一种高血压基因多态性检测的引物探针组合物、试剂盒及应用的制作方法

文档序号:33755330发布日期:2023-04-18 15:05阅读:187来源:国知局
一种高血压基因多态性检测的引物探针组合物、试剂盒及应用的制作方法

本发明涉及生物,具体而言,涉及一种高血压基因多态性检测的引物探针组合物、试剂盒及应用。


背景技术:

1、高血压是我国人群脑卒中和冠心病发病及死亡的主要因素,近50年来我国高血压患病率呈明显上升趋势。临床常用的抗高血压药主要包括血管紧张素ii受体拮抗剂(arb)、血管紧张素转换酶抑制剂(acei)、β受体阻滞剂、噻嗪类利尿剂以及钙通道阻滞剂(ccb)。临床实践发现对于相同的抗高血压药物,不同患者对药物的反应存在个体化差异,而基因多态性是药物反应个体化差异的重要影响因素。

2、血管紧张素ⅱ是肾素-血管紧张素系统的重要体液因子,其90%以上的效应通过血管紧张素ⅱ的1型受体(agtr1)介导。agtr1的1166a>c基因多态性可影响arb类药物的治疗效果,c/c基因型个体对arb类药物更加敏感,降压效果更好。

3、血管紧张素转换酶(angio tensin converting enzyme,ace)是肾素-血管紧张素系统的关键酶,由ace基因编码,是acei类药物的作用靶点。ace基因的第16号内含子中存在插入(insertion,i)/缺失(deletion,d)序列,会导致ace基因呈现i/d多态性,从而影响acei类药物的疗效。2017年发布的《高血压合理用药指南(第2版)》(以下简称“指南”)中提出“ace i/d多态性可影响血浆ace的水平,dd基因型个体血浆ace的活性升高,依那普利治疗后ace活性下降更明显;初治的高血压患者中,dd型患者福辛普利的降压疗效增强;在高血压合并左心室肥大和舒张期充盈障碍的患者中,dd基因型患者服用依那普利和赖诺普利后心功能改善程度优于id和ii基因型患者;ii基因型患者应用赖诺普利或卡托普利时肾功能下降更明显”。

4、β肾上腺素受体是β受体阻滞剂类药物的作用靶点,由adrb1基因编码。该受体属于g蛋白偶联受体超家族,通过与gs蛋白偶联调节细胞内camp和l型钙通道的开放频率。adrb1的1165g>c(gly389arg)多态性可影响β受体阻滞剂的疗效。“指南”中提到arg389纯合子高血压患者应用美托洛尔后,血压下降程度是gly389arg杂合子基因型个体的3倍;arg389纯合子基因型心力衰竭患者应用卡维地洛和美托洛尔治疗后左室射血分数改善情况更佳。建议临床医师在应用β1受体阻滞药前进行adrb1多态性检测,并根据其基因型调整用药剂量,以提高疗效。

5、cyp2d6是cyp450家族成员之一,已知经其催化代谢的药物多达80余种,cyp2d6基因多态性直接影响其酶活性,进而影响药物的代谢效率。不同个体cyp2d6活性最大可相差1000倍。中国人群中cyp2d6常见的导致酶活性降低的等位基因是cyp2d6*10,该等位基因导致中间代谢(im)表型,美托洛尔药物代谢效率降低。“指南”提到“酒石酸美托洛尔常释制剂、奈必洛尔盐酸盐、卡维地洛常释制剂主要经cyp2d6代谢”。fda批准的琥珀酸美托洛尔药物说明书中提示美托洛尔主要由cyp2d6代谢。在《β受体阻滞剂在高血压应用中的专家指导建议》文章中提到,cyp2d6基因的多态性是决定美托洛尔药代动力学参数的关键因素,临床应用应当个体化。

