一种离子液体-近红外荧光探针水凝胶及其制备方法和应用

1.本发明属于生物医用材料制备技术领域，涉及一种离子液体-近红外荧光探针水凝胶及其制备方法和及其应用，具体涉及一种近红外荧光探针结合离子液体的多功能导电、抗冻和非释放性抗菌水凝胶及其制备方法和在促进糖尿病伤口愈合中的应用。


背景技术：

2.糖尿病(dm)是一种以持续高血糖为特征的常见慢性疾病。目前，糖尿病患者约占全球人口的19～34％(近4.5亿)，且糖尿病患者的数量每天还在与日俱增(yang yuan,daidi fan,shihong shen,xiaoxuan ma,chemical engineering journal,2022,133859:1385-8947)。特别是ii型糖尿病伤口，其是由于体内产生大量的活性氧(reactive oxygen species，ros)而引起的持续性炎症、血管生成受损等。次氯酸(hclo)作为一种主要的高活性ros，当其在体内浓度过量时便会引起氧化应激并破坏细胞内的核酸和蛋白质，进而引发炎症并延缓伤口的愈合(xiaoli qian,hui yu,wenchao zhu,xufeng yao,wangwang liu,shikui yang,fangyuan zhou,yi liu,dyes and pigments,volume 188,2021,109218:0143-7208.)。糖尿病伤口作为糖尿病患者最常见的并发症之一，目前已成为全球医疗保健系统面临的一大挑战。为了监测体内hclo水平，在过去的几十年中，已经开发的检测方法有比色法、色谱法、电化学法和荧光法等。在这些方法中，荧光法由于操作简便且可以实时分析等独特优势而被广泛应用(yan zhang,haiyan yang,mingxin li,shuaigong,jie song,zhonglong wang,shifa wang,dyes and pigments,volume 197,2022,109861,0143-7208)。近红外荧光探针是一种通过nir荧光激发，生物成像后快速可视化和量化待检测物的一种化学染料。且nir荧光区域(650～900nm)具有组织穿透深度高、对生物的光损伤微弱且可避免复杂的背景自发荧光干扰等优点(chengg,fan j,sun w,chemical communications,2013,50(8):1018-1020.)。由于hclo的生命周期短且活性高，使得糖尿病伤口中hclo水平通常难以捉摸，并且容易受到其他ros竞争者的干扰。因此，开发一种既能促进糖尿病伤口愈合又具有快速、灵敏的实时监测伤口处hclo水平的水凝胶辅料具有重大意义。


技术实现要素：

3.为了改善水凝胶辅料在促进糖尿病伤口愈合的同时，实时监测伤口处hclo水平的技术难题，本发明提供一种近红外荧光探针结合离子液体的多功能导电、抗冻和非释放性抗菌水凝胶及其制备方法和应用。与已报道的聚离子液体功能化水凝胶相比(chao zhou,chengju sheng,linglinggao,jiaguo,peng li,bo liu,volume 413,2021,127429：1385-8947)，本发明的离子液体-近红外荧光探针水凝胶促进糖尿病伤口的愈合的同时，可实时、可视化监测糖尿病伤口中hclo水平。糖尿病伤口属于慢性伤口，其hclo浓度会异常偏高，而过量的hclo会使离子液体-近红外荧光探针水凝胶的荧光值逐渐变低，甚至猝灭。为了对糖尿病伤口的hclo水平快速量化和可视化成像，可将离子液体-近红外荧光探针水凝胶敷在
糖尿病伤口上，并通过近红外荧光活体成像看到水凝胶的荧光变化情况，进而通过水凝胶的荧光值变化，推测糖尿病伤口的hclo浓度变化值。本发明的离子液体-近红外荧光探针水凝胶不仅制备工艺简单、成本低廉，而且具有良好的机械性能、体外粘附性能、防冻性能、止血性能以及非释放性抗菌性能。与商用辅料(3m tegaderm)和空白对照组相比，本发明的离子液体-近红外荧光探针水凝胶能显著加快糖尿病伤口的愈合。
4.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
5.本发明提供一种式i所示结构的化合物：
[0006][0007]
本发明还提供如式ⅰ所示结构的化合物的制备方法，包括将化合物3与硫代吗啉反应，制备得到上述如式ⅰ所示结构的化合物；
[0008]
所述化合物3具有如下结构：
[0009][0010]
根据本发明的实施方案，所述硫代吗啉与化合物3的摩尔比为1：(1～5)，示例性为1:1、1:3、1:5。
[0011]
根据本发明的实施方案，所述制备方法可以在溶剂如有机溶剂的存在下进行。例如，所述的有机溶剂可以选自dmf。
[0012]
根据本发明的实施方案，所述制备方法还包括待反应结束后，从反应后的混合物中分离得到固体产物的步骤。例如，将反应液倒入无水乙醚中，抽滤、用无水乙醚洗涤，收集滤饼，干燥，得到式ⅰ所示结构的化合物。
[0013]
优选地，所述式i化合物的合成路线如下：
[0014][0015]
根据本发明的实施方案，所述化合物3由如下方法制备得到，包括：将化合物1和化合物2进行反应，得到所述化合物3；
[0016]
所述化合物1具有如下结构：
[0017]
所述化合物2具有如下结构：
[0018]
根据本发明的一个实施方式，上述反应可以在溶剂如有机溶剂的存在下进行。例如，所述的有机溶剂可以选自乙醇。
[0019]
根据本发明的实施方案，所述化合物1与化合物2的摩尔比为1：(1～5)，示例性为1:1、1:2、1:5。
[0020]
根据本发明的实施方案，所述化合物1与化合物2的反应中，优选加入碱。
[0021]
优选地，所述碱与化合物2的摩尔比为1：(0.5～2)，示例性为1:0.5、1:1、1:2。
[0022]
优选地，所述碱选自碳酸钾、叔丁醇钠、叔丁醇钾、磷酸钾、醋酸钠中的一种、两种或更多种。
[0023]
根据本发明的实施方案，所述制备方法还包括待反应结束后，从反应后的混合物中分离得到固体产物的步骤。例如，通过旋干溶剂得到固体产物。进一步地，所述制备方法还包括对所述产物进行纯化的步骤。例如，所述纯化可以采用柱层析色谱柱分离。优选地，所述柱层析色谱柱分离的洗脱液为二氯甲烷/甲醇＝(40～60):1(v/v)，示例性为40:1、50:1、60:1。
[0024]
优选地，所述化合物3的合成路线如下：
[0025][0026]
根据本发明的实施方案，所述化合物2由如下方法制备得到，包括：将2,3,3-三甲基-3h-吲哚和对溴苯甲酸进行反应，得到化合物2。
[0027]
优选地，所述2,3,3-三甲基-3h-吲哚与对溴苯甲酸的摩尔比为1：(1～2)，示例性为1:1、1:1.2、1:2。
[0028]
优选地，所述化合物2的制备方法可以在溶剂如有机溶剂的存在下进行。例如，所述的有机溶剂可以选自乙腈。
[0029]
优选地，所述化合物2的制备方法还包括待反应结束后，从反应后的混合物中分离得到固体产物的步骤。例如，将反应液倒入无水乙醚中，抽滤、用无水乙醚洗涤，收集滤饼，干燥，得到化合物2。
[0030]
根据本发明的实施方案，所述化合物1由如下方法制备得到，包括：将环己酮和三氯氧磷进行反应，得到化合物1。
[0031]
优选地，所述环己酮与三氯氧磷的摩尔比为1：(0.5～2)，示例性为1:0.5、1:1、1：
2。
[0032]
优选地，所述化合物1的制备方法可以在溶剂如有机溶剂的存在下进行。例如，所述的有机溶剂可以选自dmf。
[0033]
优选地，所述化合物1的制备方法还包括待反应结束后，从反应后的混合物中分离得到固体产物的步骤。例如，将反应液倒入碎冰中，抽滤、用冰乙酸乙酯洗涤，收集滤饼，干燥，得到化合物1。
[0034]
优选地，所述化合物1的合成路线如下：
[0035][0036]
根据本发明的实施方案，所述如式ⅰ所示结构的化合物的制备方法，包括以下步骤：
[0037]
(1)环己酮和三氯氧磷以dmf为溶剂合成化合物1；所述化合物1的结构式如下：
[0038][0039]
(2)由2,3,3-三甲基-3h-吲哚和对溴苯甲酸以乙腈为溶剂合成化合物2；所述化合物2的结构式如下：
[0040][0041]
(3)由化合物1、化合物2在碱作用下，以乙醇为溶剂合成化合物3；所述化合物3的结构式如下：
[0042][0043]
(4)由化合物3、硫代吗啉以dmf为溶剂合成式i化合物；
[0044]
式i化合物的反应路线如下：
[0045][0046]
本发明还提供如式i所示结构的化合物在制备荧光探针中的应用。
[0047]
本发明还提供一种式ⅱ所示结构的化合物：
[0048][0049]
其中：m、n、x、y和z均为大于或等于1的数，例如，m、n、x、y和z各自独立地选自1-100的数，优选各自独立地选自40～60的数，示例性为40、50、60。
[0050]
本发明还提供上述式ⅱ所示结构的化合物的制备方法，包括：将式i所示结构的化合物与聚il-nh2离子液体(pil)发生酰胺键反应得到近红外荧光探针接枝的聚il-nh2离子液体，再与改性的透明质酸(ha-qa-ald)发生席夫碱反应和酰胺键反应制备得到ⅱ所示结构的化合物；
[0051]
