一种γ-聚谷氨酸钠溶液的制备方法与流程

一种
γ-聚谷氨酸钠溶液的制备方法
技术领域
1.本发明涉及发酵工程领域，尤其是涉及一种γ-聚谷氨酸钠溶液的制备方法。


背景技术：

2.γ-聚谷氨酸(γ-pga)是一种水溶性多聚氨基酸，在发酵豆“纳豆”中首次被发现，因此也称为纳豆胶，由于γ-pga具有优越的吸水力和抓水里，且成膜性好，能够在肌肤表面形成一层锁水生物保护薄膜，对于皮肤有良好的保湿、修护、促进肌肤胶原蛋白生长的效果，因此，γ-pga在护肤产品、护发产品、洗护产品、口腔护理产品、彩妆产品中均有广泛的应用。
3.γ-pga可以通过地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌等不同的产生菌，并添加以碳源、氮源、前体物质，调节适宜的发酵温度以及通风量，即可使菌体增殖生长并分泌γ-pga。但是，目前的微生物发酵γ-pga存在产量低下的问题，技术人员在研究中发现，菌体在发酵的产酸稳定性难以控制，经常出现γ-pga增涨后菌体死亡率飚高的情况，导致发酵液最终的γ-pga含量不尽人意。


技术实现要素：

4.第一方面，本技术提供一种γ-聚谷氨酸钠溶液的制备方法，采用如下的技术方案：
5.一种γ-聚谷氨酸钠溶液的制备方法，包括如下步骤：
6.步骤一、菌种活化：取地衣芽孢杆菌接种于固体培养基上，在37℃下培养10～12h，获得活化后的单菌落；
7.步骤二、种子培养：将活化后的单菌落接种于种子培养基中，在37℃下培养8～10h，得到聚谷氨酸钠种子液；
8.步骤三、微生物发酵：按照发酵培养基体积计，将种子液以1.5～2％的接种量接种于发酵培养基中培养，在发酵的10～12h时，补加硝酸钠10～15g/l、生育酚乙酸酯12～20g/l或/和硫辛酸15～20g/l，在发酵的36～48h时，将发酵液从发酵罐中取出，获得微生物发酵液；
9.步骤四、发酵液菌体去除、干燥，获得富含γ-聚谷氨酸钠粉料；
10.步骤五、溶液制备：取干燥后的富含γ-聚谷氨酸钠粉料溶解于包含去离子水的溶液中，获得γ-聚谷氨酸钠溶液；
11.所述发酵培养基组分至少包含：蔗糖10～20g/l，甘油10～15g/l，酵母膏5～10g/l，谷氨酸钠30～40g/l，余量为豆腐黄水，ph7.2～7.4。
12.优选的，所述发酵液培养基的组分为：蔗糖10～20g/l，甘油10～15g/l，酵母膏5～10g/l，谷氨酸钠30～40g/l，k2hpo4·
3h2o 0.5～1g/l，mgso4·
7h2o 0.5～1g/l，nh4cl 8～10g/l，余量为豆腐黄水，ph7.2～7.4。
13.通过采用以上制备方法，利用地衣芽孢杆菌作为产物分泌体，少量谷氨酸钠作为
前体物质，蔗糖、甘油作为碳源，酵母膏作为氮源，并且特殊采用豆腐黄水作为发酵培养基主料，豆腐黄水作为豆制品的副产物之一，其富含有益微生物、糖类物质、醇类物质、酯类物质、酵母溶出物、可溶性淀粉、微量元素等物质，将豆腐黄水做回收利用，不仅减少了豆腐黄水排放对环境的污染，而且地衣芽孢杆菌在含有豆腐黄水的发酵培养基能够分泌出除了γ-聚谷氨酸以外的氨基酸类、多糖类、有机酸类、醇酮类、维生素类等代谢产物，使制得的γ-聚谷氨酸钠溶液具有更好的护肤效果。
