一株贝莱斯芽孢杆菌菌株P87及其在花椒病害防治中的应用

一株贝莱斯芽孢杆菌菌株p87及其在花椒病害防治中的应用
技术领域
1.本发明涉及植物病害生物防治技术领域，具体涉及一株贝莱斯芽孢杆菌菌株p87及其在花椒病害防治中的应用。


背景技术：

2.花椒是我国重要的经济作物，我国是世界上花椒栽培面积产量第一大国，除东北、内蒙古等地外，大部分地区都有花椒分布，主要分布在陕西、山西、四川、河北、山东、甘肃等省。近年来随着国家大力发展乡村经济作物政策指引与带动，花椒的种植地域与面积快速增加。随着花椒种植面积的扩大及大面积集中连片的种植方式的出现，以及环境和气候的日益加剧，花椒病害问题也日益突出，给花椒产业的发展造成了巨大的损失。花椒干腐病、根腐病、黑胫病和落叶病是我国花椒产区危害较严重的病害，严重影响了花椒的产量和质量。目前，对这些病害的防治研究与应用主要集中在化学防治为主的单一防治方法上，而且在实际生产中往往出现重化学防治却轻预防的现象，化学农药的大量使用不仅增加了防治成本，而且所造成的环境污染、农药残留和有害生物抗药性等问题严重威胁着人类健康和生态环境。随着国民经济的快速发展和人民生活水平的不断提高，无公害、绿色食品受到人们的普遍重视，加快花椒无公害生产势在必行。
3.生物防治是植物病害绿色无公害防治的重要研究方向，微生物作为植物病害生物防治的重要资源库，其在植物病害生物防治方面成效显著。生物防治实施的前提在于生防菌株的获得及其菌剂的研制。芽孢杆菌以其在土壤、植物根际及植物体内等自然环境中广泛存在，能够产生抗逆的芽孢，产生多样的抗菌代谢产物，有效地定殖在植物体内并保护植物免受病原菌侵染，被认为是一种环境友好型、应用前景广泛的生防因子。关于利用芽孢杆菌进行植物病害的防治在生产上已有成功的案例，研究开发针对花椒病害防治的芽孢杆菌及其菌剂是进行花椒病害无公害防治的一条值得期待的新途径。


技术实现要素：

4.本发明的目的是针对花椒病害现有防治技术中的不足，提供一株拮抗花椒根腐病菌、黑胫病菌、干腐病菌和落叶病菌的贝莱斯芽孢杆菌菌株p87。
5.为了实现上述目的，本发明提供了一株贝莱斯芽孢杆菌(bacillusvelezensis)菌株p87，所述菌株于2022年6月7日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为cctcc no:m2022819，保藏地址：中国武汉武汉大学中国典型培养物保藏中心。
6.本发明还提供了上述贝莱斯芽孢杆菌菌株p87在拮抗花椒根腐病菌、黑胫病菌、干腐病菌和落叶病菌中的应用。
7.本发明的另一个目的在于，提供了一种防治花椒病害的生物制剂，有效成分为上述的贝莱斯芽孢杆菌菌株p87。
8.进一步地，所述生物制剂是由贝莱斯芽孢杆菌菌株p87的发酵液制备得到的可湿性粉剂。
9.进一步地，所述发酵液的采用以下步骤制得：
10.将含有贝莱斯芽孢杆菌菌株p87活化后，培养在组分为葡萄糖18g、蔗糖 30g、蛋白胨10g、氯化钠5g、水1l的发酵培养基中，在25～29℃、100～150rpm、搅拌培养4～6d，得到所述发酵液。
11.进一步地，所述可湿性粉剂的配方为：载体白炭黑25g/l、润湿剂peg8000 0.5g/l、分散剂三聚磷酸钠0.75g/l、保护剂十二烷基硫酸钠0.025g/l，含孢量≥1
×
108个/g，悬浮率为90.52％，润湿时间为43.6s，ph值为7.1，细度为 98％，干燥减重为0.9％。
12.进一步地，本发明还提供了防治花椒病害的生物制剂在防治花椒根腐病中的应用。
13.与花椒病害的现有防治技术相比，本发明的有益效果是：
14.(1)本发明筛选到一株菌株贝莱斯芽孢杆菌菌株p87，对花椒主要病害的病原菌(根腐病菌、黑胫病菌、落叶病菌和干腐病菌)具有显著的拮抗活性；
15.(2)本发明对贝莱斯芽孢杆菌菌株p87的发酵工艺进行了优化，以发酵液的抑菌活性为检测指标，明确了贝莱斯芽孢杆菌菌株p87的最佳发酵条件，有利于贝莱斯芽孢杆菌菌株p87的规模化发酵培养；