6、cyp2c9是cyp450家族成员之一,占肝微粒体p450总量的20%,该酶催化约12%的临床常用药物。中国人群中主要存在的遗传变异为cyp2c9*3,导致酶活性降低。“指南”中提到cyp2c9基因的某些位点多态性会影响氯沙坦活性产物exp-3174的生成,进而影响降压效果。携带cyp2c9*3等位基因的个体服用氯沙坦后,exp-3174的生成减少,氯沙坦的代谢率降低。cyp2c9*1/*3基因型个体中氯沙坦的降压作用下降,需适当增加用药剂量以增强降压疗效。

7、《医疗机构临床检验项目目录2013年版》在“五、临床分子生物学及细胞遗传学检验目录下4、用药指导的分子生物学检验”推荐进行cyp2d6*10、cyp2c9*3、adrb1(1165g>c)、agtr1(1166a>c)、ace(i/d)检测。

8、目前,有多篇公开专利要求保护多重荧光pcr法检测高血压用药基因多态性的试剂盒。但这些专利中的检测试剂盒存在检测限高、灵敏度差、检测时间长等缺陷。如cn201810245896、cn201910614761专利使用溶解曲线法,溶解曲线法灵敏度不高;扩增时间长达3小时,无法实现快速扩增。又如cn201811032803专利使用的是在arms pcr基础上,对taqman探针进行了改造的分型方法。该专利使用的锁核酸探针,价位大约是taqman探针的5-10倍,成本较高。灵敏度仅达到0.1ng/μl。cn111100929a专利使用多重pcr法,在一个反应中检测两个位点的基因型,特异性较差,且一个位点的检测结果需计算两通道的ct值之差来确定,结果判读不直观。cn106755560b专利使用多重pcr法,在一个反应管中使用4个荧光通道,同时检测两个位点的基因型。但反应液中不含酶,酶混合液需要单独添加,使用便利性不够。

9、cn201610732578专利整体使用taqman探针,公用上下游引物,两条探针中间有单个位点突变。但是该检测试剂盒在使用过程中存在稳定性较差的问题,通过实验测试得到如图所示结果,ace i/d位点在37℃24小时内,荧光信号值大幅降低,且空白对照在检测中出现突变信号,影响结果判读。众所周知,在进行体外检测过程中,受环境温度、检测条件限制、操作人员熟练度等因素的影响,探针的稳定性程度直接影响着试剂盒检测准确性和实用性,而现有技术中由于ace i/d位点稳定性无法满足上述要求,进而导致操作使用试剂盒的条件更为苛刻。

10、鉴于此,特提出本发明。


技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种高血压基因多态性检测的引物探针组合物、试剂盒及应用以提高高血压5种相关基因多态性检测的准确性、快捷性和稳定性。

2、本发明是这样实现的:

3、本发明提供了一种高血压基因多态性检测的引物探针组合物,其包括:分别用于检测agtr1基因1166a>c位点、ace基因i/d位点、adrb1基因1165g>c位点、cyp2d6*10位点、cyp2c9*3位点的引物探针组合物;

4、其中,用于检测agtr1基因1166a>c位点的引物探针组合物包括:如seq id no.1-2所示的用于扩增agtr1基因1166a>c位点的引物、如seq id no.3所示的agtr1野生型探针和如seq id no.4所示的agtr1突变型探针,如seq id no.5-6所示的用于内控的引物和如seqid no.7所示的用于内控的探针;

5、用于检测ace基因i/d位点的引物探针组合物包括:如seq id no.8-9以及seq idno.24所示的用于扩增ace基因i/d位点的引物、如seq id no.10所示的ace野生型探针和如seq id no.11所示的ace突变型探针,如seq id no.5-6所示的用于内控的引物和如seq idno.7所示的用于内控的探针;

6、用于检测adrb1基因1165g>c位点的引物探针组合物包括:如seq id no.12-13所示的用于扩增adrb1基因1165g>c位点的引物、如seq id no.14所示的adrb1野生型探针和如seq id no.15所示的adrb1突变型探针,如seq id no.5-6所示的用于内控的引物和如seq id no.7所示的用于内控的探针;

