具有改进的特性的ω-羟化酶相关的融合多肽变体的制作方法

本公开涉及ω-羟化酶相关的融合多肽和其变体，所述多肽和其变体当在重组宿主细胞中表达时引起改进的ω-羟基化脂肪酸衍生物产生。本公开进一步涉及用于表达用来产生ω-羟基化脂肪酸衍生物的ω-羟化酶相关的融合多肽和其变体的微生物。

背景技术：

1、细胞色素p450单加氧酶(p450)是一组多种多样的酶。其被分类为家族和子家族。当其共享大于或等于百分之四十的氨基酸同一性时，其属于同一家族。当其共享大于或等于百分之五十五的氨基酸同一性时，其属于同一子家族。p450使用脂肪酸作为底物并且催化羟基化反应。细菌具有牵涉于烷烃降解和脂肪酸修饰中的数种p450系统并且迄今已知超过1000种微生物p450。一种特定p450子家族被称作cyp153a，其中最初在2001年从乙酸钙不动杆菌(acinetobacter calcoaceticus)克隆。其后，已经在如鞘氨醇单胞菌属种(sphingomonas sp.)hxn200、分支杆菌属种(mycobacterium sp.)hxn1500和博克岛食烷菌(alcanivorax borkumensis)的其它烷烃利用物种中鉴定出相似的酶(van bogaert等人(2011)febs journal 278:206-221)。来自细菌cyp153a子家族的数种p450为具有高末端区域选择性的烷烃ω-羟化酶(ω-羟化酶，还称作ω-加氧酶)。cyp153a也已经与工业上相关的ω-羟基化(ω-羟基化)脂肪族化合物的合成相关，所述脂肪族化合物如伯醇、ω-羟基化脂肪酸和双官能脂肪酸衍生物(如α,ω-二羧酸和α,ω-二醇)(honda malca等人(2012)chem.commun.48:5115-5117)。

技术实现思路

1、本公开提供可在宿主细胞中产生ω-羟基化-和双官能脂肪酸衍生物的ω-羟化酶相关的融合多肽和其变体。更具体说来，本公开提供cyp153a-还原酶杂合融合多肽变体，所述变体产生ω-羟基化-(ω-羟基化)和双官能脂肪酸衍生物和其组合物，包括ω-羟基化脂肪酸、ω-羟基化脂肪酯、α,ω-二酸、α,ω-二酯、α,ω-二醇和由其衍生的化学品(如大环内酯)。还提供特异性cyp153a-还原酶杂合融合核酸和蛋白质序列以及包含此类工程改造的cyp153a-还原酶杂合融合多肽变体的重组宿主细胞和细胞培养物。本公开还提供使用表达重组cyp153a-还原酶杂合融合多肽变体的宿主细胞以便制备ω-羟基化和/或双官能脂肪酸衍生物或其组合物的方法。

2、本公开的一方面提供催化脂肪酸转化为ω-羟基化(ω-oh)脂肪酸或脂肪酸衍生物的cyp153a-还原酶杂合融合多肽变体，其中所述cyp153a-还原酶杂合融合多肽变体与cyp153a-还原酶杂合融合多肽序列seq id no:38具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。进一步包括用于表达cyp153a-还原酶杂合融合多肽和其变体的方法。一方面，所述cyp153a-还原酶杂合融合多肽变体与seq id no:38具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性并且如与由野生型cyp153a的表达或cyp153a-还原酶杂合融合多肽seq id no:6或seq id no:38的表达产生的效价相比，所述cyp153a-还原酶杂合融合多肽变体在重组宿主细胞中的表达引起ω-oh脂肪酸或脂肪酸衍生物或其组合物的更高效价。一方面，所述重组宿主细胞当在含有碳源的培养基中在有效表达所述cyp153a-还原酶杂合融合多肽变体的条件下培养时产生ω-oh脂肪酸或ω-oh脂肪酸衍生物或其组合物，其具有比由表达相应野生型cyp153a或表达cyp153a-还原酶杂合融合多肽seq id no:6或seq id no:38的宿主细胞产生的ω-oh脂肪酸或ω-oh脂肪酸衍生物或其组合物的效价大至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％的效价。另一方面，所述ω-oh脂肪酸或ω-oh脂肪酸衍生物或其组合物在细胞外产生。

3、一方面，本公开提供一种cyp153a-还原酶杂合融合多肽变体，其包含与氨基酸序列seq id no:38的至少80％或至少90％序列同一性，其中所述cyp153a-还原酶杂合融合多肽变体包含在氨基酸位置12处的突变和在以下氨基酸位置中的每一者处的突变：(a)seqid no:38的27、119、140、157、159、233和244；(b)seq id no:38的28、61、119、231、309、413和480；(c)seq id no:38的119、231和480；(d)seq id no:38的28、77、119、141、231和407；(e)seq id no:38的28、61、141、231和407；(f)seq id no:38的28、119、231和244；(g)seqid no:38的28、407和480；(h)seq id no:38的141、231、413和481；(i)seq id no:38的28、111、231和407；(j)seq id no:38的28、61、140和149；(k)seq id no:38的28、77、119、159、231、254、407和480；(l)seq id no:38的28、254、309、407和451；(m)seq id no:38的28、254、309、407和480；或(n)seq id no:38的28、309、407、451和480；其中所述cyp153a-还原酶杂合融合多肽变体催化脂肪酸转化为ω-羟基化脂肪酸。在多个实施方案中，在(a)氨基酸位置seq id no:38的12、27、119、140、157、159、233和244处的所述突变为氨基酸取代。在多个实施方案中，在(b)氨基酸位置seq id no:38的12、28、61、119、231、309、413和480处的所述突变为氨基酸取代。在多个实施方案中，在(c)氨基酸位置seq id no:38的12、119、231和480处的所述突变为氨基酸取代。在多个实施方案中，在(d)氨基酸位置seq id no:38的12、28、77、119；141、231和407处的所述突变为氨基酸取代。在多个实施方案中，在(e)氨基酸位置seq id no:38的12、28、61、141、231和407处的所述突变为氨基酸取代。在多个实施方案中，在(f)氨基酸位置seq id no:38的12、28、119、231和244处的所述突变为氨基酸取代。在多个实施方案中，在(g)氨基酸位置seq id no:38的12、28、407和480处的所述突变为氨基酸取代。在多个实施方案中，在(h)氨基酸位置seq id no:38的12、141、231、413和481处的所述突变为氨基酸取代。在多个实施方案中，在(i)氨基酸位置seq id no:38的12、28、111、231和407处的所述突变为氨基酸取代。在多个实施方案中，在(j)氨基酸位置seq idno:38的12、28、61、140和149处的所述突变为氨基酸取代。在多个实施方案中，在(k)氨基酸位置12、28、77、119、159、231、254、407和480处的所述突变为氨基酸取代。在多个实施方案中，在(l)氨基酸位置seq id no:38的12、28、254、309、407和451处的所述突变为氨基酸取代。在多个实施方案中，在(m)氨基酸位置seq id no:38的12、28、254、309、407和480处的所述突变为氨基酸取代。在多个实施方案中，在(n)氨基酸位置seq id no:38的12、28、309、407、451和480处的所述突变为氨基酸取代。在一个实施方案中，在(a)氨基酸位置seq idno:38的12、27、119、140、157、159、233和244处的所述突变分别为q12w、r27l、k119r、s140n、s157r、v159m、s233l和a244r。在一个实施方案中，在(b)氨基酸位置seq id no:38的12、28、61、119、231、309、413和480处的所述突变分别为q12r、q28m、n61l、k119r、a231v、n309s、y413r和i480g。在一个实施方案中，在(c)氨基酸位置seq id no:38的12、119、231和480处的所述突变分别为q12r、k119r、a231v和i480g。在一个实施方案中，在(d)氨基酸位置seqid no:38的12、28、77、119；141、231和407处的所述突变分别为q12t、q28m、r77q、k119r、v141t、a231w和n407g。在一个实施方案中，在(e)氨基酸位置seq id no:38的12、28、61、141、231和407处的所述突变分别为q12r、q28m、n61l、v141t、a231y和n407g。在一个实施方案中，在(f)氨基酸位置seq id no:38的12、28、119、231和244处的所述突变分别为q12w、q28m、k119r、a231y和a244r。在一个实施方案中，在(g)氨基酸位置seq id no:38的12、28、407和480处的所述突变分别为q12w、q28t、n407g和i480g。在一个实施方案中，在(h)氨基酸位置seq id no:38的12、141、231、413和481处的所述突变分别为q12r、v141t、a231y、y413r和g481i。在一个实施方案中，在(i)氨基酸位置seq id no:38的12、28、111、231和407处的所述突变分别为q12t、q28m、f111a、a231v和n407g。在一个实施方案中，在(j)氨基酸位置seq id no:38的12、28、61、140和149处的所述突变分别为q12t、q28m、n61l、s140n和p149r。在一个实施方案中，在(k)氨基酸位置12、28、77、119、159、231、254、407和480处的所述突变分别为q12w、q28t、r77q、k119r、v159m、a231y、r254g、n407g和i480g。在一个实施方案中，在(l)氨基酸位置seq id no:38的12、28、254、309、407和451处的所述突变分别为q12w、q28t、r254g、n309s、n407g和v451m。在一个实施方案中，在(m)氨基酸位置seq id no:38的12、28、254、309、407和480处的所述突变分别为q12w、q28t、r254g、n309s、n407g和i480g。在一个实施方案中，在(n)氨基酸位置seq id no:38的12、28、309、407、451和480处的所述突变分别为q12w、q28t、n309s、n407g、v451m和i480g。在一个优选实施方案中，以上(a)的cyp153a-还原酶杂合融合多肽变体进一步包含在氨基酸位置seq id no:38的141、231和407中的每一者处，或在氨基酸位置seq id no:38的231、407、451、757、770和784中的每一者处，或在氨基酸位置seq id no:38的231、407、591、643、757和784中的每一者处的突变。在多个实施方案中，在氨基酸位置seq id no:38的141、231和407中的每一者处的所述进一步突变为氨基酸取代。另外，在多个实施方案中，在氨基酸位置seq id no:38的231、407、451、757、770和784中的每一者处的所述进一步突变为氨基酸取代。另外，在多个实施方案中，在氨基酸位置seq id no:38的231、407、591、643、757和784中的每一者处的所述进一步突变为氨基酸取代。优选地，在氨基酸位置seq id no:38的141、231和407中的每一者处的所述进一步突变分别为v141t、a231y和n407g。另外，优选地，在氨基酸位置seq id no:38的231、407、451、757、770和784中的每一者处的所述突变分别为a231y、n407g、v451m、e757a、t770g和m784i。另外，优选地，在氨基酸位置seq id no:38的231、407、591、643、757和784中的每一者处的所述突变分别为a231y、n407g、e591q、r643h、e757a和m784i。更优选地，本公开的cyp153a-还原酶杂合融合多肽变体包含氨基酸序列seq id no:146、seq id no:150或seq id no:160。在本公开的其它实施方案中，所述cyp153a-还原酶杂合融合多肽变体包含氨基酸序列seq id no:98、seq id no:100、seq id no:102、seq id no:104、seq id no:106、seq idno:108、seq id no:110、seq id no:112、seq id no:114、seq id no:116、seq id no:118、seq id no:120、seq id no:122和seq id no:124中的任一者。