16.(3)本发明研制了贝莱斯芽孢杆菌菌株p87的可湿性粉剂，明确了贝莱斯芽孢杆菌菌株p87可湿性粉剂的最佳配方，且该可湿性粉剂质量达标，应用最佳配方的贝莱斯芽孢杆菌菌株p87可湿性粉剂，其对花椒根腐菌的菌落生长抑菌率可达82.88％，对花椒根腐病的防效可达81.47％，在花椒病害无公害防治中具有良好的应用前景，也为贝莱斯芽孢杆菌菌株p87可湿性粉剂后期的商品化、工业化生产奠定基础；
17.(4)施用本发明实施例制备的生物制剂，完全没有如化学农药的使用所带来的一系列问题，可以不用或减少其它防控花椒根腐病的化学农药用量，不仅有利于花椒的无公害生产，而且能弥补使用化学农药带来的农药残留、抗药性和有害生物再爆发等问题，有利于维持农林生态系统的可持续发展；
18.(5)由于是生物菌株制剂，完全没有因化学农药的使用所带来的一系列问题，因而有利于花椒的无公害生产，农民可以不用或减少其他化学农药的用量，这不仅可为农民节省开支，而且有利于花椒产品的出口。
附图说明
19.图1为贝莱斯芽孢杆菌菌株p87与四种靶标病原菌的平板对峙图片；其中， (a)为对花椒根腐病菌的拮抗活性对照图、(b)为对黑胫病菌的拮抗活性对照图、(c)为对落叶病菌的拮抗活性对照图、(d)为对干腐病菌的拮抗活性对照图；
20.图2为贝莱斯芽孢杆菌菌株p87的菌落形态、革兰氏染色和芽孢染色图；其中，(a)为贝莱斯芽孢杆菌菌株p87的菌落形态图、(b)为贝莱斯芽孢杆菌菌株p87的革兰氏染色图、(c)为贝莱斯芽孢杆菌菌株p87的芽孢染色图；
21.图3为贝莱斯芽孢杆菌菌株p87的不同发酵液对花椒根腐病菌菌落生长的影响图(a)和抑菌率(b)；
22.图4为贝莱斯芽孢杆菌菌株p87可湿性粉剂对花椒根腐病菌的抑菌活性；
23.图5为贝莱斯芽孢杆菌菌株p87可湿性粉剂对花椒根腐病的防治效果对比图。
具体实施方式
24.以下结合特定的具体实施例对本发明做进一步说明，本发明实施例并非局限于此，任何本领域的技术人员能思之的变化或替换都应落入本发明的保护范围。
25.实施例1：拮抗贝莱斯芽孢杆菌菌株p87的分离、筛选与鉴定
26.本发明的生防贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)菌株p87，于2022 年6月7日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为cctcc no:m2022819。该菌株分离自花椒根际土壤微生物，采用平板对峙培养发现贝莱斯芽孢杆菌菌株p87对供试的靶标病菌均表现出显著拮抗作用，该菌株的分离、筛选与鉴定方法如下：
27.(1)拮抗菌的分离
28.于2020年8月中旬在陕西杨凌农业综合试验示范站花椒园内采集花椒根际土壤，具体采集过程如下：在花椒园内设置3个20m
×
30m标准地，在每一标准地分别选择3年生、5年生和8年生的花椒树各3株，在离树干基部40cm 处设置5个取样点，用内径10cm土钻分层挖取10～30cm的土壤，采集土层中直径为0.2～0.5cm的花椒细根，先抖落花椒根上粘附的大颗粒土壤，然后将花椒细根带回实验室，用力抖落花椒细根上的土，即为根际土壤；将同一树龄的根际土壤混合装入消毒的密封塑料袋中，放入冰盒内带回，形成3个不同树龄的根际土样：3年生(rs1-zb)、5年生(rs2-zb)和8年生(rs3-zb)，过 0.2mm筛，放-80℃冷冻备用。
29.将采集的花椒根际土壤rs1-zb、rs2-zb和rs3-zb各取5g，充分混匀后，加入盛有135ml无菌水(内有30～40粒无菌玻璃珠)的无菌玻璃三角瓶中，置于振荡机上振荡15min，即得浓度为10-1
g/ml的土壤悬浮液，然后分别配置浓度梯度为10-2
、10-3
g/ml和10-4
g/ml的土壤稀释液，吸取各浓度土壤悬浮液 50μl，滴加于pda培养基平板上，然后用无菌涂布器涂布均匀，用封口膜将培养皿封口，然后将其放置于28℃培养箱，每天观察统计pda培养基上长出的微生物单菌落，将新出现的与之前的菌落形态不同的单菌落用无菌牙签挑取，接种在新的pda培养基上进行纯化，获得纯种菌株。