7、用于检测cyp2d6*10位点的引物探针组合物包括:如seq id no.16-17所示的用于扩增cyp2d6*10位点的引物、如seq id no.18所示的cyp2d6*10位点野生型探针和如seq idno.19所示的cyp2d6*10位点突变型探针,如seq id no.5-6所示的用于内控的引物和如seqid no.7所示的用于内控的探针;

8、用于检测cyp2c9*3位点的引物探针组合物包括:如seq id no.20-21所示的用于扩增cyp2c9*3位点的引物、如seq id no.22所示的cyp2c9*3位点野生型探针和如seq idno.23所示的cyp2c9*3位点突变型探针,如seq id no.5-6所示的用于内控的引物和如seqid no.7所示的用于内控的探针。

9、本发明针对人类agtr1基因1166a>c位点、ace基因i/d位点、adrb1基因1165g>c位点、cyp2d6*10位点、cyp2c9*3位点的多态性,分别设计了特定的多重pcr引物和探针,能够分别进行5个位点的定性检测。使用时,仅需将样本分别与探针引物组合物混合,即可上机检测。每个反应体系检测一个位点的多态性,结果判读直观,从而降低了对检测时限、操作熟练度、数据分析等的严苛要求,降低了整体检测难度。

10、发明人发现,ace插入/缺失位点结构特殊,故设计了一条公共上游引物、两组特异性下游引物及探针,以实现该位点检测。一组下游引物和特异探针检测插入型,另一组下游引物和特异探针检测缺失型。通过两个检测通道的信号来判定检测结果,提高检测准确性。同时,由于该位点结构特殊,插入和缺失两种型分别有acagtcactttt序列存在,缺失型的探针无法避开atacagtcactttt序列。在缺失型探针的设计上,就需要考虑其特异性,以及杂合型样本两通道的均一性。发明人利用下游引物与突变探针的部分碱基互补配对,既保证了突变探针的特异性,又满足了较高的扩增效率。但该体系在长期保存过程中,突变探针会与下游引物配对结合,导致空白对照产生突变信号,影响检测结果判读。

11、而对于基因多态性位点,杂合型样本的两种等位基因浓度相等,故在适当的反应条件下,snp位点杂合型样本的两个靶标通道扩增效率应接近。而ace插入/缺失位点不同于其他snp位点,突变等位基因发生288bp碱基序列缺失,因扩增长度变短,缺失型模板的扩增效率一般会高于野生型模板。而这种信号值差异一般呈现此消彼长的特点,在试剂存放、使用过程中,二者差异会进一步变大,导致试剂不稳定。

12、发明人为了进一步优化体系稳定性,发现将突变探针中atacagtcactttt序列往5’端靠近,使探针3’端可特异识别的碱基延长,这样设置可以避免引物与探针在序列上的互补配对,以增加检测特异性。且在调整各通道的信号后,杂合型样本的两个靶标通道更接近,检测效果更优。由此进一步提高了反应体系的准确性、稳定性和适用性。

13、上述引物探针组合的序列如下:

14、

15、

16、在一种可选的实施方式中,探针的5’端均标记有荧光报告基团,探针的3’端均标记有荧光淬灭基团。

17、在一种可选的实施方式中,荧光报告基团包括不限于hex、fam、tet、cf532、joe、tamra、rox、cy3、cy5、texas red、ned、alexa flour或vic,淬灭基团包括不限于mgb、tamra、bhq1、bhq2、bhq3或qsy;

18、在一种可选的实施方式中,荧光报告基团为fam、rox或vic;淬灭基团为mgb或bhq2。

19、本发明还提供了一种高血压基因多态性检测的pcr预混反应液,其包括:分别用于检测agtr1基因1166a>c位点、ace基因i/d位点、adrb1基因1165g>c位点、cyp2d6*10位点、cyp2c9*3位点的pcr预混反应液;

20、其中,用于检测agtr1基因1166a>c位点的pcr预混反应液包括:如seq id no.1-2所示的用于扩增agtr1基因1166a>c位点的引物、如seq id no.3所示的agtr1野生型探针和如seq id no.4所示的agtr1突变型探针,如seq id no.5-6所示的用于内控的引物和如seqid no.7所示的用于内控的探针,以及pcr缓冲液;