所述聚il-nh2离子液体(pil)的结构式为：
[0052][0053]
其中：m、n均为大于或等于1的数，例如，m、n各自独立地选自1-100的数，优选各自独立地选自40～60的数，示例性为40、50、60。
[0054][0055]
根据本发明的实施方案，所述式i所示结构的化合物与聚il-nh2离子液体质量比为1:(4～6)，示例性为1:4、1:5、1:6。
[0056]
根据本发明的实施方案，所述改性的透明质酸(ha-qa-ald)与近红外荧光探针接枝的聚il-nh2离子液体的质量比为(1～4):5，示例性为1:5、2:5、4:5。
[0057]
根据本发明的实施方案，所述改性的透明质酸(ha-qa-ald)中ha-qa的比例为46％-53％，示例性为46％、50％、53％。
[0058]
根据本发明的实施方案，所述聚il-nh2离子液体(pil)由如下方法制备得到，包括：将化合物4与丙烯酰胺在引发剂作用下进行反应，得到聚il-nh2离子液体(pil)；
[0059]
所述化合物4具有如下结构：
[0060][0061]
优选地，所述化合物4与丙烯酰胺的反应质量比为1：(1～2)，示例性为1:1、1:1.4、1:2。
[0062]
优选地，所述化合物4与引发剂的反应质量比为(10～15)：1，示例性为10:1、12.5:1、15:1。例如，所述引发剂选自过硫酸铵。
[0063]
优选地，所述聚il-nh2离子液体(pil)的反应可以在溶剂存在下进行。例如，所述的溶剂可以选自缓冲溶液。
[0064]
优选地，所述反应可以在20℃至100℃温度下进行。
[0065]
优选地，所述聚il-nh2离子液体(pil)的合成路线如下：
[0066][0067]
根据本发明的实施方案，所述化合物4由如下方法制备得到，包括：将1-(3-氨丙基)-咪唑与4-氯甲基苯乙烯进行反应，然后与zncl2的乙醇溶液进行zncl
3-配位和cl-配位的置换，得到化合物4。
[0068]
优选地，所述1-(3-氨丙基)-咪唑与4-氯甲基苯乙烯的反应摩尔比为1：(0.5～2)，示例性为1:0.5、1:1、1:2。
[0069]
优选地，所述1-(3-氨丙基)-咪唑与4-氯甲基苯乙烯反应可以在溶剂如有机溶剂的存在下进行。例如，所述的有机溶剂可以选自甲醇。
[0070]
优选地，所述化合物4的制备方法还包括待反应结束后分离得到粗产物的步骤。例如，用过滤，旋干溶剂得到粗产物。优选地，所述制备方法还包括对所述粗产物进行纯化得到化合物4的步骤。例如，所述纯化可以采用柱层析色谱柱分离，得到化合物4。优选地，所述柱层析色谱柱分离的洗脱液为二氯甲烷和甲醇＝(90～110):1(v/v)，示例性为90:1、100:1、110:1。
[0071]
优选地，所述化合物4的合成路线如下：
[0072][0073]
根据本发明的实施方案，所述改性的透明质酸(ha-qa-ald)的结构式为：
[0074][0075]
其中：x、y和z均为大于或等于1的数，例如，x、y和z各自独立地选自1-100的数，优
选各自独立地选自40～60的数，示例性为40、50、60。
[0076]
根据本发明的实施方案，所述改性的透明质酸(ha-qa-ald)由如下方法制备得到，包括：先通过naio4氧化透明质酸得到式ⅲ所示结构的化合物，再与吉拉尔特试剂t反应，得到改性的透明质酸(ha-qa-ald)；
[0077]
式ⅲ所示结构的化合物的结构式如下：
[0078][0079]
其中：x、y均为大于或等于1的数，例如，x、y各自独立地选自1-100的数，优选各自独立地选自40～60的数，示例性为40、50、60。
[0080]
优选地，所述透明质酸与naio4的反应质量比为1：(0.4～1)，示例性为1:0.4、1:0.6、1:1。
[0081]
优选地，所述式ⅲ所示结构的化合物与吉拉尔特试剂t的反应质量比为5：(1～3)。
[0082]
优选地，所述式ⅲ所示结构的化合物与吉拉尔特试剂t的反应可以在溶剂中进行，所述溶剂可以为缓冲溶液。
[0083]
优选地，所述式ⅲ所示结构的化合物与吉拉尔特试剂t的反应在酸性条件下进行。例如，在ph值为4.5-5下进行。
[0084]
优选地，所述式ⅲ所示结构的化合物与吉拉尔特试剂t的反应可以在室温下进行。
[0085]
优选地，所述改性的透明质酸(ha-qa-ald)的制备方法还包括待反应结束后对产物进行纯化。例如，用ph＝7的nacl溶液透析2天，再放入缓冲溶液中透析2天。
[0086]
优选地，所述改性的透明质酸(ha-qa-ald)的制备方法还包括纯化后的产物进行干燥。
[0087]
优选地，所述改性的透明质酸(ha-qa-ald)的合成路线如下：
[0088][0089]
除非特别说明，本发明中采用的缓冲溶液均为ph＝7.4的0.01mol/l的pbs缓冲溶液。
[0090]
本发明还提供如式ⅱ所示结构的化合物在制备荧光探针中的应用。优选在制备皮肤伤口修复药物中的应用。
[0091]
本发明还提供一种荧光探针，其包含式ⅱ所示结构的化合物。
[0092]
本发明还提供一种试剂盒，其包含上述荧光探针。
[0093]
本发明还提供一种生物传感器，其包含上述荧光探针。
[0094]
本发明还提供上述荧光探针、试剂盒和/或生物传感器在动物活体成像系统中的应用。优选在近红外荧光ⅰ区动物活体成像系统中的应用。
[0095]
本发明还提供上述荧光探针、试剂盒和/或生物传感器在检测hclo水平中的应用。
[0096]
本发明还提供上述荧光探针、试剂盒和/或生物传感器在制备促进伤口愈合药物中的应用。优选在制备促进糖尿病引发的皮肤伤口愈合药物中的应用。
[0097]
本发明的构思和原理说明如下：通过物理交联形成的键较弱，但形成键和重建动态平衡的速度更快。因此通过物理交联形成的水凝胶的机械强度较弱，不适合动态伤口。而通过化学交联可以形成更强的键，但形成键和重建动态平衡的速度较慢。因此，引入化学交联可提高水凝胶的机械强度。本发明利用氨基和羧基能形成物理交联-酰胺键，同时醛基和氨基易于发生化学交联-席夫碱反应的特点，首先制备了含有羧基功能化的nir荧光探针和含有氨基功能化的离子液体，离子液体在聚合后先与hclo反应荧光猝灭性的nir探针混合，再向混合物中加入改性的透明质酸，用于发生物理交联(酰胺键反应)和化学交联(席夫碱反应)，从而使nir荧光探针通过酰胺键与聚离子液体相结合，改性的透明质酸又通过酰胺键和席夫碱反应与聚离子液体连接形成3d立体网状结构的水凝胶，水凝胶通过nir荧光成
像可在生理状态下可视化和量化伤口处的hclo水平，从而得到一种新型多功能离子液体&nir成像水凝胶。
[0098]
本发明的有益效果:
[0099]
荧光探针可用于各种分析物的定量和定性分析。近红外(nir)荧光探针由于具有背景干扰少、组织穿透力强、组织损伤小等优点而被广泛使用。但现有技术中报道大多数nir探针表现出小的斯托克斯位移(通常小于30nm)，并且荧光量子产率低(低于水溶液中的0.1)，生物成像的对比度和空间分辨率受到严格限制。本发明的近红外荧光探针scy-7的激发波长为680nm，发射波长为778nm，其斯托克斯位移高达98nm，且荧光量子产率在甲醇中为0.18。将其用于对活细胞和小鼠进行成像，对比度较强、且空间分辨率较好，同时组织成像深度令人满意。同时本发明的离子液体是具有优异化学和热稳定性的熔盐，被归类为绿色溶剂，它可以发生聚合反应形成聚离子液体，聚离子液体再重复的单元上存在阴离子和阳离子电解质基团，因而具有良好的离子电导率。同时，离子液体和聚离子液体均已被证明对革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌和真菌具有良好的抗菌性能。透明质酸(ha)是一种高分子的聚合物，是由单位d-葡萄糖醛酸及n-乙酰葡糖胺组成的高级多糖，其无毒无色无味，能刺激上皮细胞迁移，增强血管生成并减轻炎症的天然聚合物，是开发水凝胶的理想材料。本发明通过将含有正电荷活性基团的1-(3-氨基丙基)-3-(4-乙烯基苄基)咪唑盐离子液体聚合后，与双羧基功能的nir荧光探针混合，通过酰胺键将nir荧光探针接枝于聚离子液体上，同时再加入改性的透明质酸溶液，通过化学和物理交联(席夫碱和酰胺键连接)形成3d网状聚合物，从而制备出一种新型多功能离子液体-nir探针水凝胶pil-ha。本发明的水凝胶具有良好的防冻性能、机械性能和生物相容性，不仅具有与皮肤组织相似的电导率，而且在皮肤上具有优异的黏附性能，可在不对皮肤产生二次伤害的情况下轻易去除；同时在不外加抗生素的情况下，本发明的水凝胶对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和芽孢杆菌具有明显的抑制作用，其对急性伤口和糖尿病皮肤伤口的治疗结果均优于商业tegaderm
tm
薄膜，通过nir荧光活体成像结果显示本发明的水凝胶还可以在治疗伤口的同时，实时检测伤口处的hclo水平。具体而言：
[0100]
(1)本发明的nir荧光探针水凝胶pil-ha可以通过活体成像来实时检测伤口处的hclo水平，以降低急性伤口向慢性伤口转换的概率，从而达到对伤口治疗和检测同步进行的目的。
[0101]