14.除此之外，在发酵中期补充硝酸钠，取代传统的在发酵初期培养基中添加硝酸钠，能够很好地控制亚硝酸盐的快速积累，降低亚硝酸盐对地衣芽孢杆菌的代谢影响，从而促进γ-聚谷氨酸钠更好地合成，另外，生育酚乙酸酯、硫辛酸的添加，能够在发酵培养基产酸阶段时抑制菌体细胞质膜的磷脂氧化问题，从而能够更好地延长产酸时间，明显提高了γ-聚谷氨酸钠的产量。
15.优选的，所述步骤三中补加硝酸钠10g/l、生育酚乙酸酯12g/l、硫辛酸15g/l。
16.通过采用硝酸钠、生育酚乙酸酯以及硫辛酸的组合，并且控制适宜的补加量，对于提高γ-聚谷氨酸钠的产量具有更好的效果。
17.优选的，所述步骤三中以流加的方式补加硝酸钠、生育酚乙酸酯、硫辛酸。
18.通过采用流加的方式进行补料，能够更好地使发酵过程更加稳定，不易造成代谢加强或抑制生长的问题。
19.优选的，所述硝酸钠通过1.0～1.5g/(l
·
h)的流加速度进行补料，所述生育酚乙酸酯通过0.8～2.0g/(l
·
h)的流加速度进行补料，所述硫辛酸通过1.0～2.0g/(l
·
h)的流加速度进行补料。
20.通过控制适宜的流加速度，使得发酵的中后期的菌体能够持续维持更为平稳的增长速度，有助于γ-聚谷氨酸钠的积累。
21.优选的，通过间隔检测发酵液od值调控硝酸钠、生育酚乙酸酯、硫辛酸的流加速度，当两次od值净增＜0.05，硝酸钠的流加速度调为1.5g/(l
·
h)，生育酚乙酸酯的流加速度调为0.8g/(l
·
h)，硫辛酸的流加速度调为1.0g/(l
·
h)，当两次od值净增≥0.05，硝酸钠的流加速度调为1.0g/(l
·
h)，生育酚乙酸酯的流加速度调为1.2g/(l
·
h)，硫辛酸的流加速度调为1.5g/(l
·
h)。
22.通过od值净增幅度来调控硝酸钠、生育酚乙酸酯、硫辛酸的流加速度，当菌体生长速度较快时，od值的净增幅度高，此时通过降低硝酸钠的流加速度，平稳菌体的生长代谢，同时增加生育酚乙酸酯、硫辛酸的流加速度，降低由于菌量增长而导致自由基代谢产物对细胞增长的伤害，而当菌体生长缓慢时，od值的净增幅度低，则通过提高硝酸钠的流加速度，使地γ-聚谷氨酸合成酶活性提高，同时降低生育酚乙酸酯、硫辛酸的流加速度，促使菌体能够持续产酸，如此调控补料，使得地衣芽孢杆菌的代谢生长更为平衡，有效提高了γ-聚谷氨酸钠的产量。
23.优选的，所述豆腐黄水为豆腐制品生产过程中的黄浆水副产物与纯净水混合制成，黄浆水与纯净水的稀释比例为1:3。
24.通过将黄浆水与纯净水以1:3的稀释比制得豆腐黄水，使得发酵培养基的黏度适中，使得地衣芽孢杆菌的发酵环境更加适宜。
25.优选的，所述黄浆水为经过水解、浓缩处理的，还原糖含量在0.3～0.5％的黄浆
水。
26.通过将黄浆水进行水解、浓缩预处理，使得黄浆水中的大分子物质能够进一步水解分解成菌体更好利用的小分子有机物质，提高了对豆腐黄水的利用率以及γ-聚谷氨酸的产量。
27.第二方面，本技术提供一种γ-聚谷氨酸钠溶液，其组分按质量百分比计包括：干燥后的富含γ-聚谷氨酸钠粉料10～15％、乙基己基甘油0.2～0.5％、1,2-己二醇、0.2～0.5％、1,3-丁二醇15～20％，去离子水补加至100％。
28.通过将γ-聚谷氨酸钠粉料溶解于水以及1,3-丁二醇的复配溶液中，一方面能够使γ-聚谷氨酸钠在添加于乳液产品中的离子性更小，提高配伍性，另一方面能够提高γ-聚谷氨酸钠溶液的保湿效果，有助于γ-聚谷氨酸钠更好地发挥其吸水保水功效，此外，通过添加少量的乙基己基甘油、1,2-己二醇，进一步提高γ-聚谷氨酸钠溶液保湿效果的同时，还能够起到一定的防腐作用，延长γ-聚谷氨酸钠溶液的储存时间。