4、另一方面，本公开提供一种cyp153a-还原酶杂合融合多肽变体，其包含与氨基酸序列seq id no:38的至少80％或至少90％序列同一性，其中所述cyp153a-还原酶杂合融合多肽变体包含在rhf结构域(或rhf还原酶结构域，或red450rhf结构域，或red450rhf还原酶结构域，或p450rhf结构域，或p450rhf还原酶结构域)中在以下氨基酸位置中的每一者处的突变：(a)seq id no:38的527、544、719、757、771和784；(b)seq id no:38的527、544和557；(c)seq id no:38的770和784；(d)seq id no:38的527、591、648、719、757、771和784；(e)seq id no:38的527、591、648、757和771；(f)seq id no:38的527、544、770和784；(g)seqid no:38的527、557、770和784；(h)seq id no:38的557、757和770；(i)seq id no:38的557、757和771；或(j)seq id no:38的757和770；其中所述cyp153a-还原酶杂合融合多肽变体催化脂肪酸转化为ω-羟基化脂肪酸。在多个实施方案中，在(a)氨基酸位置seq id no:38的527、544、719、757、771和784处的所述突变为氨基酸取代。在多个实施方案中，在(b)氨基酸位置seq id no:38的527、544和557处的所述突变为氨基酸取代。在多个实施方案中，在(c)氨基酸位置seq id no:38的770和784处的所述突变为氨基酸取代。在多个实施方案中，在(d)氨基酸位置seq id no:38的527、591、648、719、757、771和784处的所述突变为氨基酸取代。在多个实施方案中，在(e)氨基酸位置seq id no:38的527、591、648、757和771处的所述突变为氨基酸取代。在多个实施方案中，在(f)氨基酸位置seq id no:38的527、544、770和784处的所述突变为氨基酸取代。在多个实施方案中，在(g)氨基酸位置seq id no:38的527、557、770和784处的所述突变为氨基酸取代。在多个实施方案中，在(h)氨基酸位置seq id no:38的557、757和770处的所述突变为氨基酸取代。在多个实施方案中，在(i)氨基酸位置seq id no:38的557、757和771处的所述突变为氨基酸取代。在多个实施方案中，在(j)氨基酸位置seq id no:38的757和770处的所述突变为氨基酸取代。在一个实施方案中，在(a)氨基酸位置seq id no:38的527、544、719、757、771和784处的所述突变分别为d527e、d544n、r719w、e757a、v771f和m784i。在一个实施方案中，在(b)氨基酸位置seq id no:38的527、544和557处的所述突变分别为d527e、d544n和e557r。在一个实施方案中，在(c)氨基酸位置seq id no:38的770和784处的所述突变分别为t770g和m784i。在一个实施方案中，在(d)氨基酸位置seq id no:38的527、591、648、719、757、771和784处的所述突变分别为d527e、e591q、v648l、r719w、e757a、v771f和m784i。在一个实施方案中，在(e)氨基酸位置seq id no:38的527、591、648、757和771处的所述突变分别为d527e、e591q、v648l、e757a和v771f。在一个实施方案中，在(f)氨基酸位置seq id no:38的527、544、770和784处的所述突变分别为d527e、d544n、t770g和m784i。在一个实施方案中，在(g)氨基酸位置seq id no:38的527、557、770和784处的所述突变分别为d527e、e557r、t770g和m784i。在一个实施方案中，在(h)氨基酸位置seq id no:38的557、757和770处的所述突变分别为e557w、e757a和t770g。在一个实施方案中，在(i)氨基酸位置seq id no:38的557、757和771处的所述突变分别为e557r、e757a和v771f。在一个实施方案中，在(j)氨基酸位置seq id no:38的757和770处的所述突变分别为e757a和t770g。在本公开的一些优选实施方案中，所述cyp153a-还原酶杂合融合多肽变体包含氨基酸序列seq id no:126、seq id no:128、seq id no:130、seq id no:132、seq id no:134、seq id no:136、seq id no:138、seq id no:140、seq idno:142和seq id no:144中的任一者。

5、另一方面，本公开提供一种cyp153a-还原酶杂合融合多肽变体，其包含与氨基酸序列seq id no:38的至少80％或至少90％序列同一性，其中所述cyp153a-还原酶杂合融合多肽变体包含在以下位置中的每一者处的突变：(a)seq id no:38的141、231、233和254；(b)seq id no:38的141、231、233和244；(c)seq id no:38的141、231、244、451、557、749和770；(d)seq id no:38的27、28、61、141、149和231；(e)seq id no:38的141、157、231、233、244、757和784；(f)seq id no:38的28、61、140、141、231、233和271；或(g)seq id no:38的231、233、254和557；其中所述cyp153a-还原酶杂合融合多肽变体催化脂肪酸转化为ω-羟基化脂肪酸。在多个实施方案中，在(a)氨基酸位置seq id no:38的141、231、233和254处的所述突变为氨基酸取代。在多个实施方案中，在(b)氨基酸位置seq id no:38的141、231、233和244处的所述突变为氨基酸取代。在多个实施方案中，在(c)氨基酸位置seq id no:38的141、231、244、451；557、749和770处的所述突变为氨基酸取代。在多个实施方案中，在(d)氨基酸位置seq id no:38的27、28、61、141、149和231处的所述突变为氨基酸取代。在多个实施方案中，在(e)氨基酸位置seq id no:38的141、157、231、233、244、757和784处的所述突变为氨基酸取代。在多个实施方案中，在(f)氨基酸位置seq id no:38的28、61、140、141、231、233和271处的所述突变为氨基酸取代。在多个实施方案中，在(g)氨基酸位置seq idno:38的231、233、254和557处的所述突变为氨基酸取代。在一个实施方案中，在(a)氨基酸位置seq id no:38的141、231、233和254处的所述突变分别为v141t、a231y、l233s和r254g。在一个实施方案中，在(b)氨基酸位置seq id no:38的141、231、233和244处的所述突变分别为v141t、a231y、l233s和r244a。在一个实施方案中，在(c)氨基酸位置seq id no:38的141、231、244、451、557、749和770处的所述突变分别为v141t、a231y、r244a、v451m、e557w、e749l和t770g。在一个实施方案中，在(d)氨基酸位置seq id no:38的27、28、61、141、149和231处的所述突变分别为l27r、q28m、n61l、v141t、p149g和a231y。在一个实施方案中，在(e)氨基酸位置seq id no:38的141、157、231、233、244、757和784处的所述突变分别为v141t、r157s、a231y、l233s、r244a、e757a和m784i。在一个实施方案中，在(f)氨基酸位置seq idno:38的28、61、140、141、231、233和271处的所述突变分别为q28m、n61l、n140s、v141t、a231y、l233s和e271d。在一个实施方案中，在(g)氨基酸位置seq id no:38的231、233、254和557处的所述突变分别为a231y、l233s、r254g和e557w。在本公开的一些优选实施方案中，本公开的cyp153a-还原酶杂合融合多肽变体包含氨基酸序列seq id no:148、seq id no:152、seq id no:154、seq id no:156、seq id no:158、seq id no:162和seq id no:164中的任一者。

6、另一方面，本公开提供一种cyp153a-还原酶杂合融合多肽变体，其包含与氨基酸序列seq id no:98的至少80％或至少90％序列同一性，其中所述cyp153a-还原酶杂合融合多肽变体包含在以下位置中的每一者处的突变：(a)seq id no:98的141、231和407；(b)seqid no:98的141、231、233和254；(c)seq id no:98的231、407、451、757、770和784；(d)seqid no:98的141、231、233和244；(e)seq id no:98的141、231、244、451、557、749和770；(f)seq id no:98的27、28、61、141、149和231；(g)seq id no:98的27、119、140、141、159、231、757和784；(h)seq id no:98的231、407、591、643、757和784；(i)seq id no:98的28、61、140、141、231、233和271；或(j)seq id no:98的231、233和254；其中所述cyp153a-还原酶杂合融合多肽变体催化脂肪酸转化为ω-羟基化脂肪酸。在多个实施方案中，在(a)氨基酸位置seq id no:98的141、231和407处的所述突变为氨基酸取代。在多个实施方案中，在(b)氨基酸位置seq id no:98的141、231、233和254处的所述突变为氨基酸取代。在多个实施方案中，在(c)氨基酸位置seq id no:98的231、407、451、757、770和784处的所述突变为氨基酸取代。在多个实施方案中，在(d)氨基酸位置seq id no:98的141、231、233和244处的所述突变为氨基酸取代。在多个实施方案中，在(e)氨基酸位置seq id no:98的141、231、244、451、557、749和770处的所述突变为氨基酸取代。在多个实施方案中，在(f)氨基酸位置seq idno:98的27、28、61、141、149和231处的所述突变为氨基酸取代。在多个实施方案中，在(g)氨基酸位置seq id no:98的27、119、140、141、159、231、757和784处的所述突变为氨基酸取代。在多个实施方案中，在(h)氨基酸位置seq id no:98的231、407、591、643、757和784处的所述突变为氨基酸取代。在多个实施方案中，在(i)氨基酸位置seq id no:98的28、61、140、141、231、233和271处的所述突变为氨基酸取代。在多个实施方案中，在(j)氨基酸位置seqid no:38的231、233和254处的所述突变为氨基酸取代。在一个实施方案中，在(a)氨基酸位置seq id no:98的141、231和407处的所述突变分别为v141t、a231y和n407g。在一个实施方案中，在(b)氨基酸位置seq id no:98的141、231、233和254处的所述突变分别为v141t、a231y、l233s和r254g。在一个实施方案中，在(c)氨基酸位置seq id no:98的231、407、451、757、770和784处的所述突变分别为a231y、n407g、v451m、e757a、t770g和m784i。

7、在一个实施方案中，在(d)氨基酸位置seq id no:98的141、231、233和244处的所述突变分别为v141t、a231y、l233s和r244a。在一个实施方案中，在(e)氨基酸位置seq idno:98的141、231、244、451、557、749和770处的所述突变分别为v141t、a231y、r244a、v451m、e557w、e749l和t770g。在一个实施方案中，在(f)氨基酸位置seq id no:98的27、28、61、141、149和231处的所述突变分别为l27r、q28m、n61l、v141t、p149g和a231y。

8、在一个实施方案中，在(g)氨基酸位置seq id no:98的141、157、231、233、244、757和784处的所述突变分别为v141t、r157s、a231y、l233s、r244a、e757a和m784i。在一个实施方案中，在(h)氨基酸位置seq id no:98的231、407、591、643、757和784处的所述突变分别为a231y、n407g、e591q、r643h、e757a和m784i。在一个实施方案中，在(i)氨基酸位置seq idno:98的28、61、140、141、231、233和271处的所述突变分别为q28m、n61l、n140s、v141t、a231y、l233s和e271d。在一个实施方案中，在(j)氨基酸位置seq id no:98的231、233、254和557处的所述突变分别为a231y、l233s、r254g和e557w。在本公开的一些优选实施方案中，本公开的cyp153a-还原酶杂合融合多肽变体包含氨基酸序列seq id no:146、seq id no:148、seq id no:150、seq id no:152、seq id no:154、seq id no:156、seq id no:158、seqid no:160；seq id no:162和seq id no:164中的任一者。

9、在本公开的多个实施方案中，如与通过例如cyp153a-还原酶杂合融合多肽seq idno:6或seq id no:38在相应宿主细胞中的表达产生的ω-羟基化脂肪酸的效价相比，由本公开提供的cyp153a-还原酶杂合融合多肽变体在重组宿主细胞中的表达引起ω-羟基化脂肪酸的较高效价。此外，在本公开的多个实施方案中，由本公开提供的cyp153a-还原酶杂合融合多肽变体为杂合cyp153a-redrhf融合蛋白变体。