(2)本发明的nir荧光探针水凝胶pil-ha拥有优异的抗菌性能，其聚pil-nh2离子液体所含的正电荷基团可以通过与细菌细胞壁的阴离子基团产生静电相互作用以破坏细菌的完整性，从而起到良好的杀菌作用。
[0102]
(3)本发明的改性透明质酸的醛基和羧基可以与皮肤组织的氨基之间发生化学反应，同时改性的透明质酸和水凝胶中的正电荷基团与粘液膜上带负电的唾液酸基团和细胞膜的磷脂之间相互结合，以赋予水凝胶良好的粘合性能。
[0103]
(4)本发明的水凝胶结构稳定，凝胶时间短(3min内)，粘合性能优异，可牢固的黏附在皮肤上和伤口部位，不仅具有良好的止血性能，而且能在不对伤口造成二次伤害的情况下轻易的去除。
[0104]
(5)本发明的水凝胶随着聚pil-nh2离子液体含量的增加(2wt％-8wt％)，水凝胶的交联密度也逐渐提高，且水凝胶的电导率从0.04ms/cm增加到0.67ms/cm。本发明的水凝
胶具有与皮肤组织相似的电导率，因而在转移生物电信号和加速伤口愈合的过程中具有巨大的应用潜力。
[0105]
(6)本发明的水凝胶具有良好的防冻能力，其可以在温度达到-10℃的情况下，仍然具有良好的导电性、拉伸和压缩性能，且拉伸压缩后能在3s内迅速恢复原样，其优异的柔韧性可以保护组织不受潜在的伤害。
[0106]
(7)本发明的nir荧光探针水凝胶pil-ha在正常和糖尿病小鼠全厚度皮肤损伤模型的治疗中，对伤口的愈合率、肉芽组织的厚度、促炎症因子、肿瘤坏死因子和白细胞介素的含量，表现出远优于商业tegaderm
tm
薄膜的治疗效果。
附图说明
[0107]
图1a是nir荧光探针scy-7的1h nmr谱图，图1b是nir荧光探针scy-7的红外光谱图，图1c是nir荧光探针scy-7的质谱图，图1d是nir荧光探针scy-7的紫外荧光光谱图。
[0108]
图2a是nir荧光探针scy-7的ph稳定性图，图2b是nir荧光探针scy-7的选择性实验结果图，图2c是nir荧光探针scy-7对hclo的荧光强度变化图，图2d是nir荧光探针scy-7与hclo浓度之间的线性关系图。
[0109]
图3是il-nh2离子液体的1h nmr谱图。
[0110]
图4是改性透明质酸ha-qa-ald、ha-ald和ha的红外光谱图。
[0111]
图5a是pil-ha-2水凝胶成胶的制备流程图，图5b是pil-ha-2水凝胶的胶解图；图5c是pil-ha-x(x＝1.2.3.4)水凝胶在手背上的黏附示意图；图5d是pil-ha-x(x＝1.2.3.4)水凝胶的凝胶时间示意图。
[0112]
图6a是pil-ha-x(x＝1、2、3、4)水凝胶的红外光谱图，图6b是pil-ha-x水凝胶的xrd图，图6c是pil-ha-x水凝胶的热重图，图6d是pil-ha-2水凝胶的zeta点位图。
[0113]
图7a是pil-ha-1水凝胶的sem图，图7b是pil-ha-2水凝胶的sem图，图7c是pil-ha-3水凝胶的sem图，图7d是pil-ha-4水凝胶的sem图。
[0114]
图8a是pil-ha-x(x＝1.2.3.4)水凝胶的拉伸测试曲线图，图8b是pil-ha-x水凝胶的压缩测试曲线图，图8c是pil-ha-2水凝胶在压缩测试后3s内迅速恢复的示意图，图8d是pil-ha-x水凝胶的猪皮上进行剪接塔切实验的曲线图。
[0115]
图9a是pil-ha-x(x＝1.2.3.4)水凝胶在溶胀前后的对比图，图9b是pil-ha-x水凝胶溶胀前后质量对比的柱状图，图9c是溶胀前后pil-ha-x水凝胶底面积对比的柱状图。
[0116]
图10a是用圆盘法评估本发明制得的pil-ha-x(x＝1.2.3.4)水凝胶的抗菌能力图，图10b是对圆盘法定性评估水凝胶产生抑菌面积的大小的统计图，图10c是定量评估本发明制得的pil-ha-x水凝胶的抗菌能力图，图10d是用菌落计数法评估水凝胶抑菌率的统计图。
[0117]
图11a是本发明制得的pil-ha-x(x＝1.2.3.4)水凝胶对蛋白质吸附性能的测试图，图11b是本发明制得的pil-ha-x水凝胶的含水量柱状图，图11c是展示了本发明制得的pil-ha-x水凝胶最大的拉伸形变。图11d是统计pil-ha-x水凝胶伸长率的柱状图。
[0118]
图12a是本发明制得nir荧光探针scy-7直接和成纤维细胞l929共培养1天和2天后的活死细胞染色图，图12b是本发明制得制得nir荧光探针scy-7直接和胚胎成纤维细胞nih-3t3共培养1天和2天后的活死细胞染色图，图12c是本发明制得的pil-ha-x(x＝
1.2.3.4)水凝胶和成纤维细胞l929共培养1天和2天后的活死细胞染色图，图12d是本发明制得的pil-ha-x水凝胶和胚胎成纤维细胞nih-3t3共培养1天和2天后的活死细胞染色图。
[0119]
图13a是本发明制得nir荧光探针scy-7直接和成纤维细胞l929共培养1、2和3天后的细胞存活数目统计图，图13b是本发明制得制得nir荧光探针scy-7直接和胚胎成纤维细胞nih-3t3共培养1、2和3天后的细胞存活数目统计图，图13c是本发明制得的pil-ha-x(x＝1.2.3.4)水凝胶溶胀平衡后和成纤维细胞l929共培养1、2和3天后的细胞存活数目统计图，图13d是本发明制得的pil-ha-x水凝胶溶胀平衡后和胚胎成纤维细胞nih-3t3共培养1、2和3天后的细胞存活数目统计图。
[0120]
图14a是本发明制得的pil-ha-x(x＝1.2.3.4)水凝胶溶血能力测试图；图14b是本发明制得的pil-ha-x水凝胶对血的细胞粘附试验的测试图。
[0121]
图15a是本发明制得的pil-ha-x(x＝1.2.3.4)水凝胶电导率的测试图，图15b是pil-ha-2水凝胶的导电示意图。
[0122]
图16a是本发明制得的pil-ha-2水凝胶的低温导电图，图16b是pil-ha-2水凝胶在低温下的拉伸-恢复图，图16c是pil-ha-2水凝胶在低温下的压缩-恢复图。
[0123]
图17a是空白对照组和本发明制得的pil-ha-2水凝胶体外止血能力对比图，图17b是空白对照组和本发明制得的pil-ha-2水凝胶体内止血能力对比图，图17c是空白对照组和本发明制得的pil-ha-2水凝胶止血能力统计图。
[0124]
图18a是本发明制得的pil-ha-2水凝胶对猪皮的黏附图，图18b展示了pil-ha-2水凝胶可以轻易剥离皮肤，图18c展示了pil-ha-2水凝胶对不同物品的黏附原理图及在不同物品上的黏附图。
[0125]
图19a是空白组与本发明制得的pil-ha-x(x＝1.2.3.4)水凝胶治疗6、12和18h前后的体外l929细胞划痕的显微图像，图19b是空白组与本发明制得的pil-ha-x水凝胶治疗6、12和18h前后的体外l929细胞划痕距离的量化统计图，图19c是空白组与本发明制得的pil-ha-x水凝胶治疗6、12和18h前后的体外nih-3t3细胞划痕的显微图像，图19d是空白组与本发明制得的pil-ha-x水凝胶治疗6、12和18h前后的体外nih-3t3细胞划痕距离的量化统计图。
[0126]
图20a是本发明制得的nir荧光探针scy-7与l929细胞的倒置荧光成像显微镜图，图20b是本发明制得的nir荧光探针scy-7与nih-3t3细胞的倒置荧光成像显微镜图，图20c是本发明制得的nir荧光探针水凝胶pil-ha-2与l929细胞的倒置荧光成像显微镜图，图20d是本发明制得的nir荧光探针水凝胶pil-ha-2与nih-3t3细胞的倒置荧光成像显微镜图。
[0127]
图21a是本发明制得的nir荧光探针水凝胶pil-ha-2在不同血糖值的糖尿病小鼠伤口上拍摄的nir荧光活体成像图，图21b是对不同血糖的糖尿病小鼠身上黏附水凝胶的荧光值量化并做图，图21c是本发明制得的nir荧光探针水凝胶pil-ha-2对不同血糖值的糖尿病小鼠伤口的nir荧光活体成像图，图21d是对不同血糖的糖尿病小鼠伤口处的荧光值量化并做图。
[0128]
图22a是随伤口处pma含量的增加本发明制得的nir荧光探针水凝胶pil-ha-2对正常血糖小鼠伤口的nir荧光活体成像图；图22b是小鼠身上黏附水凝胶的荧光值随伤口处pma含量的变化图；图22c是随伤口处hclo含量的增加本发明制得的nir荧光探针水凝胶pil-ha-2对正常血糖小鼠伤口的nir荧光活体成像图；图22d是小鼠身上黏附水凝胶的荧光
值随伤口处hclo含量的变化图。
[0129]
图23a是第0、3、7、10和12天采用不同方案治疗皮肤急性伤口的荧光活体成像图，图23b是第0、3、7、10和12天用不同方案治疗皮肤急性伤口愈合程度的柱状图，图23c是第0、3、7、10和14天用不同方案治疗糖尿病皮肤慢性伤口的荧光活体成像图，图23b是第0、3、7、10和14天用不同方案治疗糖尿病皮肤慢性伤口愈合程度的柱状图。
[0130]
图24是对伤口愈合完成后的糖尿病小鼠的器官进行的苏木精伊红(h&e)染色图像。
[0131]
图25a是经过本发明制备的pil-ha-2水凝胶治疗急性伤口12天后的h&e染色图；图25b是经过本发明制备的pil-ha-2水凝胶治疗急性伤口12天后的masson染色图；图25c是对急性伤口处血管数量的定量分析图；图25d是对急性伤口处胶原蛋白指数的定量分析图；图25e是对急性伤口处表皮厚度的定量分析图。