29.综上所述，本技术包括以下至少一种有益技术效果：
30.1.通过采用地衣芽孢杆菌作为γ-pga的产生菌，在发酵中期补加硝酸钠、生育酚乙酸酯、硫辛酸，相比直接添加至在发酵初期的培养基中，更有助于控制亚硝酸盐的快速积累，且减缓菌体细胞质膜的磷脂氧化问题，从而使得菌体在产酸期间更加稳定地生长繁殖，大幅提高了γ-pga的产量；
31.2.通过特别采用豆腐黄水作为发酵培养液，充分利用豆腐黄水中的营养物质，不仅能够有效减少了豆腐黄水排放对环境造成的污染，而且制得的γ-聚谷氨酸钠溶液具有更高的保湿效果与促进皮肤胶原蛋白再生的效果。
附图说明
32.图1是使用含有γ-聚谷氨酸钠溶液的乳液前后皮肤含水量变化；
33.图2是使用含有γ-聚谷氨酸钠溶液的精华前后眼周皮肤细纹变化。
具体实施方式
34.以下对本技术作进一步详细说明。
35.实施例
36.实施例1
37.一种γ-聚谷氨酸钠溶液的制备方法，步骤如下：
38.步骤一、菌种活化：取地衣芽孢杆菌接种于固体培养基上，在37℃下培养12h，获得活化后的单菌落；
39.步骤二、种子培养：将活化后的单菌落接种于种子培养基中，在37℃下，摇床转速220rpm培养10h，得到聚谷氨酸钠种子液；
40.步骤三、微生物发酵：按照发酵培养基体积计，将种子液以2％的接种量接种于发酵培养基中培养，3l发酵罐装液量1l，发酵温度控制在37℃，发酵过程每隔3h检测发酵液的od值，根据od值调整控制发酵罐的通风量以及搅拌速度，当两次检测的od值净增＜0.1时，通风量设置为0.5vvm，搅拌速度设置为300rpm，当两次检测的od值净增在0.1～0.3，通风量设置为1vvm，搅拌速度设置为500rpm，当两次检测的od值净增＞0.3，通风量设置为1.5vvm，
搅拌速度设置为700rpm，在发酵的10h时，补加硝酸钠10g/l、生育酚乙酸酯12g/l、硫辛酸15g/l，在发酵的36h时，将发酵液从发酵罐中取出，获得微生物发酵液，测定发酵收率；
41.步骤四、发酵液菌体去除：将微生物发酵液以8000rpm离心分离上清液，将上清液依次经过1.2μm过滤板、0.22μm聚醚砜滤芯的过滤，取1000ml过滤液与600ml的95wt％乙醇混合，95wt％乙醇的投加速度控制在10ml/min，投加过程保持100rpm的搅拌速度，95wt％乙醇加入完毕后静置1h取沉淀，将沉淀与300ml的95wt％乙醇洗涤，再离心、干燥，获得富含γ-聚谷氨酸钠粉料；
42.步骤五、溶液制备：取干燥后的富含γ-聚谷氨酸钠粉料、乙基己基甘油、1,2-己二醇、1,3-丁二醇分别按照10％、0.2％、0.2％、20％的质量比混合，并补加去离子水至100％，获得γ-聚谷氨酸钠溶液。
43.以上培养基组分分别为：
44.固体培养基：蔗糖20g/l，蛋白胨10g/l，酵母膏5g/l，琼脂20g/l，nacl 10g/l，余量为水，ph7.0～7.2；
45.种子培养基：蔗糖15g/l，蛋白胨10g/l，酵母膏5g/l，牛肉浸粉3g/l，nacl 10g/l，k2hpo4·
3h2o 1g/l，mgso4·
7h2o 1g/l，余量为水，ph7.2～7.4；