10、一方面，本公开提供一种表达由本公开提供的cyp153a-还原酶杂合融合多肽变体的重组宿主细胞。在多个实施方案中，所述重组宿主细胞进一步表达ec 3.1.2.-、ec3.1.1.5或ec 3.1.2.14的硫酯酶多肽。另外，在多个实施方案中，当在含有碳源的培养基中培养时，所述重组宿主细胞产生ω-羟基化脂肪酸组合物，其具有比由表达包含seq id no:38或seq id no:6的相应cyp153a-还原酶杂合融合多肽的宿主细胞产生的ω-羟基化脂肪酸组合物的效价大至少10％、大至少15％、大至少20％、大至少25％或大至少30％的效价。

11、另一方面，本公开提供一种包含本公开的重组宿主细胞的细胞培养物。

12、另一方面，本公开提供一种产生ω-羟基化脂肪酸的方法，所述方法包括：(i)在碳源存在下培养本公开的重组宿主细胞或本公开的细胞培养物；和(ii)收集ω-羟基化脂肪酸。

13、另一方面，本公开提供一种重组微生物，其包含经过工程改造以表达编码多肽的至少两个核酸序列的路径，所述多肽包含：(i)ec3.1.2.-、ec 3.1.1.5或ec 3.1.2.14的硫酯酶；和(ii)本公开的cyp153a-还原酶杂合融合多肽变体。

14、在本公开的多个实施方案中，所述cyp153a-还原酶杂合融合多肽变体为自给自足的cyp153a-redrhf杂合融合蛋白变体。

15、本公开的另一方面提供一种cyp153a-还原酶杂合融合多肽变体，其与seq id no:6具有至少约90％、91％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性并且在包括位置796、141、231、27、82、178、309、407、415、516和/或666的氨基酸位置处具有至少一个突变，其中所述cyp153a-还原酶杂合融合多肽变体催化脂肪酸转化为ω-oh脂肪酸。所述cyp153a-还原酶杂合融合多肽变体在以下位置中的任一处或多处具有突变，包括位置a796v，其中丙氨酸(a)被缬氨酸(v)取代(即，置换)；位置v141i，其中缬氨酸被异亮氨酸(i)取代；位置v141q，其中缬氨酸(v)被谷氨酰胺(q)取代；位置v141g，其中缬氨酸(v)被甘氨酸(g)取代；位置v141m，其中缬氨酸(v)被甲硫氨酸(m)取代；位置v141l，其中缬氨酸(v)被亮氨酸(l)取代；位置v141t，其中缬氨酸(v)被苏氨酸(t)取代；位置a231t，其中丙氨酸(a)被苏氨酸(t)取代；位置r27l，其中精氨酸(r)被赖氨酸(l)取代；位置r82d，其中精氨酸(r)被天冬氨酸(d)取代；位置r178n，其中精氨酸(r)被天冬酰胺(n)取代；位置n309r，其中天冬酰胺(n)被精氨酸(r)取代；位置n407a，其中天冬酰胺(n)被丙氨酸(a)取代；位置v415r，其中缬氨酸(v)被精氨酸(r)取代；位置t516v，其中苏氨酸(t)被缬氨酸(v)取代；位置p666a，其中脯氨酸(p)被丙氨酸(a)取代；和位置p666d，其中脯氨酸(p)被天冬氨酸(d)取代。cyp153a-还原酶杂合融合多肽变体的实例包括seq id no:8、seq id no:10、seq id no:12、seq id no:14、seq id no:16、seq id no:18、seq id no:20、seq id no:22、seq idno:24、seq id no:26、seq id no:28或seq id no:30、seq id no:32、seq id no:34、seqid no:36、seq id no:38、seq id no:40、seq id no:42、seq id no:44和seq id no:46，如序列表a所示(段落[0146])。在一个实施方案中，所述cyp153a-还原酶杂合融合多肽变体为杂合cyp153a-redrhf型融合蛋白变体。在另一实施方案中，如与由cyp153a-还原酶杂合融合多肽(模板；例如，seq id no:6、seq id no:38、seq id no:98)在相应宿主细胞中的表达产生的ω-oh脂肪酸或ω-oh脂肪酸衍生物或其组合物的效价相比，在重组宿主细胞中的所述cyp153a-还原酶杂合融合多肽变体引起ω-oh脂肪酸或ω-oh脂肪酸衍生物或其组合物的更高效价。在另一实施方案中，所述cyp153a-还原酶杂合融合多肽变体在氨基酸位置796处具有突变，包括a796v。在另一实施方案中，所述cyp153a-还原酶杂合融合多肽变体在氨基酸位置231处具有突变，包括a231t。在另一实施方案中，所述cyp153a-还原酶杂合融合多肽变体在氨基酸位置141处具有突变，包括v141i或v141t。本文中，如与由cyp153a-还原酶杂合融合多肽(模板；例如，seq id no:6、seq id no:38、seq id no:98)的表达产生的ω-oh c12或c16脂肪酸的效价相比，具有突变a796v、v141i或v141t和/或a231t的cyp153a-还原酶杂合融合多肽变体在重组宿主细胞中的表达分别引起ω-oh c12或c16脂肪酸的更高效价。

16、本公开进一步涵盖具有表达如由本公开提供的cyp153a-还原酶杂合融合多肽变体的重组宿主细胞的细胞培养物。ω-oh脂肪酸或脂肪酸衍生物或其组合物可包括c6、c7、c8、c9、c10、c11、c12、c13、c14、c15、c16、c17、c18、c19和c20ω-oh脂肪酸或脂肪酸衍生物中的一者或多者。ω-oh脂肪酸或脂肪酸衍生物或其组合物可包括饱和或不饱和ω-oh脂肪酸或脂肪酸衍生物。在另一实施方案中，ω-oh脂肪酸或脂肪酸衍生物或其组合物可包括c8:1、c9:1、c10:1、c11:1、c12:1、c13:1、c14:1、c15:1、c16:1、c17:1、c18:1、c19:1和c20:1不饱和ω-oh脂肪酸或脂肪酸衍生物中的一者或多者。在另一实施方案中，ω-oh脂肪酸或脂肪酸衍生物或其组合物可包括ω-oh c12和/或c16和/或c16:1脂肪酸或脂肪酸衍生物。

17、本公开的另一方面提供一种产生ω-oh脂肪酸或脂肪酸衍生物或其组合物的方法，所述方法包括用碳源培养表达本公考的cyp153a-还原酶杂合融合多肽变体的宿主细胞；和收集ω-oh脂肪酸或ω-oh脂肪酸衍生物。所述方法提供ω-oh脂肪酸或ω-oh脂肪酸衍生物或其组合物的效价的增加/改进。一方面，ω-oh脂肪酸或脂肪酸衍生物比由表达cyp153a-还原酶杂合融合多肽的宿主细胞、特别是由表达例如seq id no:6、seq id no:38或seq id no:98的cyp153a-还原酶杂合融合多肽的宿主细胞产生的ω-oh脂肪酸或脂肪酸衍生物的效价大至少约20％至30％。另一方面，ω-oh脂肪酸或脂肪酸衍生物或其组合物以约15g/l至约25g/l的效价从碳源、特别是来自可再生原料的碳源产生。在多个实施方案中，所述基于碳的可再生原料是选自由玉米、甘蔗、高粱、甜菜、柳枝稷、青贮饲料、稻草、木材、纸浆、污水、垃圾、纤维素城市废物、烟道气、合成气、生物质水解液和二氧化碳组成的组。

18、本公开的另一方面提供在v141i和a231t处具有突变的与seq id no:32具有至少约90％、91％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的cyp153a-还原酶杂合融合多肽变体，其中所述cyp153a-还原酶杂合融合多肽变体催化脂肪酸转化为ω-oh c6、c7、c8、c9、c10、c11、c12、c13、c14、c15、c16、c17、c18、c19、c20、c8:1、c9:1、c10:1、c11:1、c12:1、c13:1、c14:1、c15:1、c16:1、c17:1、c18:1、c19:1和/或c20:1脂肪酸或脂肪酸衍生物或其组合物。本公开的另一方面提供在r27l、r82d、v141m、r178n和n407a处具有突变的与seq id no:34具有至少约90％、91％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的cyp153a-还原酶杂合融合多肽变体，其中所述cyp153a-还原酶杂合融合多肽变体催化脂肪酸转化为ω-ohc6、c7、c8、c9、c10、c11、c12、c13、c14、c15、c16、c17、c18、c19、c20、c8:1、c9:1、c10:1、c11:1、c12:1、c13:1、c14:1、c15:1、c16:1、c17:1、c18:1、c19:1和/或c20:1脂肪酸或脂肪酸衍生物或其组合物。本公开的另一方面提供在p666a处具有突变的与seq id no:36具有至少约90％、91％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的cyp153a-还原酶杂合融合多肽变体，其中所述cyp153a-还原酶杂合融合多肽变体催化脂肪酸转化为ω-oh c6、c7、c8、c9、c10、c11、c12、c13、c14、c15、c16、c17、c18、c19、c20、c8:1、c9:1、c10:1、c11:1、c12:1、c13:1、c14:1、c15:1、c16:1、c17:1、c18:1、c19:1和/或c20:1脂肪酸或脂肪酸衍生物或其组合物。本公开的另一方面提供在a796v处具有突变的与seq id no:38具有至少约90％、91％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的cyp153a-还原酶杂合融合多肽变体，其中所述cyp153a-还原酶杂合融合多肽变体催化脂肪酸转化为ω-oh c6、c7、c8、c9、c10、c11、c12、c13、c14、c15、c16、c17、c18、c19、c20、c8:1、c9:1、c10:1、c11:1、c12:1、c13:1、c14:1、c15:1、c16:1、c17:1、c18:1、c19:1和/或c20:1脂肪酸或脂肪酸衍生物或其组合物。本公开的另一方面提供在a796v、p666d和t516v处具有突变的与seq id no:40具有至少约90％、91％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的cyp153a-还原酶杂合融合多肽变体，其中所述cyp153a-还原酶杂合融合多肽变体催化脂肪酸转化为ω-oh c6、c7、c8、c9、c10、c11、c12、c13、c14、c15、c16、c17、c18、c19、c20、c8:1、c9:1、c10:1、c11:1、c12:1、c13:1、c14:1、c15:1、c16:1、c17:1、c18:1、c19:1和/或c20:1脂肪酸或脂肪酸衍生物或其组合物。本公开的另一方面提供在v141i、a231t和a796v处具有突变的与seq id no:42具有至少约90％、91％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的cyp153a-还原酶杂合融合多肽变体，其中所述cyp153a-还原酶杂合融合多肽变体催化脂肪酸转化为ω-oh c6、c7、c8、c9、c10、c11、c12、c13、c14、c15、c16、c17、c18、c19、c20、c8:1、c9:1、c10:1、c11:1、c12:1、c13:1、c14:1、c15:1、c16:1、c17:1、c18:1、c19:1和/或c20:1脂肪酸或脂肪酸衍生物或其组合物。本公开的另一方面提供在r27l、r82d、v141m、r178n、n407a和a796v处具有突变的与seq id no:44具有至少约90％、91％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的cyp153a-还原酶杂合融合多肽变体，其中所述cyp153a-还原酶杂合融合多肽变体催化脂肪酸转化为ω-oh c6、c7、c8、c9、c10、c11、c12、c13、c14、c15、c16、c17、c18、c19、c20、c8:1、c9:1、c10:1、c11:1、c12:1、c13:1、c14:1、c15:1、c16:1、c17:1、c18:1、c19:1和/或c20:1脂肪酸或脂肪酸衍生物或其组合物。本公开的另一方面提供在v141t、a231t和a796v处具有突变的与seq id no:46具有至少约90％、91％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的cyp153a-还原酶杂合融合多肽变体，其中所述cyp153a-还原酶杂合融合多肽变体催化脂肪酸转化为ω-oh c6、c7、c8、c9、c10、c11、c12、c13、c14、c15、c16、c17、c18、c19、c20、c8:1、c9:1、c10:1、c11:1、c12:1、c13:1、c14:1、c15:1、c16:1、c17:1、c18:1、c19:1和/或c20:1脂肪酸或脂肪酸衍生物或其组合物。