[0132]
图26a是经过商业薄膜3m tegaderm
tm
和pil-ha-x(x＝1.2.3.4)水凝胶治疗的糖尿病小鼠皮肤伤口的h&e染色图；图26b是经过商业薄膜3m tegaderm
tm
和pil-ha-x(x＝1.2.3.4)水凝胶治疗的糖尿病小鼠皮肤伤口的masson染色图；图26c是糖尿病小鼠皮肤伤口处血管数量的定量分析图；图26d是糖尿病小鼠皮肤伤口处胶原蛋白指数的定量分析图，图25e是糖尿病小鼠皮肤伤口处的表皮厚度的定量分析图。
[0133]
图27a是经过本发明制备的pil-ha-2水凝胶和商业薄膜3m tegaderm
tm
治疗急性伤口12天后对il-6的免疫荧光染色图；图27b是经过本发明制备的pil-ha-2水凝胶和商业薄膜3m tegaderm
tm
治疗急性伤口12天后对tnf-α的免疫荧光染色图；图27c是经过商业薄膜3m tegaderm
tm
和pil-ha-x(x＝1.2.3.4)水凝胶治疗糖尿病小鼠皮肤伤口后对il-6的免疫荧光染色图；图27d是经过商业薄膜3m tegaderm
tm
和pil-ha-x(x＝1.2.3.4)水凝胶治疗糖尿病小鼠皮肤伤口后对tnf-α的免疫荧光染色图。
[0134]
图28是本发明制得nir荧光探针pil-ha水凝胶促进糖尿病伤口的愈合且快速可视化监测糖尿病伤口hclo水平的原理图。
具体实施方式
[0135]
下文将结合具体实施例对本发明的技术方案做更进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。
[0136]
除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过已知方法制备。
[0137]
实施例1
[0138]
多功能离子液体&nir成像水凝胶pil-ha的制备方法，包括以下步骤：
[0139]
(1)nir荧光探针scy-7的制备：
[0140]
将10ml dmf置于50ml单口烧瓶中，在冰浴条件下，搅拌并缓慢加入三氯氧磷溶液(6.8ml，7.5mmol)，搅拌30min，升至室温，加入2ml环己酮，升温至50℃继续反应6h。反应结束后，将反应液分批倒入100g碎冰中，搅拌5h，析出黄色沉淀，抽滤，用冰乙酸乙酯洗涤3次，所得黄色粉末(化合物1)冷藏备用。
[0141]
在氮气气氛下，将2,3,3-三甲基-3h-吲哚(5.0000g、29.06mmol)、对溴苯甲酸
(7.5300g、35.02mmol)置于50ml烧瓶中，加入100ml乙腈，加热至81℃反应10h，冷却至室温，将反应液分批倒入100ml无水乙醚中，立即有沉淀产生，抽滤，用无水乙醚洗涤3次，收集滤饼，真空干燥，得到4.8630g产物(化合物2)。
[0142]
在氮气气氛下，将化合物1(3.0000g、17.4mmol)、化合物2(10.7613g、36.6mmol)、无水醋酸钠(3.0023g，36.6mmol)置于150ml烧瓶中，加入120ml乙醇，加热至70℃反应2h，冷却至室温，用二氯甲烷(4
×
100ml)萃取，收集上层液体，旋转蒸发溶剂，柱层析分离纯化(洗脱剂为二氯甲烷:甲醇＝50:1，v/v)，收集产物，旋转蒸发溶剂，真空干燥，得到2.7487g具有金属光泽的深绿色产物(化合物3)。
[0143]
在氮气气氛下，将化合物3(1.0000g、1.25mmol)、硫代吗啉(388mg、3.76mmol)置于50ml烧瓶中，加入15ml dmf，室温搅拌反应2h，将反应液分批倒入大量无水乙醚中，立即有沉淀产生，抽滤，用无水乙醚洗涤3次，收集滤饼，真空干燥，得0.8152g产物，即为nir荧光探针scy-7。
[0144]
(2)聚il-nh2离子液体的制备：
[0145]
(a)il-nh2离子液体的制备：
[0146]
将8.76g 1-(3-氨丙基)-咪唑(0.07mol)在80ml甲醇中充分溶解后，加入10.68g 4-氯甲基苯乙烯(0.07mol)。在室温条件下，剧烈搅拌12h后，用饱和zncl2的乙醇溶液在30℃下搅拌24h来进行zncl
3-配位和cl-配位的置换。搅拌完成后过滤溶液，将过滤后的溶液经过真空旋转蒸发仪旋干，并通过硅胶柱色谱法用二氯甲烷和甲醇(100/1，v/v)纯化残余产物，得到黄色产物在60℃真空干燥箱里面干燥得到黄色产物1-(3-氨基丙基)-3-(4-乙烯基苄基)咪唑盐离子液体，记为il-nh2离子液体。
[0147]
(b)聚il-nh2离子液体的制备：
[0148]
向10ml圆底烧瓶中加入1ml 0.01mol/l pbs(ph＝7.4)缓冲溶液，向其中加入0.7g丙烯酰胺和0.04g过硫酸铵，再加入0.5g步骤(a)所得il-nh2离子液体，搅拌5min，得到聚il-nh2离子液体，简记为pil。
[0149]
(3)改性透明质酸的制备：
[0150]
(a)改性透明质酸ha-qa的制备：将1g透明质酸(mw＝340 000da)粉末充分溶解在含有100ml 0.01mol/l pbs(ph＝7.4)缓冲溶液的烧杯中，并用锡箔纸将烧杯包裹，获得透明溶液后加入0.6g高碘酸钠，并在室温下搅拌12h。然后将透明溶液在ph＝7的nacl溶液中透析3天，再用去离子水透析2天(mw＝10 000da)。最后将透析完成后的产物在真空冷冻干燥机中冻干得到白色棉花状产物ha-ald。
[0151]
(b)改性透明质酸ha-qa-ald的制备:将步骤(a)所得ha-qa溶解在去离子水中得到浓度为1％(w/w)的ha-ald水溶液，加入0.6g girard
‘
s reagent t，再将溶液的ph值调节为4.5～5后，使反应在室温下搅拌26h，用ph＝7的nacl溶液透析2天，再放入去离子水中透析2天，透析后的产物经真空冷冻干燥机冻干后同样得到白色棉花状产物ha-qa-ald。
[0152]
(4)一种新型多功能离子液体-nir成像水凝胶pil-ha的制备：
[0153]
将步骤(1)制得的nir荧光探针scy-7用100μl甲醇助溶后，加入0.01mol/l pbs(ph＝7.4)将探针的浓度配置为10-5
g/ml，得到nir荧光探针溶液；
[0154]
将步骤(2)所得的聚il-nh2离子液体溶解在0.01mol/l pbs(ph＝7.4)中，依次配成浓度为2wt％，4wt％，6wt％，8wt％的聚il-nh2离子液体溶液；
[0155]
将步骤(3)制得的改性透明质酸ha-qa-ald溶于0.01mol/l pbs(ph＝7.4)中，得到浓度为5wt％的改性透明质酸溶液；
[0156]
取200μl浓度为10-5
g/ml的nir荧光探针溶液分别与1ml的由0.01mol/l pbs(ph＝7.4)溶解的浓度为2wt％，4wt％，6wt％，8wt％的聚il-nh2离子液体溶液混合，再分别加入等体积的5wt％改性透明质酸溶液，均匀混合后，再60℃相互交联1-3min，分别得到多功能离子液体&nir探针水凝胶pil-ha-1，pil-ha-2，pil-ha-3，pil-ha-4，简记为pil-ha-x(其中wt％为所加聚il-nh2离子液体溶液的质量百分含量)。
[0157]
本实施例中制得nir荧光探针scy-7的合成路线如下所示：
[0158][0159]
本实施例中制得聚il-nh2离子液体的合成路线如下所示：
[0160][0161]
本实施例中制得ha-qa-ald的合成路线如下所示：
[0162][0163]
本实施例中制得pil-ha水凝胶的合成路线如下所示：
[0164]
0.01mol/l pbs(ph＝7.4)缓冲溶液记成溶液1；再将0.2g的丙烯酰胺、0.4g的过硫酸铵、200μl的nir荧光探针scy-7和0.5ml的il-nh2溶于3ml 0.01mol/l pbs(ph＝7.4)缓冲溶液中混匀记作溶液2；将1ml溶液1和1ml溶液2混合并置于60℃水浴锅中，3min内便可制得pil-ha水凝胶。
[0179]
图5b是pil-ha-2水凝胶的胶解图。向0.5g pil-ha水凝胶中加入1ml 1mol/l羟胺后，将水凝胶置于37℃中，30min内可实现从凝胶向溶胶的转变过程。这是由于羟胺会竞争pil-nh2中的氨基，从而破坏水凝胶的席夫碱和酰胺键。
[0180]
图5c是pil-ha-x(x＝1.2.3.4)水凝胶在手背上的黏附示意图。图中结果表明pil-ha水凝胶在皮肤上具有良好的粘附性。
[0181]
图5d是pil-ha-x(x＝1.2.3.4)水凝胶的凝胶时间示意图，将pil-ha-x(x＝1.2.3.4)水凝胶置于60℃水浴中，每间隔1min取出观察其凝胶情况并拍照记录。图中结果表明，pil-ha-1凝胶时间最慢为3min，pil-ha-4凝胶时间最快为1min。由此证明本发明的pil-ha水凝胶在60℃情况下可在3min内形成凝胶。
[0182]
图6a是pil-ha-x(x＝1.2.3.4)水凝胶的傅立叶红外光谱图，可以看到在3440cm-1
处有一个宽而强的峰是由于羟基的伸缩振动；2926cm-1