46.发酵培养基：蔗糖20g/l，甘油10g/l，酵母膏5g/l，谷氨酸钠30g/l，k2hpo4·
3h2o 1g/l，mgso4·
7h2o 1g/l，nh4cl 10g/l，余量为豆腐黄水，ph7.2～7.4；其中，豆腐黄水为黄浆水与纯净水按1:3混合制成，黄浆水是从当地豆腐制品加工厂收集而来，往收集的黄浆水投加0.1wt％的柠檬酸，于100℃下进行水解、浓缩，至检测还原糖含量在0.3～0.5％即可使用。
47.实施例2
48.一种γ-聚谷氨酸钠溶液的制备方法，与实施例1的不同之处在于步骤三：
49.步骤三、微生物发酵：按照发酵培养基体积计，将种子液以2％的接种量接种于发酵培养基中培养，3l发酵罐装液量1l，发酵温度控制在37℃，发酵过程每隔3h检测发酵液的od值，根据od值调整控制发酵罐的通风量以及搅拌速度，当两次检测的od值净增≤0.1时，通风量设置为0.5vvm，搅拌速度设置为300rpm，当两次检测的od值净增在0.1～0.3，通风量设置为1vvm，搅拌速度设置为500rpm，当两次检测的od值净增≥0.3，通风量设置为1.5vvm，搅拌速度设置为700rpm，在发酵的10h时，通过流加的方式补加硝酸钠、生育酚乙酸酯、硫辛酸，硝酸钠的流加速度调为1.0g/(l
·
h)，生育酚乙酸酯的流加速度调为1.2g/(l
·
h)，硫辛酸的流加速度调为1.5g/(l
·
h)，直至补加总量为硝酸钠10g/l、生育酚乙酸酯12g/l、硫辛酸15g/l，其中硝酸钠的水溶液浓度为50g/l，硫辛酸的水溶液浓度为50g/l，生育酚乙酸酯的乙醇溶液浓度为100g/l，在发酵的36h时，将发酵液从发酵罐中取出，获得微生物发酵液，测定发酵收率。
50.实施例3
51.一种γ-聚谷氨酸钠溶液的制备方法，与实施例1的不同之处在于步骤三：
52.步骤三、微生物发酵：按照发酵培养基体积计，将种子液以2％的接种量接种于发酵培养基中培养，3l发酵罐装液量1l，发酵温度控制在37℃，发酵过程每隔3h检测发酵液的od值，根据od值调整控制发酵罐的通风量以及搅拌速度，当两次检测的od值净增≤0.1时，通风量设置为0.5vvm，搅拌速度设置为300rpm，当两次检测的od值净增在0.1～0.3，通风量
设置为1vvm，搅拌速度设置为500rpm，当两次检测的od值净增≥0.3，通风量设置为1.5vvm，搅拌速度设置为700rpm，在发酵的10h时，通过流加的方式补加硝酸钠、生育酚乙酸酯、硫辛酸，根据od值调整流加速度，当两次检测的od值净增＜0.05，硝酸钠的流加速度调为1.5g/(l
·
h)，生育酚乙酸酯的流加速度调为0.8g/(l
·
h)，硫辛酸的流加速度调为1.0g/(l
·
h)，当两次od值净增≥0.05，硝酸钠的流加速度调为1.0g/(l
·
h)，生育酚乙酸酯的流加速度调为1.2g/(l
·
h)，硫辛酸的流加速度调为1.5g/(l
·
h)，直至补加总量为硝酸钠10g/l、生育酚乙酸酯12g/l、硫辛酸15g/l，其中硝酸钠的水溶液浓度为50g/l，硫辛酸的水溶液浓度为50g/l，生育酚乙酸酯的乙醇溶液浓度为100g/l，在发酵的36h时，将发酵液从发酵罐中取出，获得微生物发酵液，测定发酵收率。
53.实施例4
54.一种γ-聚谷氨酸钠溶液的制备方法，与实施例1的不同之处在于步骤三：