30.获得的菌株保藏于30％的甘油中，置于-80℃低温环境中。
31.所述的pda培养基，其制作方法为：称取200g无皮土豆，切成小块，添加适量的去离子水，煮沸20min后，冷却，纱布过滤，收集滤液，然后向滤液中添加葡萄糖20g、琼脂20g、用去离子水定容至1l，121℃高压蒸汽灭菌20min 后备用。
32.(2)拮抗菌的筛选
33.采用平板对峙培养法检测分离自花椒根际土壤中的所有微生物菌株对花椒根腐病菌、黑胫病菌、落叶病菌和干腐病菌的拮抗活性，供试靶标病原均为本实验室前期分离、柯赫氏法则验证和鉴定所得。
34.拮抗菌株的初筛：取出保存于冰箱的四种供试靶标病原物菌种，分别接种在pda平板上活化培养，在28℃暗培养10d后，以无菌打孔器从平板上靠近菌丝边缘位置取直径0.5cm的病原菌菌饼，接种到新的pda平板中央；将已纯化的花椒根际土壤微生物菌株接种在pda培养基上活化培养5天，然后用无菌牙签挑取菌落上的菌体，采用十字接种法将四个不同的供试菌株接种在距离病原菌菌饼2cm位置处，置于28℃培养10d，观察花椒根际土壤各微生物菌株对靶标病原的抑菌效果，筛选出对四种病原菌同时表现出较强抑菌活性(抑菌带宽≥10mm)的菌株，初筛共获得20株拮抗菌株，均为细菌。
35.拮抗菌株的复筛：取取初筛后的拮抗菌株和病原菌，在pda平板上进行对峙试验，
进行复筛。用无菌打孔器从接种病原菌的平板上靠近菌丝边缘位置制备直径0.5cm的病原菌菌饼，接种到新的pda平板中央。初筛所得拮抗细菌菌株接种在pda培养基上培养2d后，用无菌棉签蘸取菌落上的菌体，采用十字接种法将同一拮抗细菌菌株接种在距离病原菌菌饼2cm位置处，置于28℃培养 10d，筛选出了同时对四种靶标病原均表现出最显著拮抗活性的细菌菌株p87，其对靶标病原菌的拮抗效果见图1，图1中(a)为对花椒根腐病菌的拮抗活性对照图、(b)为对黑胫病菌的拮抗活性对照图、(c)为对落叶病菌的拮抗活性对照图、(d)为对干腐病菌的拮抗活性对照图，通过平板对峙培养法可见经过菌株p87处理过菌饼与对照菌饼相比拮抗效果显著。
36.(3)拮抗菌株p87的鉴定
37.挑取拮抗菌株p87单菌落接种于pda培养基上，其菌落形态如图2(a)所示。对菌株p87进行革兰氏染色后，其染色结果为紫色，说明菌株p87为革兰氏阳性菌，如图2(b)所示。采用schaeffer-fulton氏芽孢染色试剂盒对菌株p87是否产生芽孢进行检测，发现菌株p87能产生大量的芽孢，如图2(c) 所示。
38.采用catb法提取菌株p87的dna，然后对菌株p87的16s rdna进行扩增与测序，引物合成和测序均由上海生工生物有限公司合成。根据菌株p87的16srdna序列在ncbi数据库的比对结果，将其鉴定为贝莱斯芽孢杆菌(bacillusvelezensis)。贝莱斯芽孢杆菌的抗菌脂肽合成基因具有一定的保守性，在此基础上，对菌株p87的7个抗菌脂肽合成基因(srfaa、srfac、ituc、itud、 fend、bmyb和baca)进行了pcr扩增及测序，测序结果在ncbi数据库比对，结果与贝莱斯芽孢杆菌的相应基因的同源性高达99％以上，由此也证明了将菌株p87鉴定为贝莱斯芽孢杆菌的结果准确性。菌株p8716s rdna和7个抗菌脂肽合成基因的pcr扩增引物合成和测序均由上海生工生物工程有限公司完成。
39.菌株p87的16s rdna和7个抗菌脂肽合成基因进行pcr扩增的引物如下所示：
[0040][0041]
菌株p87的16s rdna和7个抗菌脂肽合成基因进行pcr扩增的反应体系为30μl，包括2
×
es taq mastermix30μl、ddh2o 12.5μl、正向引物1μl、反向引物1μl、dna模板0.5μl；pcr扩增程序为：预变性94℃
×
3min、[94℃
×
30s、52℃
×
30s、72℃
×
45s]
×