处的特征吸收峰归因于席夫碱和酰胺键之间的碳氢键伸缩振动。由于il-nh2的引入，可以看到咪唑环在1627cm-1
处的特征吸收峰，并且该吸收峰的强度随着il-nh2含量的增加而增加，这证明了il-nh2被成功地引入pil-ha水凝胶中。
[0183]
图6b是pil-ha-x(x＝1.2.3.4)水凝胶的xrd图，其中在2θ＝24.5
°
处出现了一个顿峰，表明pil-ha-x(x＝1.2.3.4)水凝胶为半结晶聚合物。
[0184]
图6c是pil-ha-x(x＝1.2.3.4)水凝胶的热重分析，直接比较可以看出，随着水凝胶中聚il-nh2离子液体浓度的增加，四种pil-ha水凝胶的热稳定常数从106.9℃增加至289.7℃、327.6℃和330.6℃，这可能是因为交联密度的增加导致水凝胶热稳定常数的增加。
[0185]
图6d是pil-ha-2水凝胶的zeta电位图，从图中可以看出pil-ha-2水凝胶的zeta电位为38.31mv，表明该水凝胶表面带正电，这侧面证明了pil-ha-2水凝胶具有抗菌性能。
[0186]
图7a是pil-ha-1水凝胶的sem图，图7b是pil-ha-2水凝胶的sem图，图7c是pil-ha-3水凝胶的sem图，图7d是pil-ha-4水凝胶的sem图。由场发射扫描电镜图可以观察到，所有的pil-ha水凝胶都显示出相互连接的3d多孔结构，且随着聚il-nh2离子液体用量的增加，聚il-nh2离子液体的氨基与改性透明质酸ha-qa-ald中的醛基和羧基反应的机会增大，由此制得的水凝胶的孔径面积从(5000
±
1500)μm2(pil-ha-1水凝胶)降低到(800
±
200)μm2(pil-ha-4水凝胶)，从而形成了更加紧密的网络结构。上述这种3d多孔结构有利于伤口的透气性和细胞的生长存活，并且有利于营养物质的运输和代谢废物的吸收。
[0187]
图8a是pil-ha-x(x＝1.2.3.4)水凝胶的拉伸测试曲线图。测试方法为：将pil-ha-x(x＝1.2.3.4)水凝胶切割成长方体水凝胶(10mm
×
20mm
×
10mm)作为拉伸样品，使用薄膜拉力机(instron5943，美国)测试四种水凝胶的拉伸性能，拉伸速率保持恒定在10mm/min，得出拉力和应力之间的线性关系。从图中可以观察到，随着聚il-nh2离子液体用量的增加，水凝胶的拉伸应力从0.18mpa增至0.43mpa、0.44mpa和0.82mpa。由此表明本发明制得的pil-ha-x(x＝1.2.3.4)水凝胶的拉伸应力优于人体皮肤的可延展性30％-95％。
[0188]
图8b是pil-ha-x(x＝1.2.3.4)水凝胶的压缩性能测试结果，将pil-ha-x(x＝1.2.3.4)水凝胶制作成圆柱形(半径＝10mm，高＝40mm)，通过电子万能材料试验机(ai-7000m，中国)测试四种水凝胶的压缩性能，压缩试验速率为5mm/min，得出压缩和应力之间的线性关系。从图中可以观察到，随着聚il-nh2离子液体用量的增加，水凝胶在压缩80％时的应力从0.21mpa增至0.42mpa、0.55mpa和0.74mpa。
[0189]
图8c展示了pil-ha-2水凝胶在压缩至80％后可在3s内迅速恢复原样。由此表明本发明的pil-ha水凝胶具有与人的皮肤更好的机械性能，因此可以更好地抵抗外力，从而避免组织的潜在损伤。
[0190]
图8d是利用猪皮进行的剪接塔切实验，以评估pil-ha-x(x＝1.2.3.4)水凝胶对皮肤组织的黏附能力。具体实验方法如下：从市场上购来新鲜的猪皮，去除多余的脂肪后将其裁剪为长5cm，宽2cm的长方形，在实验前为了防止猪皮脱水变干，将长方形的猪皮重新浸泡在10ml 0.01mol/l pbs(ph＝7.4)溶液中以确保猪皮始终处于湿润的环境。为了测试水凝胶在猪皮上的粘合性能，取出两块长方形猪皮并用滤纸吸去表面残余的pbs溶液。在室温下，将四种长方体(20mm
×
10mm
×
2mm)的pil-ha-x(x＝1.2.3.4)水凝胶样品分别粘合在两块猪皮之间，并用薄膜拉力机分别夹住上下两块猪皮，使用100n称重传感器以10mm min-1
的应变速率进行测试，结果如图8d所示。从图中可以看出，所有水凝胶的拉伸应力显示出(3.21
±
0.45)kpa至(24.36
±
0.84)kpa的粘合强度。与临床确定的fibringlue粘附强度(约3kpa)相比，本发明的pil-ha-x(x＝2.3.4)水凝胶是其黏附强度的3-8倍。
[0191]
图9a中从左至右依次展示了pil-ha-x(x＝1.2.3.4)水凝胶在3ml 0.01mol/l pbs(ph＝7.4)溶液中达到溶胀极限后的前后变化对比图。从图中可以看出：溶胀后的水凝胶体积有明显的变大，由此表明本发明的pil-ha水凝胶具有较好的吸水性。
[0192]
图9b是pil-ha-x(x＝1.2.3.4)水凝胶在溶胀前后的质量对比图，从图中可以看出：本发明的pil-ha-x(x＝1.2.3.4)水凝胶可以吸收超过自身重量6-11倍的水。
[0193]
图9c是pil-ha-x(x＝1.2.3.4)水凝胶在溶胀前后的底面积对比图，从图中可以看出：与溶胀前相比，本发明的pil-ha-x(x＝1.2.3.4)水凝胶的底面积在溶胀后有6-11倍的增大。
[0194]
图10a是使用圆盘法来定性评估pil-ha-x(x＝1.2.3.4)水凝胶的抗菌能力，方法如下：分别将500μl的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的悬浮液(1
×
108cfu/ml)用滚珠法均匀铺在lb培养基(30ml)上，然后将消毒灭菌后的pil-ha-x(x＝1.2.3.4)水凝胶(1g)分别均匀铺放在培养基表面，并在37℃下孵育24h，观察水凝胶周围的细菌生长情况。从图中可以看出，随着聚il-nh2离子液体用量的增加，水凝胶周围抑菌圈的面积也随之增大，且水凝胶表面无任何菌落生长，由此从侧面验证了pil-ha水凝胶的非释放性抗菌性能。
[0195]
图10b是表征使用圆盘法评估四种水凝胶的抑菌圈的大小来评估水凝胶的抗菌能力。从图中可以看到：不同聚il-nh2离子液体含量的pil-ha水凝胶，随着离子液体用量的增加，水凝胶产生抑菌圈的面积也随之增大。这归因于pil-ha水凝胶中ha-qa-ald上的季铵阳离子和聚il-nh2中带正电荷的咪唑基团可以与细菌细胞壁上带有阴离子的磷酸基团产生静电相互作用，然后亲脂部分插入细菌的磷脂双分子层中，破坏其细胞膜，使细菌裂解而死亡。
[0196]
图10c使用菌落计数法来定量评估pil-ha-x(x＝1.2.3.4)水凝胶的抗菌能力，方
法如下：提前对pil-ha-x(x＝1.2.3.4)水凝胶进行紫外灭菌处理，再将浓度为1
×
108cfu/ml的200μl的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的悬浮液分别转移至灭菌的lb培养基(10ml)中，然后将消毒灭菌后的pil-ha-x(x＝1.2.3.4)水凝胶(1g)分别均匀铺放在培养基表面，并在37℃下以120rpm的速度在摇床孵育，24h后将细菌悬液用lb培养基稀释至原始浓度的10-6
倍，取20μl稀释后的细菌悬液用滚珠法在lb固体培养基上均匀分散，并在37℃下孵育24h。从图中可以看出，随着聚il-nh2离子液体用量的增加，水凝胶的抗菌能力也有所提升，说明了pil-ha水凝胶具有非释放性抗菌的特点。
[0197]
图10d是分别对菌落形成单位(cfu)的数量进行计数，每个菌落重复测试超过三个独立的时间，且采用没有加入水凝胶的细菌悬液作为实验的对照组(control，其抗菌能力视为0，其他组的抗菌率在此基础上计算得到)。与pil-ha-1水凝胶相比，聚il-nh2离子液体用量增大后制得的pil-ha-2、pil-ha-3和pil-ha-4水凝胶的抗菌活性显著提高，尤其是对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的抗菌活性显著提高。此外，pil-ha-2、pil-ha-3和pil-ha-4水凝胶可抑制90％左右的大肠杆菌和95％以上的金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌。上述结果进一步证明了本发明的pil-ha水凝胶对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的有效抗菌活性，也展示了其在治疗细菌感染方面的巨大潜力。
[0198]
图11a是pil-ha-x(x＝1.2.3.4)水凝胶对牛血清白蛋白(bsa)吸附能力的测试结果。方法如下：分别将pil-ha-x(x＝1.2.3.4)四种水凝胶切成长方形(重约1g)，经75％医用酒精消毒1h的同时放入紫外灯下灭菌。在pbs(ph＝7.4，0.01mol/l)中浸泡达到溶胀平衡，然后将处理过的pil-ha-x(x＝1.2.3.4)水凝胶样品分别加入5ml的10mg/ml的牛血清白蛋白(bsa)溶液中，37℃摇床孵育24h，每个样品重复三次，用shimadzu uv-2550在595nm处测定溶液的紫外光强度以计算出溶液中残留的bsa，将不加入水凝胶样品的牛血清白蛋白(bsa)溶液设为对照组，根据吸光光度法测定的bsa浓度从而评价水凝胶材料的吸附能力。计算公式为:其中co和cx分别是对照组和加入pil-ha-x(x＝1.2.3.4)水凝胶吸附后的bsa浓度(mg/ml)，w是pil-ha水凝胶的重量，v是加入bsa的体积。pil-ha-1，pil-ha-2，pil-ha-3和pil-ha-4对bsa的吸附量分别为(123.64