19、本公开进一步涵盖表达由本公开提供的cyp153a-还原酶杂合融合多肽变体的重组宿主细胞。在一个实施方案中，所述重组宿主细胞当在含有碳源的培养基中在有效表达本公开的cyp153a-还原酶杂合融合多肽变体的条件下培养时表达本公开的cyp153a-还原酶杂合融合多肽变体和ec 3.1.2.-或ec 3.1.1.5或ec 3.1.2.14的硫酯酶多肽，其中所述重组宿主细胞产生ω-oh脂肪酸或其组合物，其具有比由表达相应cyp153a-还原酶杂合融合多肽，例如表达cyp153a-还原酶杂合融合多肽seq id no:6或seq id no:38的宿主细胞产生的ω-oh脂肪酸或其组合物的效价大至少10％、大至少15％、大至少20％、大至少25％或大至少30％的效价。在一个实施方案中，ω-oh脂肪酸或其组合物可以约15g/l至约25g/l的效价产生。在另一实施方案中，ω-oh脂肪酸或其组合物在细胞外产生。

20、一方面，本公开提供一种重组微生物，其经过工程改造以表达本公开的cyp153a-还原酶杂合融合多肽变体。在多个实施方案中，所述重组微生物产生或能够产生ω-羟基脂肪酸或ω-oh脂肪酸衍生物，具体说来ω-羟基脂肪酸甲酯。在多个实施方案中，所述重组微生物经过工程改造以进一步表达编码多肽的核酸序列，所述多肽包含ec 1.1.1.1/2的醇脱氢酶或ec 1.1.3.13或ec 1.1.3.20的醇氧化酶，优选地其中所述重组微生物产生选自由ω-氧代脂肪酸和ω-氧代脂肪酸甲酯组成的组的ω-羟基脂肪酸衍生物。这种重组微生物可经过工程改造以进一步表达编码多肽的核酸序列，所述多肽包含ec 1.2.1.3/4/5的醛脱氢酶或ec 1.2.3.1的醛氧化酶，其中所述重组微生物产生ω-羟基脂肪酸衍生物，所述ω-羟基脂肪酸衍生物为α,ω-二酸或ω-羧基脂肪酸甲酯。这种重组微生物可经过工程改造以进一步表达编码多肽的核酸序列，所述多肽包含ec 6.2.1.3的酰基-coa连接酶或ec2.8.3.6的酰基-coa转移酶，其中所述重组微生物产生ω-羟基脂肪酸衍生物，所述ω-羟基脂肪酸衍生物为α,ω-二酯。在多个实施方案中，上文所提及的重组微生物(其经过工程改造以进一步表达编码多肽的核酸序列，所述多肽包含ec 1.1.1.1/2的醇脱氢酶或ec1.1.3.13或ec 1.1.3.20的醇氧化酶)可经过工程改造以进一步表达编码多肽的核酸序列，所述多肽包含ec 2.6.1的氨基转移酶或ec 1.4.9、ec 1.4.98或ec 1.4.99的胺脱氢酶以产生选自由ω-氨基脂肪酸和ω-氨基脂肪酸甲酯组成的组的ω-羟基脂肪酸衍生物。在多个实施方案中，所述重组微生物可经过工程改造以进一步表达编码多肽的核酸序列，所述多肽包含ec 1.1.-.-的醇脱氢酶和1.2.99.的羧酸还原酶，其中所产生的ω-羟基脂肪酸衍生物为α,ω-二醇。另一方面，本公开涵盖一种重组微生物，其具有经过工程改造以表达编码多肽的至少两个核酸序列的路径，所述多肽包括ec 3.1.2.-或ec 3.1.1.5或3.1.2.14的硫酯酶；和本公开的cyp153a-还原酶杂合融合多肽变体。所述重组微生物可用于当在来自可再生原料的碳源存在下在发酵液中生长时体内产生ω-oh脂肪酸或ω-oh脂肪酸衍生物。在一个实施方案中，所述cyp153a-还原酶杂合融合多肽变体为自给自足的cyp153a-redrhf杂合融合蛋白变体。

21、一方面，本公开提供一种产生ω-oh脂肪酸衍生物的方法，所述方法包括：(a)在包含含有碳源的可再生原料的培养基中培养本公开的重组微生物，和(b)从所述重组微生物或从所述培养基分离ω-oh脂肪酸衍生物。优选地，所述可再生原料是基于碳的，优选地其中所述基于碳的可再生原料是选自由玉米、甘蔗、高粱、甜菜、柳枝稷、青贮饲料、稻草、木材、纸浆、污水、垃圾、纤维素城市废物、烟道气、合成气、生物质水解液和二氧化碳组成的组。

22、本公开的另一方面提供一种细胞培养物，其包括本公开的重组宿主细胞。本公开的细胞培养物可产生ω-oh脂肪酸或其组合物。在一个实施方案中，所述细胞培养物产生ω-oh脂肪酸，包括c6、c7、c8、c9、c10、c11、c12、c13、c14、c15、c16、c17、c18、c19、c20、c8:1、c9:1、c10:1、c11:1、c12:1、c13:1、c14:1、c15:1、c16:1、c17:1、c18:1、c19:1和/或c20:1脂肪酸或脂肪酸衍生物或其组合物中的一者或多者。在一个实施方案中，所述细胞培养物产生不饱和ω-oh c16:1脂肪酸或其组合物。在另一实施方案中，所述细胞培养物产生饱和ω-oh c16脂肪酸或其组合物。在一个实施方案中，所述细胞培养物产生不饱和ω-oh c12:1脂肪酸或其组合物。在另一实施方案中，所述细胞培养物产生饱和ω-oh c12脂肪酸或其组合物。在一个实施方案中，所述细胞培养物产生不饱和ω-oh c14:1脂肪酸或其组合物。在另一实施方案中，所述细胞培养物产生饱和ω-oh c14脂肪酸或其组合物。在一个实施方案中，所述细胞培养物产生不饱和ω-oh c18:1脂肪酸或其组合物。在另一实施方案中，所述细胞培养物产生饱和ω-oh c18脂肪酸或其组合物。在一个实施方案中，所述细胞培养物产生不饱和ω-oh c10:1脂肪酸或其组合物。在另一实施方案中，所述细胞培养物产生饱和ω-oh c10脂肪酸或其组合物。在一个实施方案中，所述细胞培养物产生不饱和ω-oh c8:1脂肪酸或其组合物。在另一实施方案中，所述细胞培养物产生饱和ω-oh c8脂肪酸或其组合物。在一个实施方案中，所述细胞培养物产生不饱和ω-oh c20:1脂肪酸或其组合物。在另一实施方案中，所述细胞培养物产生饱和ω-oh c20脂肪酸或其组合物。在另一实施方案中，由所述重组宿主细胞产生另外的饱和或不饱和ω-oh脂肪酸或其组合物。

23、本公开的另一方面提供一种产生ω-oh脂肪酸的方法，所述方法包括用碳源培养本公开的宿主细胞；和收集ω-oh脂肪酸或其组合物。所述方法提供所产生的ω-oh脂肪酸的效价的增加/改进。所述方法涵盖收集ω-oh脂肪酸，所述脂肪酸为c6、c7、c8、c9、c10、c11、c12、c13、c14、c15、c16、c17、c18、c19、c20、c8:1、c9:1、c10:1、c11:1、c12:1、c13:1、c14:1、c15:1、c16:1、c17:1、c18:1、c19:1和/或c20:1脂肪酸或脂肪酸衍生物或其组合物。在一个实施方案中，所收集的ω-oh脂肪酸为不饱和ω-oh c16:1脂肪酸或其组合物。在另一实施方案中，所收集的ω-oh脂肪酸为饱和ω-oh c16脂肪酸或其组合物。在一个实施方案中，所收集的ω-oh脂肪酸为不饱和ω-oh c12:1脂肪酸或其组合物。在另一实施方案中，所收集的ω-oh脂肪酸为饱和ω-oh c12脂肪酸或其组合物。在一个实施方案中，所收集的ω-oh脂肪酸为不饱和ω-oh c14:1脂肪酸或其组合物。在另一实施方案中，所收集的ω-oh脂肪酸为饱和ω-oh c14脂肪酸或其组合物。在一个实施方案中，所收集的ω-oh脂肪酸为不饱和ω-oh c18:1脂肪酸或其组合物。在另一实施方案中，所收集的ω-oh脂肪酸为饱和ω-oh c18脂肪酸或其组合物。在一个实施方案中，所收集的ω-oh脂肪酸为不饱和ω-oh c10:1脂肪酸或其组合物。在另一实施方案中，所收集的ω-oh脂肪酸为饱和ω-oh c10脂肪酸或其组合物。在一个实施方案中，所收集的ω-oh脂肪酸为不饱和ω-oh c8:1脂肪酸或其组合物。在另一实施方案中，所收集的ω-oh脂肪酸为饱和ω-oh c8脂肪酸或其组合物。在一个实施方案中，所收集的ω-oh脂肪酸为不饱和ω-oh c20:1脂肪酸或其组合物。在另一实施方案中，所收集的ω-oh脂肪酸为饱和ω-ohc20脂肪酸或其组合物。在另一实施方案中，由本文所述的方法产生另外的饱和或不饱和ω-oh脂肪酸或其组合物。