55.步骤三、微生物发酵：按照发酵培养基体积计，将种子液以2％的接种量接种于发酵培养基中培养，3l发酵罐装液量1l，发酵温度控制在37℃，发酵过程每隔3h检测发酵液的od值，根据od值调整控制发酵罐的通风量以及搅拌速度，当两次检测的od值净增≤0.1时，通风量设置为0.5vvm，搅拌速度设置为300rpm，当两次检测的od值净增在0.1～0.3，通风量设置为1vvm，搅拌速度设置为500rpm，当两次检测的od值净增≥0.3，通风量设置为1.5vvm，搅拌速度设置为700rpm，在发酵的10h时，通过流加的方式补加硝酸钠、生育酚乙酸酯，根据od值调整流加速度，当两次检测的od值净增＜0.05，硝酸钠的流加速度调为1.5g/(l
·
h)，生育酚乙酸酯的流加速度调为1.5g/(l
·
h)，当两次od值净增≥0.05，硝酸钠的流加速度调为1.0g/(l
·
h)，生育酚乙酸酯的流加速度调为2.0g/(l
·
h)，直至补加总量为硝酸钠10g/l、生育酚乙酸酯20g/l，其中硝酸钠的水溶液浓度为50g/l，生育酚乙酸酯的乙醇溶液浓度为100g/l，在发酵的36h时，将发酵液从发酵罐中取出，获得微生物发酵液，测定发酵收率。
56.实施例5
57.一种γ-聚谷氨酸钠溶液的制备方法，与实施例1的不同之处在于步骤三：
58.步骤三、微生物发酵：按照发酵培养基体积计，将种子液以2％的接种量接种于发酵培养基中培养，3l发酵罐装液量1l，发酵温度控制在37℃，发酵过程每隔3h检测发酵液的od值，根据od值调整控制发酵罐的通风量以及搅拌速度，当两次检测的od值净增≤0.1时，通风量设置为0.5vvm，搅拌速度设置为300rpm，当两次检测的od值净增在0.1～0.3，通风量设置为1vvm，搅拌速度设置为500rpm，当两次检测的od值净增≥0.3，通风量设置为1.5vvm，搅拌速度设置为700rpm，在发酵的10h时，通过流加的方式补加硝酸钠、硫辛酸，根据od值调整流加速度，当两次检测的od值净增＜0.05，硝酸钠的流加速度调为1.5g/(l
·
h)，硫辛酸的流加速度调为1.5g/(l
·
h)，当两次od值净增≥0.05，硝酸钠的流加速度调为1.0g/(l
·
h)，硫辛酸的流加速度调为2.0g/(l
·
h)，直至补加总量为硝酸钠10g/l、硫辛酸20g/l，其中硝酸钠的水溶液浓度为50g/l，硫辛酸的水溶液浓度为50g/l，在发酵的36h时，将发酵液从发酵罐中取出，获得微生物发酵液，测定发酵收率。
59.对比例
60.对比例1：与实施例3的不同之处在于，步骤三中，在发酵的12h时，仅流加补料硝酸钠10g/l。
61.对比例2：与实施例3的不同之处在于，步骤三中，发酵培养基的组分如下：蔗糖
25g/l，甘油10g/l，酵母膏5g/l，谷氨酸钠30g/l，k2hpo4·
3h2o 1g/l，mgso4·
7h2o 1g/l，nh4cl 10g/l，余量为纯净水，ph7.2～7.4。
62.对比例3：与实施例3的不同之处在于，步骤三中，发酵培养基的组分如下：蔗糖20g/l，甘油10g/l，酵母膏5g/l，谷氨酸钠30g/l，硝酸钠10g/l，生育酚乙酸酯12g/l，硫辛酸15g/l，k2hpo4·
3h2o 1g/l，mgso4·
7h2o 1g/l，nh4cl 10g/l，余量为豆腐黄水，ph7.2～7.4，发酵过程不进行流加补料。
63.性能检测试验