±
7.83)mg/g，(236.97
±
13.24)mg/g，(368.69
±
17.93)mg/g和(503.84
±
15.05)mg/g。其中pil-ha-4对bsa的吸附能力最好，其吸收能力不仅和水凝胶中的孔结构有关，同时带正电荷的pil和bsa之间的静电相互作用也有助于提高水凝胶对bsa的吸附能力。
[0199]
图11b是pil-ha-x(x＝1.2.3.4)水凝胶的含水量柱状图。在温度＜-90℃，真空度：＜5pa的情况下，将pil-ha-x(x＝1.2.3.4)水凝胶进行真空冷冻干燥24h后再次称重记录，通过计算冻干后失去的水分而推算出四种水凝胶的含水量。计算公式为:其中w0和w
x
分别是冻干前、后水凝胶的质量。从图中可以看出：本发明的pil-ha-x(x＝1.2.3.4)水凝胶的含水量均约为(80
±
3)％，从而使得其可以为伤口提供一个湿润的环境，以减缓伤口疼痛，并促进伤口愈合。
[0200]
图11c是将pil-ha-x(x＝1.2.3.4)水凝胶切成等体积的长方体(12mm
×
5mm
×
3mm)，并用双手拉伸以记录pil-ha-x(x＝1.2.3.4)四种水凝胶的最大拉伸形变率。从图中可以看出，随着聚il-nh2离子液体用量的增加，水凝胶的拉伸形变率也随之增大，说明其具有优异的机械性能。
[0201]
图11d用来表征四种水凝胶的最大拉伸形变率，从图中可以看出，随着水凝胶中聚pil-nh2离子液体含量的增加，水凝胶的最大拉伸形变也从215％逐渐上升到248％、426％和837％。由此表明本发明水凝胶具有良好的拉伸形变性能，因此可以更好地保护皮肤组织。
[0202]
图12a、图12b是将本发明中的nir荧光探针scy-7分别与小鼠成纤维细胞l929(1
×
106细胞/培养皿)和胚胎成纤维细胞nih-3t3(1
×
106细胞/培养皿)共培养24h(1天)和48h(2天)的活死细胞染色图，同时使用钙黄绿素双荧光染色法来进行活死细胞染色并观察。从图中可以看出，几乎没有出现红色的死细胞，说明了该nir荧光探针scy-7具有良好的生物相容性。
[0203]
图12c、图12d是本发明制得的pil-ha-x(x＝1.2.3.4)水凝胶(0.1g)在充分溶胀平衡并消毒后与小鼠成纤维细胞l929(1
×
106细胞/培养皿)和胚胎成纤维细胞nih-3t3(1
×
106细胞/培养皿)共培养24h(1天)和48h(2天)的活死细胞染色图，pil-ha-x(x＝1.2.3.4)水凝胶的质量为0.5g。同样使用钙黄绿素进行活死细胞染色并观察。从图中可以看出，全是绿色的活细胞，而几乎没有出现红色的死细胞，由此表明本发明的pil-ha-x(x＝1.2.3.4)水凝胶具有良好的生物相容性。
[0204]
图13a、图13b分别是小鼠成纤维细胞l929(1
×
105细胞/孔)和胚胎成纤维细胞nih-3t3(1
×
105细胞/孔)与本发明的nir荧光探针scy-7直接接触1天、2天和3天的细胞存活比例统计图。从图中可以看出l929与nih-3t3细胞的细胞活性均在90％以上，并且对照组和探针处理组之间没有观察到统计学上显著差异，进一步说明了本发明的nir荧光探针scy-7具有良好的生物相容性。
[0205]
图13c、图13d分别是小鼠成纤维细胞l929和胚胎成纤维细胞nih-3t3与本发明制得的pil-ha-x(x＝1.2.3.4)水凝胶在充分溶胀平衡并消毒后直接接触1天、2天和3天的细胞存活比例统计图。实验方法为：分别将小鼠成纤维细胞l929和胚胎成纤维细胞nih-3t3以1
×
105/孔接种在96孔板中，培养过夜后，将在改良的dmem培养基(10％胎牛血清，1％双抗(青霉素-链霉素))中达到溶胀平衡的10mg pil-ha-x(x＝1.2.3.4)水凝胶和不同量的溶解在改良的dmem培养基中的nir荧光探针scy-7(浓度为5μm、10μm、15μm、20μm)分别与细胞直接接触培养，以nir荧光探针scy-7浓度为0μm作为阴性对照组，以加入200μl 0.01mol/l pbs(ph＝7.4)/孔作为空白组。分别在第1天、2天、3天向96孔板分别加入cck-8溶液(10μl/孔)，并将孔板避光后，继续放在37℃、5％co2的培养箱中培养1h，然后通过酶标仪在450nm波长下测量每个孔的光密度(od)值。则细胞存活率的计算公式为：式中：od
t
、od
blank
、od
neg
分别为实验组、空白组和阴性对照组的光密度。图中结果表明：随着scy-7探针浓度和水凝胶中聚pil-nh2离子液体浓度的增加，尽管细胞的活性略微有所下降，但仍能保持80％以上的存活率。由此表明本发明的scy-7探针和pil-ha水凝胶均具有良好的细胞相容性。
[0206]
图14a是通过体外溶血试验来评估pil-ha-x(x＝1.2.3.4)水凝胶的血液相容性。在溶血试验中，通过摘眼球取血获取小鼠的新鲜血液，再用生理盐水将新鲜的小鼠血液稀释10倍，并混匀后均分为五份，并用生理盐水多次洗涤从全血中收集到的红细胞，最后经生理盐水稀释红细胞至3ml，将长方形的pil-ha-x(x＝1.2.3.4)水凝胶(15mm
×
3mm
×
2mm)分
别放入配置的红细胞原液中，阴性对照和阳性对照则分别加入生理盐水和缓冲溶液。在37℃下孵育6h后取出水凝胶，并将红细胞悬液离心(1200rpm)12min，拍照记录后，吸取上清液用紫外-可见分光光度计在545nm处测定吸光度。将四种水凝胶分别和红细胞在37℃摇床上共培养3h后，取出水凝胶并拍摄四个水凝胶组和阳性对照组(缓冲溶液)的颜色对比。从图中可以看出：加入pil-ha-x(x＝1.2.3.4)水凝胶实验组的上清液均为浅黄色，而阳性对照组则是鲜红色。定量分析可得，加入pil-ha-x(x＝1.2.3.4)水凝胶实验组的溶血率分别为(0.96
±
0.13)％、(1.20
±
2.6)％、(2.11
±
0.09)％和(2.90
±
0.04)％。由此可见水凝胶的溶血率随着离子液体含量的增加而略有增加，但均显示出良好的血液相容性。
[0207]
图14b是通过血细胞粘附试验来评估pil-ha-x(x＝1.2.3.4)水凝胶对血细胞的相容性，首先取5ml新鲜的小鼠全血分别与四个直径为10mm的pil-ha-x(x＝1.2.3.4)水凝胶样品共培养，37℃摇床孵育30min后，小心取出水凝胶并用生理盐水轻轻冲洗两遍并拍照记录。从图中可以看出：水凝胶除了微微变黄外，几乎没有死亡血细胞的黏附，由此可见本发明制备的水凝胶对血细胞几乎无损伤，从而显示出良好的血细胞相容性。
[0208]
图15a是本发明制得的pil-ha-x(x＝1.2.3.4)水凝胶电导率的测试图，通过四探针法评估pil-ha-x(x＝1.2.3.4)水凝胶的电导率，从图中可以看出，随着聚pil-nh2离子液体在水凝胶中含量的增加，水凝胶的电导率也随之从0.04ms/cm增加到0.67ms/cm。由此可见：本发明的水凝胶样品都具有与皮肤组织相似的电导率值，因而在转移生物电信号和加速伤口愈合的过程中具有巨大的潜力。
[0209]
图15b是pil-ha-2水凝胶的导电示意图。方法如下：通过将pil-ha-2水凝胶作为电导体代替电线连接在串联电路的led灯泡上，通过观察连接、切断、再拼接的方式更直观的证明了本发明制得的水凝胶具有良好的导电性。
[0210]
图16a是本发明制得的pil-ha-2水凝胶的低温导电图方法如下：将pil-ha-2水凝胶和温度传感器同时在-20℃冷冻24h后连接到串联电路中，使用pil-ha-2水凝胶作为电导体连接led灯泡和电池。从图中可以看到：在-10℃左右下led灯泡的亮度与室温25℃时的亮度相同，由此表明本发明的水凝胶在低温下具有良好的导电性。
[0211]
图16b是pil-ha-2水凝胶在低温下的拉伸-恢复图。方法如下：将pil-ha-2水凝胶在低温-10℃左右，在拉伸至自身长度的3倍时停止拉伸。从图中可以看出：本发明的水凝胶能在3s内迅速恢复初始状态。
[0212]
图16c是pil-ha-2水凝胶在低温下的压缩-恢复图。方法如下：将pil-ha-2水凝胶在低温-10℃左右，在完全挤压后停止。从图中可以看出：本发明的水凝胶在完全挤压的情况下能在3s内迅速恢复原样。由此表明pil-ha-2水凝胶具有优异的抗冻性能，且在低温下仍具有良好的机械性能。
[0213]