35循环、72℃
×
10min。pcr结束后，凝胶电泳验证片段大小无误后，将pcr产物送测序公司进行测序。
[0042]
菌株p87的16s rdna扩增片段的测序结果：
[0043]
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[0044]
菌株p87的srfaa基因扩增片段的测序结果：
[0045]
ggggaaatgggacttgctcctgatgttagcggcggacgggtgagtaacacgtgggtaacctgcctgtaagactgggataactccgggaaaccggggctaataccggatggtt gtttgaaccgcatggttcagacataaaaggtggcttcggctaccacttacagatggac ccgcggcgcattagctagttggtgaggtaacggctcaccaaggcgacgatgcgtagccgacctgagagggtgatcggccacactgggactgagacacggcccagactcctacggg aggcagcagtagggaatcttccgcaatggacgaaagtctgacggagcaacgccgcgtgagtgatgaaggttttcggatcgtaaagctctgttgttagggaagaacaagtgccgtt caaatagggcggcaccttgacggtacctaaccagaaagccacggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttgtccggaattattgggcgtaaaggg ctcgcaggcggtttcttaagtctgatgtgaaagcccccggctcaaccggggagggtcattggaaactggggaacttgagtgcagaagaggagagtggaattccacgtgtagcggt gaaatgcgtagagatgtggaggaacaccagtggcgaaggcgactctctggtctgtaactgacgctgaggagcgaaagcgtggggagcgaacaggattagataccctggtagtcc acgccgtaaacgatgagtgctaagtgttagggggtttccgccccttagtgctgcagctaacgcattaagcactccgcctggggagtacggtcgcaagactgaaactcaaaggaat tgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaaga accttaccaggtcttgacatcctctgacaatcctagagataggacgtccccttcgggggcagagtgacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaa gtcccgcaacgagcgcaacccttgatcttagttgccagcattcagttgggcactctaaggtgactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccc cttatgacctgggctacacacgtgctacaatggacagaacaaagggcagc
gaaaccgcgaggttaagccaatcccacaaatctgttctcagttcggatcgcagtctgcaactcgactgcgtgaagctggaatcgctagtaatcgcggatcagcatgccgcgatgccac
[0046]
菌株p87的srfac基因扩增片段的测序结果：
[0047]