21、用于检测ace基因i/d位点的pcr预混反应液包括:如seq id no.8-9以及seq idno.24所示的用于扩增ace基因i/d位点的引物、如seq id no.10所示的ace野生型探针和如seq id no.11所示的ace突变型探针,如seq id no.5-6所示的用于内控的引物和如seq idno.7所示的用于内控的探针,以及pcr缓冲液;

22、用于检测adrb1基因1165g>c位点的pcr预混反应液包括:如seq id no.12-13所示的用于扩增adrb1基因1165g>c位点的引物、如seq id no.14所示的adrb1野生型探针和如seq id no.15所示的adrb1突变型探针,如seq id no.5-6所示的用于内控的引物和如seqid no.7所示的用于内控的探针,以及pcr缓冲液;

23、用于检测cyp2d6*10位点的pcr预混反应液包括:如seq id no.16-17所示的用于扩增cyp2d6*10位点的引物、如seq id no.18所示的cyp2d6*10位点野生型探针和如seq idno.19所示的cyp2d6*10位点突变型探针,如seq id no.5-6所示的用于内控的引物和如seqid no.7所示的用于内控的探针,以及pcr缓冲液;

24、用于检测cyp2c9*3位点的pcr预混反应液包括:如seq id no.20-21所示的用于扩增cyp2c9*3位点的引物、如seq id no.22所示的cyp2c9*3位点野生型探针和如seq idno.23所示的cyp2c9*3位点突变型探针,如seq id no.5-6所示的用于内控的引物和如seqid no.7所示的用于内控的探针,以及pcr缓冲液。

25、预混反应液的提供,极大程度上简化了检测流程,使用时,仅需将样本分别与反应液混合,即可上机检测。每个反应体系检测一个位点的多态性,结果判读直观,从而降低了对检测时限、操作熟练度、数据分析等的严苛要求,降低了整体检测难度。

26、在本发明应用较佳的实施方式中,pcr预混反应液中,各引物探针组合内各引物和探针的浓度均为100~500nm,用于内控的各引物和探针的浓度均为40~60nm。设置pcr预混反应液中,各引物探针组合内各引物和探针的浓度均相同,这样可以保证基于相同浓度的引物和探针对待测样本中靶基因和内参基因进行准确检测,而避免发生由于浓度和探针差异导致高血压基因多态性检测准确性下降。

27、在一种可选的实施方式中,pcr缓冲液包括bsa。

28、发明人发现,bsa可以结合缓冲液或底物dna中抑制限制性内切酶活性的金属离子和其它化学物质,特别是对于agtr1(1166a>c)反应体系,bsa的添加可提高探针识别能力,相对降低背景信号,增加反应的特异性,进一步确保了试剂盒使用过程中的准确性和实用性。而针对其他突变位点(除了agtr1突变位点之外),优选的引物探针即可满足检测特异性的要求,也可选择不额外添加bsa。

29、由于在进行体外检测过程中,受设备性能、环境温度、检测条件限制、操作人员熟练度等因素的影响,反应体系的特异性直接影响着试剂盒检测准确性和实用性。发明人发现,现有的agtr1(1166a>c)位点特异性无法满足上述要求,进而导致操作使用试剂盒的条件更为苛刻,故需要对反应体系进行优化改进。由于agtr1(1166a>c)突变型探针是导致体系特异性不符合的直接原因,但经过逐一筛选,该位点的mgb突变型探针均不能解决或改善上述非特异问题。

30、基于影响荧光pcr反应信号的因素较多,例如探针序列长度、碱基类型、snp位点位置、碱基修饰形态、荧光物类型,以及反应体系中的酶、缓冲液组分等,任何因素的变化均可能对特异性造成较大影响。

31、在一种可选的实施方式中,pcr缓冲液还包括bsa和甘油。发明人通过大量试验发现,bsa和甘油对于agtr1(1166a>c)体系特异性的影响最明显,当在上述反应体系中添加bsa、甘油和dmso时,可提高探针识别能力,相对降低背景信号,增加反应的特异性。而且加入bsa对于体系特异性的影响较大。