图17a是建立在小鼠断尾出血模型以确认pil-ha-2水凝胶的体外止血能力。实验方法如下：将麻醉后的小鼠用大头针固定在泡沫手术板上，并裁剪大小一致的塑料膜垫在最下面以防止血液渗出并流失，再放滤纸在小鼠尾巴和塑料之间用以吸收尾巴流出的血液，最后用剪刀剪断一只小鼠的尾巴并倾斜泡沫板以诱导尾巴出血，另一只剪断尾巴后立即使用pil-ha-2水凝胶在小鼠断尾处止血，同样倾斜泡沫板以诱导尾巴出血。3min后称量滤纸，至少平行实验三次。从图中可以看出，使用水凝胶组小鼠相比空白组小鼠，滤纸上几乎没有血迹，由此表明本发明的pil-ha水凝胶具有良好的体外止血能力。
[0214]
图17b是建立在小鼠肝出血模型以确认pil-ha-2水凝胶的体内止血能力。实验方法如下：同样将麻醉后的并小鼠固定好，用手术刀切开小鼠胸腔并小心取出肝脏。同理先放上一层塑料膜，再将滤纸放在肝脏和塑料膜之间，用1ml无菌注射器的针头诱导肝脏出血，一组使用pil-ha-2水凝胶用于肝脏止血，另一组则不做任何处理，将泡沫板倾斜使血液更好的流出肝脏，并流向滤纸。3min后称量滤纸，实验也至少平行三次。从图中可以看出，水凝胶组小鼠的滤纸上血流量远小于不做止血处理组小鼠，由此表明本发明的pil-ha水凝胶具有良好的体内止血能力。
[0215]
图17c表征了pil-ha-2水凝胶的止血能力统计图，在断尾组的对照组小鼠的失血量为(130.04
±
10.37)mg，而pil-ha-2水凝胶组仅出现(10.24
±
0.13)mg的失血量。同样在用针头引导小鼠肝脏出血模型中，对照组小鼠肝脏的失血量为(237
±
14.84)mg，而pil-ha-2水凝胶组则仅为(50.3
±
9.79)mg的失血量。且对照组在滤纸上均有明显的血流痕迹，而水凝胶组在滤纸则没有明显血流痕迹。由此表明本发明制备的水凝胶具有良好的止血能力。
[0216]
图18a是本发明制得的pil-ha-2水凝胶对猪皮的黏附图，通过将pil-ha-2水凝胶黏附在猪皮上，随着猪皮的扭曲和折叠，可见不同角度的水凝胶和猪皮的黏附贴合紧密，几乎没有缝隙。
[0217]
图18b展示了pil-ha-2水凝胶在猪皮上从黏附到逐渐剥离的过程，可以看到猪皮几乎没有波动，由此证明pil-ha-2水凝胶可以在不对伤口产生二次伤害的情况下，轻易去除。
[0218]
图18c展示了pil-ha-2水凝胶对不同物品的黏附原理图及在不同物品上的黏附图。从图中可以看出：本发明的pil-ha水凝胶不仅可以紧密地粘附在组织表面，还可以紧密粘附在其他各种材料表面(包括橡胶、纸、聚乙烯(pe)、聚丙烯(pp)、玻璃和金属)。本发明的水凝胶表面的羟基对各种基材具有很强的粘附性，其可通过共价或非共价键与不同的基材相互作用。例如可通过席夫碱在某些含有胺或硫醇基团的特定底物上形成共价键；还有非共价键(例如氢键、π-π堆积等)也可能存在于水凝胶和其他物体表面之间。
[0219]
图19a、图19b、图19c、图19d是通过细胞划痕试验评估pil-ha-x(x＝1.2.3.4)水凝胶对促进成纤维细胞l929和胚胎成纤维细胞nih-3t3细胞增殖能力的大小。实验方法如下：分别将成纤维细胞l929和胚胎成纤维细胞nih-3t3以每孔1.2
×
106个细胞的密度接种在6孔板中，待细胞贴壁并长满后，用200μl的无菌枪头在6孔板的每个孔中垂直划三道划痕，并分别放入四种灭菌后的pil-ha-x(x＝1.2.3.4)水凝胶，用倒置荧光显微镜(ix73，olympus)分别在0h、8h和16h拍照记录细胞划痕之间的距离。并用未添加水凝胶样品的孔作为对照组(control)。从图中可以明显看出：相比对照组，pil-ha水凝胶有助于成纤维细胞l929增殖能力的提高，从而使得加入水凝胶8h后的时间点，水凝胶组的划痕距离为(800
±
50)μm小于对照组的划痕距离(1100
±
50)μm。且上述现象在加入水凝胶16h后的时间点更加明显，即水凝胶组的划痕距离仅为(380
±
30)μm，而对照组的划痕距离高达(780
±
20)μm。同样pil-ha水凝胶明显有助于胚胎成纤维细胞nih-3t3细胞的增殖。加入水凝胶8h的时间点，水凝胶组的划痕距离比对照组的划痕距离小(100
±
10)μm，而在加入水凝胶16h的时间点，水凝胶组的划痕距离仅为(200
±
25)μm，而对照组的划痕距离为(510
±
20)μm。由此可以看出，本发明的水凝胶对成纤维细胞l929和胚胎成纤维细胞nih-3t3的迁移和增值有显著的促进效果。
[0220]
图20a、图20b研究nir荧光探针scy-7对活细胞中hclo的响应及对成纤维细胞l929
和胚胎成纤维细胞nih-3t3细胞的荧光成像实验结果。实验方法如下：将l929细胞和nih-3t3细胞分别与10μm的nir荧光探针scy-7在37℃细胞培养箱下孵育30min后成像，从共聚焦倒置荧光显微镜中可以观察到荧光(nir探针)。而添加10μm scy-7和10μm的hclo后(nir探针+hclo)观察到细胞内荧光猝灭。随后，用水解聚马来酸酐(pma)激活剂刺激l929细胞和nih-3t3细胞，它通过激活磷脂肌醇信号途径(pkc)来触发线粒体ros水平的增加，从而产生内源性hclo。用pma(1ng/ml)刺激后，l929细胞和nih-3t3细胞中的荧光显著猝灭(nir探针+pma)。甲萘威(nac)可以抑制和消除hclo等细胞内活性氧。为了研究nac对细胞内源性hclo水平的影响，首先用pma分别处理l929细胞和nih-3t3细胞20min，然后用nac(5ng/ml)孵育30min。在nac存在下，用探针scy-7孵育的细胞仍然具有荧光反应，进一步证明了nac清除ros的能力(pma+nac+nir探针)。细胞荧光成像实验证实，探针scy-7可以成功实现活细胞中hclo水平的实时视觉检测。
[0221]
图20c、图20d进一步探究了nir荧光探针水凝胶在l929细胞和nih-3t3细胞中对hclo的荧光成像实验。和探针scy-7的荧光成像实验同理，将nir荧光探针水凝胶pil-ha-2按照上述探针scy-7的成像实验方法进行活细胞中hclo的响应及对成纤维细胞l929和胚胎成纤维细胞nih-3t3细胞的荧光成像实验。从共聚焦倒置荧光显微镜中可以观察到加入nir荧光探针水凝胶pil-ha-2后可以观察到荧光(荧光水凝胶)；而添加10μm nir荧光探针水凝胶pil-ha-2和10μm的hclo后(荧光水凝胶+hclo)观察到细胞内荧光猝灭；用pma刺激后，l929细胞和nih-3t3细胞中的荧光显著猝灭(荧光水凝胶+pma)；而用pma分别处理l929细胞和nih-3t3细胞20min，然后用nac(5ng/ml)孵育30min。在nac存在下，用10μm nir荧光探针水凝胶pil-ha-2孵育的细胞仍然具有荧光反应，进一步证明了nac清除ros的能力(pma+nac+荧光水凝胶)。
[0222]
图21a、图21b评估了nir荧光探针水凝胶在活体动物中可视化hclo的适用性。由于近红外光穿透组织较深，自发荧光干扰小，对生物样品损伤小。因此选择昆明(km)小鼠。通过连续5天以50mg kg-1
的剂量向空腹且血糖在3.0～6.0mmol/l之间的健康km小鼠的腹膜内注射链脲佐菌素(stz)来诱导糖尿病小鼠模型。随机选取成功建模的糖尿病小鼠通过腹腔注射5％的水合氯醛来实现全身麻醉，随后用宠物剃毛器剃除小鼠背部的大部分毛发，再用无刺激性的脱毛膏将其清除干净。用酒精棉将其彻底消毒后，使用剪刀和镊子在脱毛部位创建一个10mm
×
10mm的正方形全厚度皮肤缺损(伤口深度达肌膜)。将本发明制备的四种含等量scy-7探针的nir荧光探针水凝胶(pil-ha-2)与小鼠伤口紧密贴合30min后，通过小动物活体成像系统对小鼠的伤口进行活体荧光成像。从图21b中可以看出：nir荧光探针水凝胶pil-ha-2的荧光强度随着糖尿病小鼠血糖的升高，伤口处的hclo水平也随之升高，从而导致nir荧光探针水凝胶的荧光值逐渐降低，而从图21a的荧光成像中也可以看出水凝胶的荧光从较强荧光逐渐猝灭。
[0223]
同理，图21c、图21d评估了nir荧光探针水凝胶对活体动物伤口的可视化hclo的适用性，进一步探究了nir荧光探针水凝胶对糖尿病小鼠伤口处细胞的荧光成像。图21d可以看到小鼠伤口处的荧光值随着小鼠血糖的升高而减小。由此证明本发明制备的nir荧光探针水凝胶可在活体伤口处检测hclo水平，而不受背景信号干扰。更重要的是，由于探针的近红外吸收和发射特性，图21c中的所有图像都是从没有完全脱毛的km小鼠身上获得。
[0224]
图22a、图22d评估了nir荧光探针水凝胶在活体动物中可视化实时检测hclo水平
增加的反应能力。进一步用pma溶液(1ng/ml)模拟伤口处细胞的内源性hclo水平的升高，用hclo溶液(1
×
10-5
)模拟伤口处细胞的外源性hclo水平的升高。随机选取两只非糖尿病的km小鼠，通过麻醉小鼠后，将其背部的毛发全部剔除干净后，建立全厚度皮肤缺损模型，覆上nir荧光探针水凝胶后通过小动物活体成像系统对小鼠进行成像。随后，取下这组小鼠的水凝胶辅料，并在伤口处添加100μl的pma溶液，重新敷上水凝胶辅料，3min后再次对小鼠进行成像，重复四次。随着小鼠伤口处内源性hclo水平的增加，小鼠伤口处nir荧光探针水凝胶pil-ha-2辅料的荧光值也随之降低。
[0225]