24、本公开的另一方面提供一种cyp153a-还原酶杂合融合多肽变体，所述变体与seqid no:38具有至少约90％、91％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性并且在包括位置9、10、11、12、13、14、27、28、56、61、111、119、140、149、154、157、162、164、204、231、233、244、254、271、273、302、309、327、407、413、477、480、481、527、544、546、557、567、591、648、649、703、706、707、708、709、710、719、720、736、741、745、747、749、757、770、771、784的氨基酸位置处具有至少一个或多个突变，其中所述cyp153a-还原酶杂合融合多肽变体催化脂肪酸转化为ω-oh脂肪酸或其组合物。所述cyp153a-还原酶杂合融合多肽变体在以下位置中的任一处或多处具有突变，包括位置d9n，其中天冬氨酸(d)被天冬酰胺(n)取代(即，置换)；位置d9k，其中天冬氨酸(d)被赖氨酸(k)取代；位置d10y，其中天冬氨酸(d)被酪氨酸(y)取代；位置i11l，其中异亮氨酸(i)被亮氨酸(l)取代；位置q12w，其中谷氨酰胺(q)被色氨酸(w)取代；位置q12r，其中谷氨酰胺(q)被精氨酸(r)取代；位置q12t，其中谷氨酰胺(q)被苏氨酸(t)取代；位置s13k，其中丝氨酸(s)被赖氨酸(k)取代；位置r14f，其中精氨酸(r)被苯丙氨酸(f)取代；位置r27l，其中精氨酸(r)被亮氨酸(l)取代；位置q28m，其中谷氨酰胺(q)被甲硫氨酸(m)取代；位置q28t，其中谷氨酰胺(q)被苏氨酸(t)取代；位置p56q，其中脯氨酸(p)被谷氨酰胺(q)取代；位置n61l，其中天冬酰胺(n)被亮氨酸(l)取代；位置f111a，其中苯丙氨酸(f)被丙氨酸(a)取代；位置k119r，其中赖氨酸(k)被精氨酸(r)取代；位置s140n，其中丝氨酸(s)被天冬酰胺(n)取代；位置p149g，其中脯氨酸(p)被甘氨酸(g)取代；位置p149r，其中脯氨酸(p)被精氨酸(r)取代；位置v154g，其中缬氨酸(v)被甘氨酸(g)取代；位置s157r，其中丝氨酸(s)被精氨酸(r)取代；位置v162c，其中缬氨酸(v)被半胱氨酸(c)取代；位置a164n，其中丙氨酸(a)被天冬酰胺(n)取代；位置g204v，其中甘氨酸(g)被缬氨酸(v)取代；位置a231w，其中丙氨酸(a)被色氨酸(w)取代；位置a231y，其中丙氨酸(a)被酪氨酸(y)取代；位置a231v，其中丙氨酸(a)被缬氨酸(v)取代；位置s233l，其中丝氨酸(s)被亮氨酸(l)取代；位置s233v，其中丝氨酸(s)被缬氨酸(v)取代；位置a244r，其中丙氨酸(a)被精氨酸(r)取代；位置r254g，其中精氨酸(r)被甘氨酸(g)取代；位置e271d，其中谷氨酸(e)被天冬氨酸(d)取代；位置p273m，其中脯氨酸(p)被甲硫氨酸(m)取代；位置t302m，其中苏氨酸(t)被甲硫氨酸(m)取代；位置n309s，其中天冬酰胺(n)被丝氨酸(s)取代；位置p327d，其中脯氨酸(p)被天冬氨酸(d)取代；位置n407g，其中天冬酰胺(n)被甘氨酸(g)取代；位置y413r，其中酪氨酸(y)被精氨酸(r)取代；位置v451m，其中缬氨酸(v)被甲硫氨酸(m)取代；位置p477g，其中脯氨酸(p)被甘氨酸(g)取代；位置i480g，其中异亮氨酸(i)被甘氨酸(g)取代；位置g481i，其中甘氨酸(g)被异亮氨酸(i)取代；位置d527e，其中天冬氨酸(d)被谷氨酸(e)取代；位置d544n，其中天冬氨酸(d)被天冬酰胺(n)取代；位置p546g，其中脯氨酸(p)被甘氨酸(g)取代；位置e557r，其中谷氨酸(e)被精氨酸(r)取代；位置e557w，其中谷氨酸(e)被色氨酸(w)取代；位置e567s，其中谷氨酸(e)被丝氨酸(s)取代；位置e591q，其中谷氨酸(e)被谷氨酰胺(q)取代；位置v648l，其中缬氨酸(v)被亮氨酸(l)取代；位置s649i，其中丝氨酸(s)被异亮氨酸(i)取代；位置l703g，其中亮氨酸(l)被甘氨酸(g)取代；位置l706e，其中亮氨酸(l)被谷氨酸(e)取代；位置l706s，其中亮氨酸(l)被丝氨酸(s)取代；位置l706h，其中亮氨酸(l)被组氨酸(h)取代；位置d707e，其中天冬氨酸(d)被谷氨酸(e)取代；位置p708s，其中脯氨酸(p)被丝氨酸(s)取代；位置d709l，其中天冬氨酸(d)被亮氨酸(l)取代；位置v710c，其中缬氨酸(v)被半胱氨酸(c)取代；位置v710r，其中缬氨酸(v)被精氨酸(r)取代；位置v710q，其中缬氨酸(v)被谷氨酰胺(q)取代；位置r719w，其中精氨酸(r)被色氨酸(w)取代；位置d720v，其中天冬氨酸(d)被缬氨酸(v)取代；位置a736v，其中丙氨酸(a)被缬氨酸(v)取代；位置n741g，其中天冬酰胺(n)被甘氨酸(g)取代；位置p745k，其中脯氨酸(p)被赖氨酸(k)取代；位置p745r，其中脯氨酸(p)被精氨酸(r)取代；位置d747n，其中天冬氨酸(d)被天冬酰胺(n)取代；位置e749l，其中谷氨酸(e)被亮氨酸(l)取代；位置e749m，其中谷氨酸(e)被甲硫氨酸(m)取代；位置e757a，其中谷氨酸(e)被丙氨酸(a)取代；位置t770g，其中苏氨酸(t)被甘氨酸(g)取代；位置v771f，其中缬氨酸(v)被苯丙氨酸(f)取代；和位置m784i，其中甲硫氨酸(m)被异亮氨酸(i)取代。在一个实施方案中，所述cyp153a-还原酶杂合融合多肽变体为杂合cyp153a-redrhf型融合蛋白变体。在另一实施方案中，如与由模板cyp153a-还原酶杂合融合多肽(例如，cyp153a-还原酶杂合融合多肽seq id no:6或seq id no:38)在相应宿主细胞中的表达产生的ω-oh脂肪酸的效价相比，在重组宿主细胞中的所述cyp153a-还原酶杂合融合多肽变体引起ω-oh脂肪酸的更高效价。在另一实施方案中，所述ω-oh脂肪酸为ω-oh脂肪酸组合物。

25、本公开的cyp153a-还原酶杂合融合多肽变体的实例为如序列表b和c所示的seqid no:47-164(下文段落[00147]和[00148])。

26、本公开的另一方面提供一种cyp153a-还原酶杂合融合多肽变体，其与seq id no:38具有至少约90％、91％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性并且在包括位置747、12、327、14、61、28、13、771、119、10、11、28、231、745、9、770、413、784、749、233、757和703的氨基酸位置处具有至少一个突变，其中所述cyp153a-还原酶杂合融合多肽变体催化脂肪酸转化为ω-oh脂肪酸。所述cyp153a-还原酶杂合融合多肽变体在以下位置中的任一处或多处具有突变，包括位置d747n，其中天冬氨酸(d)被天冬酰胺(n)取代；位置q12w，其中谷氨酰胺(q)被色氨酸(w)取代；位置q12r，其中谷氨酰胺(q)被精氨酸(r)取代；位置q12t，其中谷氨酰胺(q)被苏氨酸(t)取代；位置p327d，其中脯氨酸(p)被天冬氨酸(d)取代；位置r14f，其中精氨酸(r)被苯丙氨酸(f)取代；位置n61l，其中天冬酰胺(n)被亮氨酸(l)取代；位置q28m，其中谷氨酰胺(q)被甲硫氨酸(m)取代；位置s13k，其中丝氨酸(s)被赖氨酸(k)取代；位置v771f，其中缬氨酸(v)被苯丙氨酸(f)取代；位置k119r，其中赖氨酸(k)被精氨酸(r)取代；位置d10y，其中天冬氨酸(d)被酪氨酸(y)取代；位置i11l，其中异亮氨酸(i)被亮氨酸(l)取代；位置q28t，其中谷氨酰胺(q)被苏氨酸(t)取代；位置p745r，其中脯氨酸(p)被精氨酸(r)取代；位置d9n，其中天冬氨酸(d)被天冬酰胺(n)取代；位置d9k，其中天冬氨酸(d)被赖氨酸(k)取代；位置t770g，其中苏氨酸(t)被甘氨酸(g)取代；位置y413r，其中酪氨酸(y)被精氨酸(r)取代；位置m784i，其中甲硫氨酸(m)被异亮氨酸(i)取代；位置e749l，其中谷氨酸(e)被亮氨酸(l)取代；位置s233l，其中丝氨酸(s)被亮氨酸(l)取代；位置e757a，其中谷氨酸(e)被丙氨酸(a)取代；位置l703g，其中亮氨酸(l)被甘氨酸(g)取代；和位置a231y，其中丙氨酸(a)被酪氨酸(y)取代。在一个实施方案中，所述cyp153a-还原酶杂合融合多肽变体为杂合cyp153a-redrhf型融合蛋白变体。在另一实施方案中，如与由模板cyp153a-还原酶杂合融合多肽(例如，cyp153a-还原酶杂合融合多肽seq id no:6或seqid no:38)在相应宿主细胞中的表达产生的ω-oh脂肪酸的效价相比，在重组宿主细胞中的所述cyp153a-还原酶杂合融合多肽变体引起ω-oh脂肪酸的更高效价。在另一实施方案中，所述cyp153a-还原酶杂合融合多肽变体(和相应多核苷酸序列)包括如序列表b和c所示的seq id no:47-164。在另一实施方案中，所述ω-oh脂肪酸为ω-oh脂肪酸组合物。

27、本公开的另一方面提供一种cyp153a-还原酶杂合融合多肽变体，其与seq id no:98具有至少约90％、91％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性并且在包括位置12、27、119、140、157、159、233和244的氨基酸位置处具有至少一个突变，其中所述cyp153a-还原酶杂合融合多肽变体催化脂肪酸转化为ω-oh脂肪酸。在一个实施方案中，所述cyp153a-还原酶杂合融合多肽变体在以下位置中的任一处或多处具有突变，包括位置q12w，其中谷氨酰胺(q)被色氨酸(w)取代；位置r27l，其中精氨酸(r)被亮氨酸(l)取代；位置k119r，其中赖氨酸(k)被精氨酸(r)取代；位置s140n，其中丝氨酸(s)被天冬酰胺(n)取代；位置s157r，其中丝氨酸(s)精氨酸(r)取代；位置v159m，其中缬氨酸(v)被甲硫氨酸(m)取代；位置s233l，其丝氨酸(s)被亮氨酸(l)取代；和位置a244r，其中丙氨酸(a)被精氨酸(r)取代。

28、本公开的另一方面提供一种cyp153a-还原酶杂合融合多肽变体，其与seq id no:100具有至少约90％、91％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性并且在包括位置12、28、61、119、231、309、413和480的氨基酸位置处具有至少一个突变，其中所述cyp153a-还原酶杂合融合多肽变体催化脂肪酸转化为ω-oh脂肪酸。所述cyp153a-还原酶杂合融合多肽变体在以下位置中的任一处或多处具有突变，包括位置q12r，其中谷氨酰胺(q)被精氨酸(r)取代；位置q28m，其中谷氨酰胺(q)被甲硫氨酸(m)取代；位置n61l，其中天冬酰胺(n)被亮氨酸(l)取代；位置k119r，其中赖氨酸(k)被精氨酸(r)取代；位置a231v，其中丙氨酸(a)被缬氨酸(v)取代；位置n309s，其中天冬酰胺(n)被丝氨酸(s)取代；位置y413r，其中酪氨酸(y)被精氨酸(r)取代；和位置i480g，其中异亮氨酸(i)被甘氨酸(g)取代。