gggttgggcagctggagcgggagggcatttacccgcaggccgtgatcatctcagc cattcagccgccgcatgtggaaaggaaaaaagtgtctcatcttgatgatgaaaaatttctcgcccatattatcgagcttggcggaatgccgcaggagttagtggagaataaggagg tcatgtcatttttcctgccttctttcagatccgactaccgcgcgcttgaaagcttccgtccgtctgattctcacatgattcaatcacccgtccatatttttaacgggcggaaagataa aaaatgtatcaaagatgcggacggatggaaaaaatgggccgacaatcccgtatttcat gagttttcggacggccacatgttcatattaagtgaaactgaaaag
[0048]
菌株p87的ituc基因扩增片段的测序结果：
[0049]
accgtacacttctcgttgacatcaaactgcgaaaactgaatatccgcgggataag acggtttatcagttattcgaagaacagatgaaacgaacaccggatcaagcagccgtta tttgcggagaaaagcaattcacatatcgccagctcaatgaacgtgccaatcaattagcccgaacgttaaggaaaaagggggtaaagacggaccggctcactgcgattatttgcga acatgagatcgaattggtcgtgggaatactggccgttttaaaagcgggaggggcctatgtgccaattgatccggattacccgaagcatcgcatacagtatatagtagaagactccca agctgatatcatcctgacgcagagccatcttcaaaaacagttggaacttgcgggcacaatggttttcctcgatcaagaaaactcttaccacgaagacggctctgacctggaaccga tcagcagtacgaaggatttggcttatgtcatttatacgtcaggctccacaggcaagcctaaaggagtggcaattgagcatcaggcttaaaccaaa
[0050]
菌株p87的itud基因扩增片段的测序结果：
[0051]
tttccccctgtttttttagatcggaggaatctcatgaacaatcttgcctttttattt cctggacaagggtctcaatttgtaggaatgggcaaacaattttggaatgattttgtgctcgcaaagagattgtttgaagaagcgagcgatgcgatctccttggatgtaaaaaaactg tgttttaacggagatatgaatgaattgacaaagacaatgaacgcgcagcccgctattttaacggtcagtgtcattgcttttcaagtgtatatgcaggaaataggggtgaagccacgc ttcctggcaggccatagcttaggcgaatattcagcgcttgtctgtgccggcgccctttcttttcaggatgccgttacacttgtaagggagcggggaattcttatgcaaaatgcggatc ctcagcagcagggggcgatggccgccgtgactcacctctctcttcaaaccttgcaagaaatatgttcgaaagtgtcgacggaagactttccggcaggtgtagcctgcatgaattca gaacagcagcatgtgatttccggacaccggcaagctgtggaacgtgtcatcaagatg gcggaggaaaagggtgcggcatacacttatttgaatgtcagtgcgccttttcacagtcagatggtacgatcagcatctgaacaattccagactgtattacaccggtattccttccgg gatgccgcatggccgatcatttcaaatgtcaccgcacgcccttacagcagcggaaattcgatccgcgaacatctcaagcagcacatgacgatgccggttagatggcaaaa
