 0.025mol/lnaoh溶液，刻蚀15min，抽滤分离，清洗至中性，烘干，收集备 用。
[0200]
3.功能化修饰mof固定化漆酶
[0201]
cocu-mof-oh硅烷化修饰：采用表面活性剂3-氨基丙基三乙氧基硅烷 (aptes)对材料进行硅烷化。将合成的材料(0.5g)加入在50ml乙醇中， 超声分散30min，获得均匀的悬浊液。然后在70℃加入0.5mlaptes，摇床 180rpm的剧烈搅拌下进行10h，最后用乙醇：水＝
1：1洗涤多次，去除未结 合的aptes，并在室温下干燥，获得cocu-mof-oh-aptes。
[0202]
cu-mof-nh2、cocu-mof-oh-aptes固定化漆酶：取50mg样品分散在 去离子水中，加入0.8ml 25％的戊二醛，搅拌反应30min，加入10ml的漆酶 溶液，控制总体积为20ml，待反应3h结束后，离心洗涤，冻干，4℃冰箱 冷冻保存，获得lac-cu-mof-nh2、lac-cocu-mof-oh-aptes。
[0203]
性能测试结果：
[0204]
1.固定化酶载量及酶活
[0205]
测得本实施例获得的lac-cu-mof-nh2和lac-cocu-mof-oh-aptes酶 载量分别达到167.84mg/g和135.65mg/g，具有较高的酶活。
[0206]
2.稳定性研究
[0207]
游离漆酶最佳酶活为100％，固定化酶对ph的敏感性降低， lac-cu-mof-nh2的最高酶活达到363.28％和lac-cocu-mof-oh-aptes最高 酶活达到337.16％。lac-cu-mof-nh2和lac-cocu-mof-oh-aptes均在ph＝4 时活性达到最大值，适宜ph范围显著变宽。
[0208]
经过6次循环后，lac-cu-mof-nh2保留127.56％的活性； lac-cocu-mof-oh-aptes保留270.16％的相对活性，实现了多次循环使用， 由此可得，修饰载体材料极大提升酶的循环稳定性。贮藏稳定性研究结果表明 储存30天lac-cu-mof-nh2保持70.23％；lac-cocu-mof-oh-aptes相对活 性仍然在124.31％。
[0209]
3.吸附动力学性能
[0210]
lac-cu-mof-nh
2-t在50℃和ph为7条件下吸附量最大为132.85mg
·
g-1
。 lac-cocu-mof-oh-aptes-t在50℃和ph为7条件下吸附量最大为 182.64mg
·
g-1
。
[0211]
4.固定化酶降解染料
[0212]
本实施例制备的lac-cu-mof-nh2和lac-cocu-mof-oh-aptes固定化 酶和游离酶在ph＝3.5、50℃；ph＝7、50℃的条件下对cr的降解效率。实验 结果表明，在ph＝3.5、50℃条件下，lac-cu-mof-nh2和 lac-cocu-mof-oh-aptes 1h对cr去除率达到96.5％以上。在ph＝7、50℃ 条件下，经过3h，lac-cu-mof-nh2对cr的去除率达到83.34％， lac-cocu-mof-oh-aptes对cr的去除率达到97.26％。经过6h， lac-cu-mof-nh2对活性蓝19的去除率达到45.36％， lac-cocu-mof-oh-aptes对活性蓝19的去除率达到64.58％，说明 lac-cocu-mof-oh-aptes对染料有较好的处理效果。
[0213]
ph＝3.5，50℃条件下lac-cu-mof-nh2循环6次后对cr的降解率仍在 84.28％以上。ph＝3.5，50℃条件下lac-cocu-mof-oh-aptes循环6次后对 cr的降解率仍在91.05％以上。
[0214]
由以上实施例可以得出，通过添加氨水功能化合成cu-mof-nh2，低浓度 碱刻蚀cocu-mof-h合成cocu-mof-oh，共价接枝固定化漆酶，制备出 lac-cu-mof-nh2和lac-cocu-mof-oh-aptes复合材料。对材料的形貌以及 结构进行表征，并进行漆酶固定化条件优化，酶学性质研究，测试了固定化酶 cr废水处理性能。小结如下：
[0215]
(1)合成初期添加适量氨水可以实现氨基功能化；低浓度碱刻蚀会引入 大量的oh
—
，在不改变mof材料晶型晶向的基础上形成mof与金属氢氧化 物的复合物；
[0216]
(2)氨基功能化与低浓度碱刻蚀均能有效提高酶载量与相对酶活性；
[0217]
(3)低浓度碱刻蚀材料固定化漆酶增强底物亲和力，提高酶促反应速率；
[0218]
(4)低浓度碱刻蚀使材料表面更加粗糙，增加表面孔隙，提高了对污染 物的吸附，进而增加了对污染物降解速率和降解效率；
[0219]
(5)lac-cu-mof-nh2和lac-cocu-mof-oh-aptescr的1h对cr去 除率达到95％以上；
[0220]
(6)cu-mof-nh2不经过aptes硅烷化直接固定化漆酶，仍然有较高的 酶载量与相对酶活性，而且合成过程简单，固定化过程用时较短，有较好的应 用前景。
[0221]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通 技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰， 这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。