29、本公开的另一方面提供一种cyp153a-还原酶杂合融合多肽变体，其与氨基酸序列seq id no:38具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％或89％序列同一性，其中所述cyp153a-还原酶杂合融合多肽变体包含在氨基酸位置12处的突变和在以下氨基酸位置中的每一者处的突变：(a)seq id no:38的27、119、140、157、159、233和244；(b)seq id no:38的28、61、119、231、309、413和480；(c)seq id no:38的119、231和480；(d)seq id no:38的28、77、119；141、231和407；(e)seq id no:38的28、61、141、231和407；(f)seq id no:38的28、119、231和244；(g)seq id no:38的28、407和480；(h)seq id no:38的141、231、413和481；(i)seq id no:38的28、111、231和407；(j)seq id no:38的28、61、140和149；(k)seq id no:38的28、77、119、159、231、254、407和480；(l)seq id no:38的28、254、309、407和451；(m)seq id no:38的28、254、309、407和480；或(n)seq id no:38的28、309、407、451和480；其中所述cyp153a-还原酶杂合融合多肽变体催化脂肪酸转化为ω-羟基化脂肪酸。本公开的另一方面提供一种cyp153a-还原酶杂合融合多肽变体，其与氨基酸序列seq id no:38具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性，其中所述cyp153a-还原酶杂合融合多肽变体包含在氨基酸位置12处的突变和在以下氨基酸位置中的每一者处的突变：(a)seq id no:38的27、119、140、157、159、233和244；(b)seq id no:38的28、61、119、231、309、413和480；(c)seq id no:38的119、231和480；(d)seq id no:38的28、77、119；141、231和407；(e)seq id no:38的28、61、141、231和407；(f)seq id no:38的28、119、231和244；(g)seq id no:38的28、407和480；(h)seq idno:38的141、231、413和481；(i)seq id no:38的28、111、231和407；(j)seq id no:38的28、61、140和149；(k)seq id no:38的28、77、119、159、231、254、407和480；(l)seq id no:38的28、254、309、407和451；(m)seq id no:38的28、254、309、407和480；或(n)seq id no:38的28、309、407、451和480；其中所述cyp153a-还原酶杂合融合多肽变体催化脂肪酸转化为ω-羟基化脂肪酸。在多个实施方案中，在(a)氨基酸位置seq id no:38的12、27、119、140、157、159、233和244处的所述突变为氨基酸取代。在多个实施方案中，在(b)氨基酸位置seq idno:38的12、28、61、119、231、309、413和480处的所述突变为氨基酸取代。在多个实施方案中，在(c)氨基酸位置seq id no:38的12、119、231和480处的所述突变为氨基酸取代。在多个实施方案中，在(d)氨基酸位置seq id no:38的12、28、77、119；141、231和407处的所述突变为氨基酸取代。在多个实施方案中，在(e)氨基酸位置seq id no:38的12、28、61、141、231和407处的所述突变为氨基酸取代。在多个实施方案中，在(f)氨基酸位置seq id no:38的12、28、119、231和244处的所述突变为氨基酸取代。在多个实施方案中，在(g)氨基酸位置seq id no:38的12、28、407和480处的所述突变为氨基酸取代。在多个实施方案中，在(h)氨基酸位置seq id no:38的12、141、231、413和481处的所述突变为氨基酸取代。在多个实施方案中，在(i)氨基酸位置seq id no:38的12、28、111、231和407处的所述突变为氨基酸取代。在多个实施方案中，在(j)氨基酸位置seq id no:38的12、28、61、140和149处的所述突变为氨基酸取代。在多个实施方案中，在(k)氨基酸位置12、28、77、119、159、231、254、407和480处的所述突变为氨基酸取代。在多个实施方案中，在(l)氨基酸位置seq id no:38的12、28、254、309、407和451处的所述突变为氨基酸取代。在多个实施方案中，在(m)氨基酸位置seq id no:38的12、28、254、309、407和480处的所述突变为氨基酸取代。在多个实施方案中，在(n)氨基酸位置seq id no:38的12、28、309、407、451和480处的所述突变为氨基酸取代。在一个实施方案中，在(a)氨基酸位置seq id no:38的12、27、119、140、157、159、233和244处的所述突变分别为q12w、r27l、k119r、s140n、s157r、v159m、s233l和a244r。在一个实施方案中，在(b)氨基酸位置seq id no:38的12、28、61、119、231、309、413和480处的所述突变分别为q12r、q28m、n61l、k119r、a231v、n309s、y413r和i480g。在一个实施方案中，在(c)氨基酸位置seq id no:38的12、119、231和480处的所述突变分别为q12r、k119r、a231v和i480g。在一个实施方案中，在(d)氨基酸位置seq id no:38的12、28、77、119；141、231和407处的所述突变分别为q12t、q28m、r77q、k119r、v141t、a231w和n407g。在一个实施方案中，在(e)氨基酸位置seq id no:38的12、28、61、141、231和407处的所述突变分别为q12r、q28m、n61l、v141t、a231y和n407g。在一个实施方案中，在(f)氨基酸位置seq id no:38的12、28、119、231和244处的所述突变分别为q12w、q28m、k119r、a231y和a244r。在一个实施方案中，在(g)氨基酸位置seq id no:38的12、28、407和480处的所述突变分别为q12w、q28t、n407g和i480g。在一个实施方案中，在(h)氨基酸位置seq id no:38的12、141、231、413和481处的所述突变分别为q12r、v141t、a231y、y413r和g481i。在一个实施方案中，在(i)氨基酸位置seq id no:38的12、28、111、231和407处的所述突变分别为q12t、q28m、f111a、a231v和n407g。在一个实施方案中，在(j)氨基酸位置seq id no:38的12、28、61、140和149处的所述突变分别为q12t、q28m、n61l、s140n和p149r。在一个实施方案中，在(k)氨基酸位置12、28、77、119、159、231、254、407和480处的所述突变分别为q12w、q28t、r77q、k119r、v159m、a231y、r254g、n407g和i480g。在一个实施方案中，在(l)氨基酸位置seq id no:38的12、28、254、309、407和451处的所述突变分别为q12w、q28t、r254g、n309s、n407g和v451m。在一个实施方案中，在(m)氨基酸位置seq id no:38的12、28、254、309、407和480处的所述突变分别为q12w、q28t、r254g、n309s、n407g和i480g。在一个实施方案中，在(n)氨基酸位置seq idno:38的12、28、309、407、451和480处的所述突变分别为q12w、q28t、n309s、n407g、v451m和i480g。在一个优选实施方案中，以上(a)的cyp153a-还原酶杂合融合多肽变体进一步包含在氨基酸位置seq id no:38的141、231和407中的每一者处，或在氨基酸位置seq id no:38的231、407、451、757、770和784中的每一者处，或在氨基酸位置seq id no:38的231、407、591、643、757和784中的每一者处的突变。在多个实施方案中，在氨基酸位置seq id no:38的141、231和407中的每一者处的所述进一步突变为氨基酸取代。另外，在多个实施方案中，在氨基酸位置seq id no:38的231、407、451、757、770和784中的每一者处的所述进一步突变为氨基酸取代。另外，在多个实施方案中，在氨基酸位置seq id no:38的231、407、591、643、757和784中的每一者处的所述进一步突变为氨基酸取代。优选地，在氨基酸位置seqid no:38的141、231和407中的每一者处的所述进一步突变分别为v141t、a231y和n407g。另外，优选地，在氨基酸位置seq id no:38的231、407、451、757、770和784中的每一者处的所述突变分别为a231y、n407g、v451m、e757a、t770g和m784i。另外，优选地，在氨基酸位置seqid no:38的231、407、591、643、757和784中的每一者处的所述突变分别为a231y、n407g、e591q、r643h、e757a和m784i。更优选地，本公开的cyp153a-还原酶杂合融合多肽变体包含氨基酸序列seq id no:146、seq id no:150或seq id no:160。在本公开的其它实施方案中，所述cyp153a-还原酶杂合融合多肽变体包含氨基酸序列seq id no:98、seq id no:100、seq id no:102、seq id no:104、seq id no:106、seq id no:108、seq id no:110、seqid no:112、seq id no:114、seq id no:116、seq id no:118、seq id no:120、seq id no:122和seq id no:124中的任一者。

30、另一方面，本公开提供一种cyp153a-还原酶杂合融合多肽变体，其包含与氨基酸序列seq id no:38的至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％或89％序列同一性，其中所述cyp153a-还原酶杂合融合多肽变体包含在rhf结构域(或rhf还原酶结构域，或red450rhf结构域，或red450rhf还原酶结构域，或p450rhf结构域，或p450rhf还原酶结构域)中在以下氨基酸位置中的每一者处的突变：(a)seq id no:38的527、544、719、757、771和784；(b)seq id no:38的527、544和557；(c)seq id no:38的770和784；(d)seqid no:38的527、591、648、719、757、771和784；(e)seq id no:38的527、591、648、757和771；(f)seq id no:38的527、544、770和784；(g)seq id no:38的527、557、770和784；(h)seq idno:38的557、757和770；(i)seq id no:38的557、757和771；或(j)seq id no:38的757和770；其中所述cyp153a-还原酶杂合融合多肽变体催化脂肪酸转化为ω-羟基化脂肪酸。另一方面，本公开提供一种cyp153a-还原酶杂合融合多肽变体，其包含与氨基酸序列seq idno:38的至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性，其中所述cyp153a-还原酶杂合融合多肽变体包含在rhf结构域(或rhf还原酶结构域，或red450rhf结构域，或red450rhf还原酶结构域，或p450rhf结构域，或p450rhf还原酶结构域)中在以下氨基酸位置中的每一者处的突变：(a)seq id no:38的527、544、719、757、771和784；(b)seq id no:38的527、544和557；(c)seq id no:38的770和784；(d)seq id no:38的527、591、648、719、757、771和784；(e)seq id no:38的527、591、648、757和771；(f)seqid no:38的527、544、770和784；(g)seq id no:38的527、557、770和784；(h)seq id no:38的557、757和770；(i)seq id no:38的557、757和771；或(j)seq id no:38的757和770；其中所述cyp153a-还原酶杂合融合多肽变体催化脂肪酸转化为ω-羟基化脂肪酸。在多个实施方案中，在(a)氨基酸位置seq id no:38的527、544、719、757、771和784处的所述突变为氨基酸取代。在多个实施方案中，在(b)氨基酸位置seq id no:38的527、544和557处的所述突变为氨基酸取代。在多个实施方案中，在(c)氨基酸位置seq id no:38的770和784处的所述突变为氨基酸取代。在多个实施方案中，在(d)氨基酸位置seq id no:38的527、591、648、719、757、771和784处的所述突变为氨基酸取代。在多个实施方案中，在(e)氨基酸位置seqid no:38的527、591、648、757和771处的所述突变为氨基酸取代。在多个实施方案中，在(f)氨基酸位置seq id no:38的527、544、770和784处的所述突变为氨基酸取代。在多个实施方案中，在(g)氨基酸位置seq id no:38的527、557、770和784处的所述突变为氨基酸取代。在多个实施方案中，在(h)氨基酸位置seq id no:38的557、757和770处的所述突变为氨基酸取代。在多个实施方案中，在(i)氨基酸位置seq id no:38的557、757和771处的所述突变为氨基酸取代。在多个实施方案中，在(j)氨基酸位置seq id no:38的757和770处的所述突变为氨基酸取代。在一个实施方案中，在(a)氨基酸位置seq id no:38的527、544、719、757、771和784处的所述突变分别为d527e、d544n、r719w、e757a、v771f和m784i。在一个实施方案中，在(b)氨基酸位置seq id no:38的527、544和557处的所述突变分别为d527e、d544n和e557r。在一个实施方案中，在(c)氨基酸位置seq id no:38的770和784处的所述突变分别为t770g和m784i。在一个实施方案中，在(d)氨基酸位置seq id no:38的527、591、648、719、757、771和784处的所述突变分别为d527e、e591q、v648l、r719w、e757a、v771f和m784i。在一个实施方案中，在(e)氨基酸位置seq id no:38的527、591、648、757和771处的所述突变分别为d527e、e591q、v648l、e757a和v771f。在一个实施方案中，在(f)氨基酸位置seq id no:38的527、544、770和784处的所述突变分别为d527e、d544n、t770g和m784i。在一个实施方案中，在(g)氨基酸位置seq id no:38的527、557、770和784处的所述突变分别为d527e、e557r、t770g和m784i。在一个实施方案中，在(h)氨基酸位置seq id no:38的557、757和770处的所述突变分别为e557w、e757a和t770g。在一个实施方案中，在(i)氨基酸位置seq idno:38的557、757和771处的所述突变分别为e557r、e757a和v771f。在一个实施方案中，在(j)氨基酸位置seq id no:38的757和770处的所述突变分别为e757a和t770g。在本公开的一些优选实施方案中，所述cyp153a-还原酶杂合融合多肽变体包含氨基酸序列seq id no:126、seq id no:128、seq id no:130、seq id no:132、seq id no:134、seq id no:136、seqid no:138、seq id no:140、seq id no:142和seq id no:144中的任一者。