[0052]
菌株p87的fend基因扩增片段的测序结果：
[0053]
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[0054]
菌株p87的bmyb基因扩增片段的测序结果：
[0055]
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[0056]
菌株p87的baca基因扩增片段的测序结果：
[0057]
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[0058]
综上所述，拮抗菌株p87鉴定为贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)，该菌株已于2022年6月7日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为cctccno:m2022819。
[0059]
实施例2：贝莱斯芽孢杆菌菌株p87的发酵工艺
[0060]
(1)设计6种不同的发酵培养基。培养基a：葡萄糖5g、酵母浸膏7.5g、蛋白胨7.5g、(nh4)2so45g、nacl 5g、水1l，ph＝7.0；培养基b：葡萄糖5g、酵母浸膏5g、蛋白胨10g、牛肉膏5g、nacl 5g、水1l，ph＝7.0；培养基c：葡萄糖10g、蛋白胨4g、水1l，ph＝7.0；培养基d：可溶性淀粉10g、蛋白胨 10g、mgso40.1g、kh2po40.5g、水1l，自然ph；培养基e：葡萄糖20g、酵母粉10g、蛋白胨10g、nacl 5g、caco31g、水1l，ph＝7.0；培养基f：葡萄糖18g、蔗糖30g、蛋白胨10g、nacl 5g、水1l，自然ph。将以上培养基配制完成后，进行高温高压灭菌，冷却至室温后，将培养基以每瓶30ml分装入体积为100ml的玻璃三角瓶中。
[0061]
(2)用无菌牙签在贝莱斯芽孢杆菌菌株p87的菌落上制备带菌体的小块培养基，放入含有30ml lb液体培养基的玻璃三角瓶中，每瓶接种3个菌饼，共接种3瓶，放置于27℃、150rpm振荡培养2天后，作为种子培养基。
[0062]
(3)用移液枪吸取p87种子培养基2ml转移至含有30ml发酵培养基的三角瓶中，放置于恒温震荡培养器中在27℃、125rpm暗培养5天后，收集发酵液，在12000rpm离心10min，去除菌体，收集上清液。
[0063]
(4)上清液采用过滤器过滤(0.22μm)后，添加至经高压灭菌后尚未凝固的pda培养基中，混匀，倒平板，使贝莱斯芽孢杆菌菌株p87发酵液在pda 培养基中的含量为45％。
[0064]
(5)以花椒根腐病菌为靶标病原，检测贝莱斯芽孢杆菌菌株p87的a、b、 c、d、e、f六种不同发酵液对花椒根腐病菌菌落生长的抑制作用，以抑菌率为指标，筛选出最有利于p87发挥抗菌活性作用的发酵培养基配方为：培养基f：葡萄糖18g、蔗糖30g、蛋白胨10g、nacl 5g、水1l，自然ph。在此条件下，对花椒根腐病菌菌落生长的抑制率达70.86％；a、b、c、d、e、f六种培养基中的贝莱斯芽孢杆菌菌株p87对花椒根腐病菌菌落生长的影响如图3(a)所示，检测这六种培养基的发酵液中贝莱斯芽孢杆菌菌株p87对花椒根腐病菌菌落生长的抑制作用，结果如图3(b)所示。
[0065]
实施例3：贝莱斯芽孢杆菌菌株p87可湿性粉剂的制备
[0066]
(1)贝莱斯芽孢杆菌菌株p87母种的制备
[0067]
基于实施例2中确定的贝莱斯芽孢杆菌菌株p87的最佳发酵工艺，获得贝莱斯芽孢杆菌菌株p87的液体发酵母种。
[0068]
(2)贝莱斯芽孢杆菌菌株p87可湿性粉剂的制备
[0069]
将载体和助剂按照比列与贝莱斯芽孢杆菌菌株p87母种混匀，载体为白炭黑25g/l、润湿剂为peg80000.5g/l、分散剂为三聚磷酸钠0.75g/l、保护剂为十二烷基硫酸钠0.025g/l。各组合混匀后，放到正空冰冻干燥机中冷冻干燥 24h后放入微型粉碎机中粉碎，可得贝莱斯芽孢杆菌菌株p87可湿性粉剂。