同理，取下另一组小鼠的nir荧光探针水凝胶pil-ha-2水凝胶辅料，并在伤口处添加100μl的hclo溶液，再次敷上水凝胶辅料3min后，对小鼠再次进行活体成像。重复四次，可得图22c。从图22d的表征看出，随着小鼠伤口处外源性hclo水平的增加，小鼠伤口处辅料的荧光值也会随之降低。由此证明本发明制得的nir荧光探针水凝胶可以快速、灵敏的实时监测小鼠伤口模型中hclo水平的增加，因而在预防和治疗糖尿病伤口方面发挥了巨大的潜能。
[0226]
为了评估pil-ha-2水凝胶对正常小鼠急性伤口的治疗功效并使用商用tegaderm
tm
薄膜作为对照组(control)。实验方法如下：随机选择正常血糖的小鼠，麻醉并用酒精消毒后，通过剪刀和镊子创建一个深度达肌膜的正方形全厚度皮肤缺损(10mm
×
10mm)，并分别采用nir荧光探针水凝胶pil-ha-2水凝胶辅料、tegaderm
tm
薄膜对其进行治疗。随着手术后时间的增加，小鼠的伤口面积都逐渐减小，治疗12天后，经pil-ha-2水凝胶组处理后的伤口基本闭合。图23a是第0、3、7、10和12天用不同方案治疗急性伤口的荧光活体成像图，图23b是第0、3、7、10和12天用不同方案治疗急性伤口后愈合程度的柱状图。在整个修复过程中(12天)，对伤口面积的定量分析中：采用pil-ha-2水凝胶组的伤口愈合率(98.74％)远远大于商用tegaderm
tm
薄膜组(76.32％)。
[0227]
为了评估pil-ha-x(x＝1.2.3.4)水凝胶对糖尿病小鼠伤口愈合的功效，使用pbs作为空白组(control)，商用tegaderm
tm
薄膜作为对照组。同理，对小鼠麻醉消毒后创建一个深度达肌膜的正方形全厚度皮肤缺损(10mm
×
10mm)，并采用不同的辅料对其进行治疗。随着术后时间的增加，所有组的伤口面积也都逐渐减小。治疗14天后，经pil-ha水凝胶处理后的伤口均基本闭合。图23c是第0、3、7、10和14天用不同方案治疗糖尿病皮肤伤口的荧光活体成像图，图23d是第0、3、7、10和14天用不同方案治疗糖尿病皮肤伤口后愈合程度的柱状图。伤口经过14天的愈合后，经过对伤口面积的定量分析后可得：采用pil-ha-1水凝胶组的伤口愈合率为97.79％，pil-ha-2水凝胶组的伤口愈合率为99.31％，pil-ha-3水凝胶组的伤口愈合率额98.56％，pil-ha-4水凝胶组的伤口愈合率为99.76％，其均远远大于空白组的伤口愈合率(71.61％)和商用tegaderm
tm
薄膜组的伤口愈合率(78.61％)。
[0228]
为了评估水凝胶在小鼠体内的生物相容性。在上述伤口愈合实验完成后，处死小鼠并收集其主要器官(心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏)，用4％多聚甲醛溶液固定，石蜡包埋切片后，用苏木精伊红(h&e)染色，然后使用光学显微镜检查病理学拍照观察，结果如图24所示。以没有采用水凝胶的空白组小鼠器官切片作为对照组(control)。从图中可以看出，小鼠伤口在经过pil-ha水凝胶的治疗后，能够保持正常的组织结构，无任何明显的器官损伤或炎症病变。由此证明了本发明制备的水凝胶具有良好的体内生物相容性。
[0229]
进一步通过组织学分析评估了pil-ha水凝胶对急性伤口愈合的治疗效果，结果如
图25a所示。从图中可以看出，相比较于空白组的皮肤组织h&e染色结果，治疗12天后，对照组(采用tegaderm
tm
薄膜治疗)仍有明显的炎症细胞浸润，而采用本发明pil-ha-2水凝胶治疗组的小鼠皮肤组织的炎症细胞则明显减少，这归因于水凝胶优异的抗菌和抗感染能力。与对照组相比，水凝胶组还显示出了更多新形成的血管和毛囊且更有利于肉芽组织的形成。上述结果表明，本发明的pil-ha水凝胶促进了细胞增殖和迁移。
[0230]
图25b是pil-ha水凝胶和对照组(采用tegaderm
tm
薄膜治疗)对急性伤口治疗12天后的masson染色图。从图中可以看出，与对照组相比，采用本发明的pil-ha水凝胶治疗的伤口显示出更多的胶原蛋白沉积，且胶原蛋白排列更加有序，更接近正常皮肤组织。
[0231]
对急性伤口分别经过nir荧光探针水凝胶pil-ha-2辅料、tegaderm
tm
薄膜(对照组)处理12天后的新生皮肤经roldreview软件对再生血管数量进行定量分析，结果如图25c所示。从图中可以看出，经水凝胶pil-ha-2辅料组处理的小鼠再生皮肤的血管数远多于商业辅料组，说明pil-ha水凝胶可以更有效的促进伤口愈合。
[0232]
对急性伤口分别经过nir荧光探针水凝胶pil-ha-2辅料、tegaderm
tm
薄膜(对照组)处理12天后，对其伤口组织新生皮肤经roldreview软件对的胶原蛋白指数进行定量分析，结果如图25d所示。从图中可以看出，经水凝胶pil-ha-2辅料组处理的小鼠再生皮肤的胶原蛋白指数优于商业辅料组，说明pil-ha水凝胶可以更有效的促进伤口愈合。
[0233]
图25e是急性伤口经过水凝胶组和对照组处理12天后，对其伤口处的表皮厚度用roldreview软件进行定量分析，结果如图25e所示。从图中可以看出，经水凝胶pil-ha-2辅料组处理的小鼠再生皮肤的表皮厚度大于商业辅料组，说明pil-ha水凝胶可以更有效的促进伤口愈合。
[0234]
为了进一步监测本发明制备的pil-ha水凝胶对糖尿病小鼠伤口愈合的促进作用，分别采用商业薄膜3m tegaderm
tm
和pil-ha-x(x＝1.2.3.4)水凝胶敷料对糖尿病小鼠伤口进行愈合治疗14天后，对伤口处皮肤组织进行h&e染色，结果如图26a所示。从图中结果可以看出，相比于空白组(control)和对照组商业3m tegader薄膜，随着本发明水凝胶中聚il-nh2离子液体含量的增加，糖尿病小鼠伤口处的新生血管数量也随之增加，表皮厚度的增加和炎症情况的减轻，也进一步表明了本发明的pil-ha水凝胶对糖尿病小鼠皮肤伤口的愈合具有显著的促进作用。
[0235]
图26b是本发明制备的pil-ha水凝胶、空白组和对照组(商业3m tegader薄膜)处理糖尿病小鼠皮肤伤口14天后的masson染色图。从图中可以看出，经过整个愈合过程，与其他组相比，采用本发明的pil-ha水凝胶治疗的糖尿病小鼠皮肤伤口显示出更多的胶原蛋白沉积，且胶原蛋白排列更加有序，更接近正常皮肤组织。
[0236]
对经过商业薄膜3m tegaderm
tm
和pil-ha-x(x＝1.2.3.4)水凝胶治疗14天后的糖尿病小鼠皮肤伤口的再生血管数量采用roldreview软件进行定量分析，结果如图26c所示。从图中可以看出，经pil-ha-x(x＝1.2.3.4)水凝胶组处理的小鼠再生皮肤的再生血管数量远多于商业辅料组和空白组，说明pil-ha水凝胶可以更有效的促进糖尿病伤口的愈合。
[0237]
对经过商业薄膜3m tegaderm
tm
和pil-ha-x(x＝1.2.3.4)水凝胶治疗14天后的糖尿病小鼠皮肤伤口采用roldreview软件对胶原蛋白指数进行定量分析，结果如图26d所示。从图中可以看出，经pil-ha-x(x＝1.2.3.4)水凝胶组处理的小鼠再生皮肤的胶原蛋白指数远优于商业辅料组和空白组，说明pil-ha水凝胶可以更有效的促进糖尿病伤口的愈合。
[0238]
对经过商业薄膜3m tegaderm
tm
和pil-ha-x(x＝1.2.3.4)水凝胶治疗14天后的糖尿病小鼠皮肤伤口采用roldreview软件对表皮厚度进行定量分析，结果如图26e所示。从图中可以看出，经pil-ha-x(x＝1.2.3.4)水凝胶组处理的小鼠再生皮肤的表皮厚度大于商业辅料组和空白组，说明pil-ha水凝胶可以更有效的促进糖尿病伤口的愈合。
[0239]
为了进一步探究急性伤口处一系列的炎症因子(白细胞介素(il-6)和肿瘤坏死因子(tnf-α))的含量，对经过商业薄膜3m tegaderm
tm
和pil-ha-2水凝胶治疗12天后的糖尿病小鼠皮肤伤口组织处的il-6和tnf-α进行免疫荧光染色，结果分别如图27a、图27b所示。从图中可以看出，与对照组相比，经pil-ha-2水凝胶治疗急性伤口后，糖尿病小鼠皮肤伤口处的促炎趋化因子(il-6和tnf-α)的含量显著降低，由此表明在早期炎症阶段pil-ha水凝胶可能会有效促进巨噬细胞从炎性细胞m1表型向修复性表型m2转化。
[0240]
为了进一步探究糖尿病小鼠皮肤伤口中一系列的炎症因子(白细胞介素(il-6)和肿瘤坏死因子(tnf-α))的含量，对采用商业薄膜3m tegaderm
tm
和pil-ha-x(x＝1.2.3.4)治疗14天后糖尿病小鼠皮肤伤口组织处的il-6和tnf-α进行免疫荧光染色，结果分别如图27c、图27d所示。从图中可以看出，与对照组相比，经过pil-ha水凝胶治疗后，糖尿病小鼠皮肤伤口处的促炎趋化因子(il-6和tnf-α)的含量显著降低，且随着pil-ha水凝胶中聚il-nh2含量的增加，组织处的毛囊数量也随之增加且排列逐渐趋于规整，由此表明在早期炎症阶段pil-ha水凝胶可以有效抗炎症并促进伤口愈合。
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