31、另一方面，本公开提供一种cyp153a-还原酶杂合融合多肽变体，其包含与氨基酸序列seq id no:38的至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性，其中所述cyp153a-还原酶杂合融合多肽变体包含在以下位置中的每一者处的突变：(a)seq id no:38的141、231、233和254；(b)seq id no:38的141、231、233和244；(c)seqid no:38的141、231、244、451、557、749和770；(d)seq id no:38的27、28、61、141、149和231；(e)seq id no:38的141、157、231、233、244、757和784；(f)seq id no:38的28、61、140、141、231、233和271；或(g)seq id no:38的231、233、254和557；其中所述cyp153a-还原酶杂合融合多肽变体催化脂肪酸转化为ω-羟基化脂肪酸。另一方面，本公开提供一种cyp153a-还原酶杂合融合多肽变体，其包含与氨基酸序列seq id no:38的至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％或89％序列同一性，其中所述cyp153a-还原酶杂合融合多肽变体包含在以下位置中的每一者处的突变：(a)seq id no:38的141、231、233和254；(b)seq id no:38的141、231、233和244；(c)seq id no:38的141、231、244、451、557、749和770；(d)seq id no:38的27、28、61、141、149和231；(e)seq id no:38的141、157、231、233、244、757和784；(f)seq id no:38的28、61、140、141、231、233和271；或(g)seq id no:38的231、233、254和557；其中所述cyp153a-还原酶杂合融合多肽变体催化脂肪酸转化为ω-羟基化脂肪酸。在多个实施方案中，在(a)氨基酸位置seq id no:38的141、231、233和254处的所述突变为氨基酸取代。在多个实施方案中，在(b)氨基酸位置seq id no:38的141、231、233和244处的所述突变为氨基酸取代。在多个实施方案中，在(c)氨基酸位置seq id no:38的141、231、244、451、557、749和770处的所述突变为氨基酸取代。在多个实施方案中，在(d)氨基酸位置seq id no:38的27、28、61、141、149和231处的所述突变为氨基酸取代。在多个实施方案中，在(e)氨基酸位置seq id no:38的141、157、231、233、244、757和784处的所述突变为氨基酸取代。在多个实施方案中，在(f)氨基酸位置seq id no:38的28、61、140、141、231、233和271处的所述突变为氨基酸取代。在多个实施方案中，在(g)氨基酸位置seq idno:38的231、233、254和557处的所述突变为氨基酸取代。在一个实施方案中，在(a)氨基酸位置seq id no:38的141、231、233和254处的所述突变分别为v141t、a231y、l233s和r254g。在一个实施方案中，在(b)氨基酸位置seq id no:38的141、231、233和244处的所述突变分别为v141t、a231y、l233s和r244a。在一个实施方案中，在(c)氨基酸位置seq id no:38的141、231、244、451、557、749和770处的所述突变分别为v141t、a231y、r244a、v451m、e557w、e749l和t770g。在一个实施方案中，在(d)氨基酸位置seq id no:38的27、28、61、141、149和231处的所述突变分别为l27r、q28m、n61l、v141t、p149g和a231y。

32、在一个实施方案中，在(e)氨基酸位置seq id no:38的141、157、231、233、244、757和784处的所述突变分别为v141t、r157s、a231y、l233s、r244a、e757a和m784i。在一个实施方案中，在(f)氨基酸位置seq id no:38的28、61、140、141、231、233和271处的所述突变分别为q28m、n61l、n140s、v141t、a231y、l233s和e271d。在一个实施方案中，在(g)氨基酸位置seq id no:38的231、233、254和557处的所述突变分别为a231y、l233s、r254g和e557w。在本公开的一些优选实施方案中，本公开的cyp153a-还原酶杂合融合多肽变体包含氨基酸序列seq id no:148、seq id no:152、seq id no:154、seq id no:156、seq id no:158、seq idno:162和seq id no:164中的任一者。

33、另一方面，本公开提供一种cyp153a-还原酶杂合融合多肽变体，其包含与氨基酸序列seq id no:98的至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％或89％序列同一性，其中所述cyp153a-还原酶杂合融合多肽变体包含在以下氨基酸位置中的每一者处的突变：(a)seq id no:98的141、231和407；(b)seq id no:98的141、231、233和254；(c)seq id no:98的231、407、451、757、770和784；(d)seq id no:98的141、231、233和244；(e)seq id no:98的141、231、244、451、557、749和770；(f)seq id no:98的27、28、61、141、149和231；(g)seq id no:98的27、119、140、141、159、231、757和784；(h)seq id no:98的231、407、591、643、757和784；(i)seq id no:98的28、61、140、141、231、233和271；或(j)seq idno:98的231、233和254；其中所述cyp153a-还原酶杂合融合多肽变体催化脂肪酸转化为ω-羟基化脂肪酸。另一方面，本公开提供一种cyp153a-还原酶杂合融合多肽变体，其包含与氨基酸序列seq id no:98的至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性，其中所述cyp153a-还原酶杂合融合多肽变体包含在以下氨基酸位置中的每一者处的突变：(a)seq id no:98的141、231和407；(b)seq id no:98的141、231、233和254；(c)seq id no:98的231、407、451、757、770和784；(d)seq id no:98的141、231、233和244；(e)seq id no:98的141、231、244、451、557、749和770；(f)seq id no:98的27、28、61、141、149和231；(g)seq id no:98的27、119、140、141、159、231、757和784；(h)seq id no:98的231、407、591、643、757和784；(i)seq id no:98的28、61、140、141、231、233和271；或(j)seq id no:98的231、233和254；其中所述cyp153a-还原酶杂合融合多肽变体催化脂肪酸转化为ω-羟基化脂肪酸。在多个实施方案中，在(a)氨基酸位置seq id no:98的141、231和407处的所述突变为氨基酸取代。在多个实施方案中，在(b)氨基酸位置seq id no:98的141、231、233和254处的所述突变为氨基酸取代。在多个实施方案中，在(c)氨基酸位置seqid no:98的231、407、451、757、770和784处的所述突变为氨基酸取代。在多个实施方案中，在(d)氨基酸位置seq id no:98的141、231、233和244处的所述突变为氨基酸取代。在多个实施方案中，在(e)氨基酸位置seq id no:98的141、231、244、451、557、749和770处的所述突变为氨基酸取代。在多个实施方案中，在(f)氨基酸位置seq id no:98的27、28、61、141、149和231处的所述突变为氨基酸取代。在多个实施方案中，在(g)氨基酸位置seq id no:98的27、119、140、141、159、231、757和784处的所述突变为氨基酸取代。在多个实施方案中，在(h)氨基酸位置seq id no:98的231、407、591、643、757和784处的所述突变为氨基酸取代。在多个实施方案中，在(i)氨基酸位置seq id no:98的28、61、140、141、231、233和271处的所述突变为氨基酸取代。在多个实施方案中，在(j)氨基酸位置seq id no:38的231、233和254处的所述突变为氨基酸取代。在一个实施方案中，在(a)氨基酸位置seq id no:98的141、231和407处的所述突变分别为v141t、a231y和n407g。在一个实施方案中，在(b)氨基酸位置seq id no:98的141、231、233和254处的所述突变分别为v141t、a231y、l233s和r254g。在一个实施方案中，在(c)氨基酸位置seq id no:98的231、407、451、757、770和784处的所述突变分别为a231y、n407g、v451m、e757a、t770g和m784i。在一个实施方案中，在(d)氨基酸位置seq id no:98的141、231、233和244处的所述突变分别为v141t、a231y、l233s和r244a。在一个实施方案中，在(e)氨基酸位置seq id no:98的141、231、244、451、557、749和770处的所述突变分别为v141t、a231y、r244a、v451m、e557w、e749l和t770g。在一个实施方案中，在(f)氨基酸位置seq id no:98的27、28、61、141、149和231处的所述突变分别为l27r、q28m、n61l、v141t、p149g和a231y。在一个实施方案中，在(g)氨基酸位置seq id no:98的141、157、231、233、244、757和784处的所述突变分别为v141t、r157s、a231y、l233s、r244a、e757a和m784i。在一个实施方案中，在(h)氨基酸位置seq id no:98的231、407、591、643、757和784处的所述突变分别为a231y、n407g、e591q、r643h、e757a和m784i。在一个实施方案中，在(i)氨基酸位置seq id no:98的28、61、140、141、231、233和271处的所述突变分别为q28m、n61l、n140s、v141t、a231y、l233s和e271d。在一个实施方案中，在(j)氨基酸位置seqid no:98的231、233、254和557处的所述突变分别为a231y、l233s、r254g和e557w。在本公开的一些优选实施方案中，本公开的cyp153a-还原酶杂合融合多肽变体包含氨基酸序列seqid no:146、seq id no:148、seq id no:150、seq id no:152、seq id no:154、seq id no:156、seq id no:158、seq id no:160；seq id no:162和seq id no:164中的任一者。

34、另一方面，本公开提供一种cyp153a-还原酶杂合融合多肽变体，其包含与氨基酸序列seq id no:38或seq id no:98的至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性，其中所述cyp153a-还原酶杂合融合多肽变体包含在位置10、11、12、27、28、111、119、140、141、149、157、159、197、231、233、244、254、407和477处的一种或多种突变。所述cyp153a-还原酶杂合融合多肽变体催化脂肪酸转化为ω-羟基化脂肪酸。另一方面，本公开提供一种cyp153a-还原酶杂合融合多肽变体，其包含与氨基酸序列seqid no:38或seq id no:98的至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％或89％序列同一性，其中所述cyp153a-还原酶杂合融合多肽变体包含一种或多种突变，其包括(a)q12w、r27l、q28m、k119r、v141t、s157r、v159m、a231y、s233l、a244r(seq id no:166)；(b)q12w、q28m、k119r、s140n、s157r、v159m、s233l、a244r、r254g、n407g(seq id no:168)；(c)q12w、r27l、f111a、k119r、v141t、s157r、v159m、a231y、s233l、a244r、r254g(seq id no:170)；(d)q12w、q28m、k119r、s140n、p149g、s157r、v159m、a231y、s233l、n407g(seq id no:172)；(e)q12w、r27l、q28m、k119r、s140n、s157r、v159m、s233l、a244r、n407g(seq id no:174)；(f)d10y、i11l、q12w、q28m、k119r、v141t、v159m、a231y、s233l、a244r、n407g(seq idno:176)；(g)i11l、q12w、r27l、q28m、k119r、v141t、s157r、v159m、a197t、a231y、s233l、a244r、n407g、p477g(seq id no:178)；(h)i11l、q12w、q28m、k119r、v141t、s157r、v159m、a197t、a231y、s233l、a244r、n407g(seq id no:180)；和(i)i11l、q12w、r27l、q28m、k119r、v141t、p149g、s157r、v159m、a231y、s233l、n407g(seq id no:182)。在多个实施方案中，在(a)-(i)下的所述突变为氨基酸取代。在本公开的一些优选实施方案中，本公开的cyp153a-还原酶杂合融合多肽变体包含氨基酸序列seq id no:166、seq id no:168、seq id no:170、seq id no:172、seq id no:174、seq id no:176、seq id no:178、seq id no:180和seq id no:182中的任一者。

35、本公开预期一种cyp153a-还原酶杂合融合多肽变体，其与氨基酸序列seq id no:38具有至少90％序列同一性，其中所述cyp153a-还原酶杂合融合多肽变体具有在氨基酸位置12处的突变和在以下氨基酸位置中的每一者处的突变：(a)seq id no:38的12、27、28、119、141、157、159、231、233和244；(b)seq id no:38的12、28、119、140、157、159、233、244、254和407；(c)seq id no:38的12、27、111、119、141、157、159、231、233、244和254；(d)seqid no:38的12、28、119、140、149、157、159、231、233和407；(e)seq id no:38的12、27、28、119、140、157、159、233、244和407；(f)seq id no:38的10、11、12、28、119、141、159、231、233、244和407；(g)seq id no:38的11、12、27、28、119、141、157、159、197、231、233、244、407和477；(h)seq id no:38的11、12、28、119、141、157、159、197、231、233、244和407；或(i)seqid no:38的11、12、27、28、119、141、149、157、159、231、233和407；其中所述cyp153a-还原酶杂合融合多肽变体催化脂肪酸转化为ω-羟基化脂肪酸。