32、在一种可选的实施方式中,pcr缓冲液还包括bsa、dmso和甘油。

33、在一种可选的实施方式中,pcr缓冲液还包括终浓度为0.1-0.4mg/mlbsa、2-10%甘油(v/v)和1-4%dmso(v/v)。

34、在一种可选的实施方式中,pcr缓冲液还包括如下至少一种的物质:dntps、taq酶、ung酶、反应buffer、氯化镁、硫酸铵和水。

35、dntps例如包括datp、dctp、dgtp、dutp。

36、taq酶例如选自takara taq hot start酶。

37、本发明还提供了一种高血压基因多态性检测试剂盒,其包括:上述的引物探针组合物或pcr预混反应液,阳性对照品和空白对照。

38、上述试剂盒具有如下优势:(1)可以重复检测各反应液相应基因型1ng(0.5ng/μl,上样体积2μl)检测限的参考品,检出率为100%。具有检测限低的技术优势。

39、(2)使用本发明提供的试剂盒重复检测对应基因型参考品10次,能准确检出对应基因型,且检测结果的ct值变异系数cv≤5%。

40、(3)特异性:本发明提供的试剂盒的同源基因cyp2d7、cyp2c19的序列不会干扰试剂盒的检测结果;而检测agtr1基因范围外snp位点rs5185、ace基因范围外snp位点rs4341、adrb1基因范围外snp位点rs138212934、cyp2d6基因范围外snp位点rs769258、cyp2c9基因范围外snp位点rs17847029,均不影响本试剂盒的检测结果,具有特异性高的优势。

41、(4)抗干扰能力强:当常见内源性干扰物血液中甘油三酯总含量<6mmol/l、总胆固醇含量<9.2mmol/l、血红蛋白含量<5μmol/l、胆红素含量<170μmol/l时,均不会干扰试剂盒的检测结果;当常用治疗药物中氯沙坦药物血药浓度<80ng/ml、卡托普利药物血药浓度<50μg/ml、美托洛尔药物血药浓度<250ng/ml、硝苯地平药物血药浓度<50ng/ml、氢氯噻嗪药物血药浓度<200ng/ml时,不会干扰本发明试剂盒的检测结果。

42、(5)本发明提供的试剂盒可以耐受50ng/μl的人类基因组dna样本,可以检测低至0.5ng/μl的人类基因组dna样本,具有检测dna样本浓度范围广的优势。

43、(6)本发明提供的试剂盒适用于edta和枸橼酸钠抗凝全血样本。

44、在本发明应用较佳的实施方式中,阳性对照品包含:agtr1基因1166a>c位点野生型质粒、agtr1基因1166a>c位点突变型质粒、ace基因i/d野生型质粒、ace基因i/d突变型质粒、adrb1基因1165g>c野生型质粒、adrb1基因1165g>c突变型质粒、cyp2d6*10野生型质粒、cyp2d6*10突变型质粒、cyp2c9*3野生型质粒和cyp2c9*3突变型质粒,且每种阳性对照品的质粒上均含有内参基因;在一种可选的实施方式中,阳性对照品中各种质粒的浓度均为2000-2500copies/μl。例如均为2500copies/μl。

45、空白对照为te溶液。

46、引物探针组合物、pcr预混反应液或上述的高血压基因多态性检测试剂盒在制备用于检测人类高血压基因多态性产品中的应用。

47、在本发明应用较佳的实施方式中,上述应用中,检测方法包括如下步骤:

48、向反应管中加入待测样本dna和pcr预混反应液或引物探针组合物;同时设置阳性对照组和空白对照组,然后进行pcr扩增反应,并采集荧光信号;根据所采集的荧光信号进行结果判定。