[0070]
(3)贝莱斯芽孢杆菌菌株p87可湿性粉剂的质量检测
[0071]
依据国家质量标准，对贝莱斯芽孢杆菌菌株p87可湿性粉剂进行质量检测，其特征在于：含孢量≥1
×
108个/g，悬浮率为90.52％，润湿时间为43.6s，ph 值为7.1，细度为98％，干燥减重为0.9％。
[0072]
实施例4：贝莱斯芽孢杆菌菌株p87可湿性粉剂在拮抗花椒根腐病菌中的应用
[0073]
(1)贝莱斯芽孢杆菌菌株p87可湿性粉剂对花椒根腐病菌的抑菌活性测定
[0074]
制备花椒根腐病菌的菌饼，接种在pda培养基中央，然后用打孔器在菌饼左右两边2cm处各打一个直径5mm的孔，然后将贝莱斯芽孢杆菌菌株p87可湿性粉剂稀释至1
×
107cfu/g后，用移液枪吸取0.3ml分别注入孔内。然后放置于28℃暗培养8天，发现贝莱斯芽孢杆菌菌株p87可湿性粉剂对花椒根腐菌的菌落生长抑制作用显著，抑菌率可达82.88％，如图4所示。
[0075]
(2)贝莱斯芽孢杆菌菌株p87可湿性粉剂对花椒根腐病的防效
[0076]
选择健康的2年生
‘
大红袍’花椒盆栽苗进行贝莱斯芽孢杆菌菌株p87可湿性粉剂对花椒根腐病防治效果的验证。花椒盆栽苗采用经高压蒸汽灭菌后的无菌土种植，拨开花椒苗经基部的土壤，在花椒茎基部向下约1cm的花椒主根上，用无菌接种针针刺15次，制造微伤口，然后取1ml105cfu/ml的花椒根腐病菌孢子悬浮液沿花椒主根注入土壤中，进行干腐病菌的灌根接种，对照和处理组菌进行根腐病菌的灌根接种，然后，处理组接种1ml浓度为10mg/ml(贝莱斯芽孢杆菌菌株p87的活菌数为106cfu/ml)的贝莱斯芽孢杆菌菌株p87可湿性粉剂无菌水溶液，对照组接种1ml无菌水溶液。接种后的所有花椒苗均放置于温室中培养(25℃，光周期：12:12(l：d)h)。
[0077]
在花椒苗木处理40天后，对花椒根部的发病情况拍照记录，并将花椒根系平均分为5段，分别进行严重度分级，统计结果并计算病情指数和防治效果。花椒根腐病严重度分级标准：0级：健康；ⅰ级：根部皮层变色，皮层未脱落；ⅱ级：木质部变褐，皮层脱落；ⅲ级：木质部变黑，皮层脱落；ⅳ级：木质部腐烂变软，皮层脱落。
[0078][0079][0080]
如图5所示，对照组花椒根部发病严重，整个根部皮层腐烂、脱落，木质部变黑、变软，发出一股糟臭味，病情指数可达94.35；处理组皮发病部位主要位于根部底端或须根尖
端，中上部不发病，皮层稍有脱落，木质部稍变褐，病情指数为17.48，计算所得贝莱斯芽孢杆菌菌株p87可湿性粉剂对花椒根腐病的防治效果为81.47％，防治效果显著。
[0081]
以上所述者仅为用以解释本发明之较佳实施例，并非企图具以对本发明做任何形式上之限制，是以，凡有在相同之发明精神下所作有关本发明之任何修饰或变更，皆仍应包括在本发明意图保护之范畴。
[0082]
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生成日期:2022-07-20
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基本信息:
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当前申请/申请人档案名:northwest a&f university
[0090]
申请人姓名或名称:西北农林科技大学
[0091]
申请人姓名或名称/语言:zh
[0092]
申请人姓名或名称/拉丁名称:northwest a&f university
[0093]
发明名称:一株贝莱斯芽孢杆菌菌株p87及其在花椒病害防治中的应用(zh)
[0094]
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