64.1.γ-聚谷氨酸发酵收率检测：将实施例1-5以及对比例1-3的步骤三中获得的微生物发酵液取样检测，经过高效液相色谱仪检测γ-聚谷氨酸钠的含量，检测结果见下表1。
65.表1.γ-聚谷氨酸钠的含量结果
66.检测试样γ-聚谷氨酸钠含量(g/l)实施例1113.3实施例2116.5实施例3118.2实施例4105.7实施例5106.3对比例198.4对比例2109.6对比例3101.5
67.从上表的γ-聚谷氨酸钠含量检测结果分析，实施例3相比实施例1、实施例2，特别是对比例3的γ-聚谷氨酸钠含量更高，说明相比于以往的在发酵初期直接投加至发酵培养基中，在发酵中期将硝酸钠、生育酚乙酸酯、硫辛酸进行补料，能够提高γ-聚谷氨酸钠的含量，而采用流加的方式，特别是根据od值反馈调控流加速度的方式进行补料，能进一步提高菌体分泌γ-聚谷氨酸钠产量。此外，从实施例3与实施例4、实施例5以及对比例1的结果对比，补加20g/l的生育酚乙酸酯对于γ-聚谷氨酸钠含量有7.4％的提升幅度，补加20g/l的硫辛酸对于γ-聚谷氨酸钠含量有8.0％的提升幅度，而组合添加12g/l的生育酚乙酸酯和15g/l的硫辛酸，则对于γ-聚谷氨酸钠含量有20.1％的提升幅度，说明生育酚乙酸酯和硫辛酸共同添加相比于单独添加有更好的协同提升效果。
68.2.γ-聚谷氨酸钠溶液的斑贴试验：将实施例1-5步骤五制得的γ-聚谷氨酸钠溶液分别放入斑试器的小室内，用量约为0.02ml，将斑试器贴敷于受试者的手臂内侧，轻压斑试器使其均匀地贴服于皮肤表面，观察24h后的皮肤反应，结果见下表2。
69.表2.斑贴试验结果
[0070][0071]
3.γ-聚谷氨酸钠溶液的保湿效果：将实施例3以及对比例2的步骤五制得的γ-聚谷氨酸钠溶液，分别以5wt％的添加量掺加于市面采购的凡士林乳霜中作为检测样品，以没有掺加γ-聚谷氨酸钠溶液的凡士林乳霜作为空白样品，涂覆于受试者的手臂内侧，使用corneometer cm825皮肤水分含量测试仪检测涂抹后0.5h、1h、2h、5h时的皮肤水分含量，计算皮肤水分增加率(相比涂覆前)记录于图1。
[0072]
4.γ-聚谷氨酸钠溶液的皮肤修复效果：将实施例3以及对比例2的步骤五制得的γ-聚谷氨酸钠溶液，分别以3wt％的添加量掺加于市面采购的眼部精华中作为检测样品，以没有掺加γ-聚谷氨酸钠溶液的眼部精华作为空白样品，受试者涂覆早晚各一次涂覆于眼周皮肤，使用canfield的visia-cr面部图形分析仪，检测受试者的使用前，以及持续1周、1个月、3个月后的眼周皮肤细纹情况，计算细纹减少率(相比涂覆前)记录于图2。
[0073]
从图1、图2的皮肤水分增加率以及细纹减少率结果分析，掺加有γ-聚谷氨酸钠溶液的乳液或精华的护肤品对于皮肤含水量的提高有更好的效果，另外，利用豆腐黄水作为发酵培养基的营养物质，不仅能够进一步提高γ-聚谷氨酸钠溶液的保湿效果，特别是对于γ-聚谷氨酸钠溶液的祛皱效果有更为显著的提升，说明γ-聚谷氨酸钠溶液中富含对于促进皮肤成纤维细胞生长的多种活性物质，减少皮肤胶原蛋白的流失，从而使肌肤紧致，淡化皱纹。
[0074]
本具体实施例仅仅是对本技术的解释，其并不是对本技术的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本技术的权利要求范围内都受到专利法的保护。