49、在本发明应用较佳的实施方式中,待测样本包括不限于外周血、全血样本、血清或血浆。

50、在一种可选的实施方式中,待测样本的dna浓度为0.5-50ng/μl。

51、在本发明应用较佳的实施方式中,pcr扩增反应的条件为:95℃1-5分钟预变性;30-40个循环:95℃2-15秒,60-62℃30-60秒;然后采集荧光。

52、在一种可选的实施方式中,pcr扩增反应的条件为:37℃10-12分钟ung处理;95℃1-5分钟预变性;30-40个循环:95℃2-15秒,60-62℃30-60秒;然后采集荧光。

53、在本发明应用较佳的实施方式中,当采集fam、vic和rox荧光信号时,结果判定的准则为:

54、(1)当阳性对照组均有fam、vic、rox荧光信号起线,空白对照组均无fam、vic、rox荧光起线,待检测样本有rox荧光信号起线时,判定实验成功,可以进行后续分型判定;

55、(2)分型判定如下:

56、

57、在一种可选的实施方式中,当阳性对照组均有fam、vic、rox荧光信号起线,且ct值≤32,空白对照组均无fam、vic、rox荧光起线,或者扩增曲线为直线或轻微斜线,待检测样本有rox荧光信号起线时,判定实验成功,可以进行后续分型判定。

58、本发明具有以下有益效果:

59、本发明针对人类agtr1基因1166a>c位点、ace基因i/d位点、adrb1基因1165g>c位点、cyp2d6*10位点、cyp2c9*3位点的多态性,分别设计了特定的多重pcr引物和探针,能够分别进行5个位点的定性检测。使用时,仅需将样本分别与探针引物组合物或pcr预混液混合,即可上机检测。每个反应体系检测一个位点的多态性,结果判读直观,从而降低了对检测时限、操作熟练度、数据分析等的严苛要求,降低了整体检测难度。

60、特别针对ace插入/缺失位点结构特殊,pcr预混液或检测ace插入/缺失位点的体系在长期保存过程中,突变探针会与下游引物配对结合,导致空白对照产生突变信号,影响检测结果判读。发明人通过将ace缺失型探针中的碱基序列向3'端延伸一定长度的碱基序列,即使得snp位点相对偏向5'端,极大提升了ace突变型探针的热稳定性,进一步确保了试剂盒使用过程中的准确性和实用性。

61、此外,发明人还提供了一种检测试剂盒,该试剂盒具有如下优势:

62、(1)可以重复检测各反应液相应基因型1ng(0.5ng/μl,上样体积2μl)检测限的参考品,检出率为100%。具有检测限低的技术优势。

63、(2)使用本发明提供的试剂盒重复检测对应基因型参考品10次,能准确检出对应基因型,且检测结果的ct值变异系数cv≤5%。

64、(3)特异性:本发明提供的试剂盒的同源基因cyp2d7、cyp2c19的序列不会干扰试剂盒的检测结果;而检测agtr1基因范围外snp位点rs5185、ace基因范围外snp位点rs4341、adrb1基因范围外snp位点rs138212934、cyp2d6基因范围外snp位点rs769258、cyp2c9基因范围外snp位点rs17847029,均不影响本试剂盒的检测结果,具有特异性高的优势。

65、(4)抗干扰能力强:当常见内源性干扰物血液中甘油三酯总含量<6mmol/l、总胆固醇含量<9.2mmol/l、血红蛋白含量<5μmol/l、胆红素含量<170μmol/l时,均不会干扰试剂盒的检测结果;当常用治疗药物中氯沙坦药物血药浓度<80ng/ml、卡托普利药物血药浓度<50μg/ml、美托洛尔药物血药浓度<250ng/ml、硝苯地平药物血药浓度<50ng/ml、氢氯噻嗪药物血药浓度<200ng/ml时,不会干扰本发明试剂盒的检测结果。

66、(5)本发明提供的试剂盒可以耐受50ng/μl的人类基因组dna样本,可以检测低至0.5ng/μl的人类基因组dna样本,具有检测dna样本浓度范围广的优势。

67、(6)本发明提供的试剂盒适用于edta和枸橼酸钠抗凝全血样本。

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