36、在一个特定方面，本公开提供如技术方案1的cyp153a-还原酶杂合融合多肽变体，其中：(a)在氨基酸位置seq id no:38的12、27、28、119、141、157、159、231、233和244处的所述突变分别为q12w、r27l、q28m、k119r、v141t、s157r、v159m、a231y、s233l和a244r；(b)在氨基酸位置seq id no:38的12、28、119、140、157、159、233、244、254和407处的所述突变分别为q12w、q28m、k119r、s140n、s157r、v159m、s233l、a244r、r254g和n407g；(c)在氨基酸位置seq id no:38的12、27、111、119、141、157、159、231、233、244和254处的所述突变分别为q12w、r27l、f111a、k119r、v141t、s157r、v159m、a231y、s233l、a244r和r254g；(d)在氨基酸位置seq id no:38的12、28、119、140、149、157、159、231、233和407处的所述突变分别为q12w、q28m、k119r、s140n、p149g、s157r、v159m、a231y、s233l和n407g；(e)在氨基酸位置seqid no:38的12、27、28、119、140、157、159、233、244和407处的所述突变分别为q12w、r27l、q28m、k119r、s140n、s157r、v159m、s233l、a244r和n407g；(f)在氨基酸位置seq id no:38的10、11、12、28、119、141、159、231、233、244和407处的所述突变分别为d10y、i11l、q12w、q28m、k119r、v141t、v159m、a231y、s233l、a244r和n407g；(g)在氨基酸位置seq id no:38的11、12、27、28、119、141、157、159、197、231、233、244、407和477处的所述突变分别为i11l、q12w、r27l、q28m、k119r、v141t、s157r、v159m、a197t、a231y、s233l、a244r、n407g和p477g；(h)在氨基酸位置seq id no:38的11、12、28、119、141、157、159、197、231、233、244和407处的所述突变分别为i11l、q12w、q28m、k119r、v141t、s157r、v159m、a197t、a231y、s233l、a244r和n407g；和(i)在氨基酸位置seq id no:38的11、12、27、28、119、141、149、157、159、231、233和407处的所述突变分别为i11l、q12w、r27l、q28m、k119r、v141t、p149g、s157r、v159m、a231y、s233l和n407g。

37、另一方面，本公开提供如技术方案2的cyp153a-还原酶杂合融合多肽变体，其中：(a)(a)的所述cyp153a-还原酶杂合融合多肽变体具有氨基酸序列seq id no:166；(b)(b)的所述cyp153a-还原酶杂合融合多肽变体具有氨基酸序列seq id no:168；(c)(c)的所述cyp153a-还原酶杂合融合多肽变体具有氨基酸序列seq id no:170；(d)(d)的所述cyp153a-还原酶杂合融合多肽变体具有氨基酸序列seq id no:172；(e)(e)的所述cyp153a-还原酶杂合融合多肽变体具有氨基酸序列seq id no:174；(f)(f)的所述cyp153a-还原酶杂合融合多肽变体具有氨基酸序列seq id no:176；(g)(g)的所述cyp153a-还原酶杂合融合多肽变体具有氨基酸序列seq id no:178；(h)(h)的所述cyp153a-还原酶杂合融合多肽变体具有氨基酸序列seq id no:180；和(i)(i)的所述cyp153a-还原酶杂合融合多肽变体具有氨基酸序列seq id no:182。

38、在一个实施方案中，所述cyp153a-还原酶杂合融合多肽变体包括但不限于seq idno:166、seq id no:168、seq id no:170、seq id no:172、seq id no:174、seq id no:176、seq id no:178、seq id no:180和seq id no:182。在另一实施方案中，如与通过cyp153a-还原酶杂合融合多肽seq id no:6或seq id no:38在相应宿主细胞中的表达产生的ω-羟基化脂肪酸的效价相比，所述cyp153a-还原酶杂合融合多肽变体在重组宿主细胞中的表达引起ω-羟基化脂肪酸的较高效价。在另一实施方案中，所述cyp153a-还原酶杂合融合多肽变体为杂合cyp153a-redrhf融合蛋白变体。在另一实施方案中，重组宿主细胞表达本公开的cyp153a-还原酶杂合融合多肽变体。在另一实施方案中，所述重组宿主细胞进一步表达ec3.1.2.-、ec 3.1.1.5或ec 3.1.2.14的硫酯酶多肽。在另一实施方案中，当在含有碳源的培养基中培养时，所述重组宿主细胞产生ω-羟基化脂肪酸组合物，其具有比由表达具有seq id no:38或seq id no:6的相应cyp153a-还原酶杂合融合多肽的宿主细胞产生的ω-羟基化脂肪酸组合物的效价大至少10％、大至少15％、大至少20％、大至少25％或大至少30％的效价。在另一实施方案中，本公开提供一种细胞培养物，其包括如上文所预期的重组宿主细胞。

39、另一方面，本公开提供一种产生ω-羟基化脂肪酸的方法，步骤包括：(i)在碳源存在下培养重组宿主细胞或所述细胞培养物；和(ii)收集ω-羟基化脂肪酸。

40、本公开进一步预期一种重组微生物，其包含经过工程改造以表达编码多肽的至少两个核酸序列的路径，所述多肽包括：(i)ec 3.1.2.-、ec 3.1.1.5或ec 3.1.2.14的硫酯酶；和(ii)cyp153a-还原酶杂合融合多肽变体。

41、本公开的cyp153a-还原酶杂合融合多肽变体包含cyp153aω-羟化酶结构域和p450rhf还原酶结构域。所述两个结构域的顺序不限于图5所示的顺序。所述cyp153aω-羟化酶结构域可在n端处或可在所述杂合融合多肽变体的c端处。另外，所述p450rhf还原酶结构域可在n端处或可在所述杂合融合多肽变体的c端处。所述两个结构域可直接地或如图5所示通过连接体连接。在多个实施方案中，所述连接体为肽或多肽连接体。所述连接体的氨基酸序列的长度可凭经验或在结构信息的指导下或通过使用所述两种方法的组合来选择。所属领域的技术人员将认识到，长度或组成变化的多个所述序列可充当连接体，主要考虑到其既不过长又不过短。

42、本公开的cyp153a-还原酶杂合融合多肽变体包含如上文所提及的cyp153aω-羟化酶结构域和p450rhf还原酶结构域。cyp153a-还原酶杂合融合多肽seq id no:6的氨基酸序列具有一种突变，即在位置307处的突变(g307a)，其中丙氨酸(a)被甘氨酸(g)取代(即，被置换)。cyp153a-还原酶杂合融合多肽seq id no:38的氨基酸序列对应于cyp153a-还原酶杂合融合多肽seq id no:6的氨基酸序列，除了具有一种另外的突变，即在位置796处的突变(a796v)，其中丙氨酸(a)被缬氨酸(v)取代(即，被置换)。

43、作为(模板)cyp153a-还原酶杂合融合多肽，可考虑杂合融合蛋白，其中cyp153ap450加氧酶与还原酶结构域融合以产生ω-羟基脂肪酸衍生物。自给自足的细胞色素p450加氧酶是其中还原酶搭配物融合至细胞色素p450催化蛋白的酶。一类自给自足的细菌细胞色素p450加氧酶由来自红球菌属ncimb 9784(roberts等人(2003)j.biol.chem.278:48914；hunter等人(2005)febs lett.579:2215)的p450rhf表示并且被称作“i类p450融合pfor”(demot和parret(2002)trends microbiol.10:502)。因此，作为(模板)cyp153a-还原酶杂合融合多肽，可考虑包含cypl53a p450催化蛋白(例如，来自水油海杆菌)和来自红球菌属ncimb9784的p450rhf的c端含fmn和fe/s还原酶结构域的融合蛋白。

44、在本公开的多个实施方案中，所述杂合融合多肽变体为自给自足的并且具有ω-羟化酶酶活性，所述酶活性催化脂肪酸(衍生物)反应生成ω-oh脂肪酸或ω-oh脂肪酸衍生物。

45、一方面，本公开涵盖一种重组微生物或重组宿主细胞，所述微生物或重组宿主细胞用于当在来自可再生原料的碳源存在下在发酵液中生长时体内产生ω-oh脂肪酸或ω-oh脂肪酸衍生物，所述微生物具有经过工程改造以表达编码多肽的至少两个核酸序列的途径，所述多肽包括ec 3.1.2.-或ec 3.1.1.5或ec 3.1.2.14的硫酯酶；和cyp153a-还原酶杂合融合多肽变体，其中所述cyp153a-还原酶杂合融合多肽变体与seq id no:48、seq idno:50、seq id no:52、seq id no:54、seq id no:56seq id no:58、seq id no:60seq idno:62、seq id no:64、seq id no:66、seq id no:68、seq id no:70、seq id no:72、seq idno:74、seq id no:76、seq id no:78、seq id no:80、seq id no:82、seq id no:84、seq idno:86、seq id no:88、seq id no:90、seq id no:92、seq id no:94、seq id no:96、seq idno:98、seq id no:100、seq id no:102、seq id no:104、seq id no:106、seq id no:108、seq id no:110、seq id no:112、seq id no:114、seq id no:116、seq id no:118、seq idno:120、seq id no:122、seq id no:124、seq id no:126、seq id no:128、seq id no:130、seq id no:132、seq id no:134、seq id no:136、seq id no:138、seq id no:140、seq idno:142、seq id no:144、seq id no:146、seq id no:148、seq id no:150、seq id no:152、seq id no:154、seq id no:156、seq id no:158、seq id no:160、seq id no:162和seq idno:164中任一者具有至少90％、91％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。在一个实施方案中，所述cyp153a-还原酶杂合融合多肽变体为自给自足的cyp153a-redrhf杂合融合蛋白变体。

46、本公开的另一方面提供一种细胞培养物，其包括如上文所论述(上文)的重组宿主细胞，其中所述细胞培养物产生ω-oh脂肪酸或其组合物。在一个实施方案中，所述细胞培养物产生ω-oh脂肪酸，包括c6、c7、c8、c9、c10、c11、c12、c13、c14、c15、c16、c17、c18、c19、c20、c8:1、c9:1、c10:1、c11:1、c12:1、c13:1、c14:1、c15:1、c16:1、c17:1、c18:1、c19:1和/或c20:1脂肪酸或脂肪酸衍生物或其组合物中的一者或多者。在一个实施方案中，所述细胞培养物产生不饱和ω-ohc16:1脂肪酸或其组合物。在另一实施方案中，所述细胞培养物产生饱和ω-oh c16脂肪酸或其组合物。在一个实施方案中，所述细胞培养物产生不饱和ω-oh c12:1脂肪酸或其组合物。在另一实施方案中，所述细胞培养物产生饱和ω-oh c12脂肪酸或其组合物。在一个实施方案中，所述细胞培养物产生不饱和ω-oh c14:1脂肪酸或其组合物。在另一实施方案中，所述细胞培养物产生饱和ω-oh c14脂肪酸或其组合物。在一个实施方案中，所述细胞培养物产生不饱和ω-oh c18:1脂肪酸或其组合物。在另一实施方案中，所述细胞培养物产生饱和ω-oh c18脂肪酸或其组合物。在一个实施方案中，所述细胞培养物产生不饱和ω-oh c10:1脂肪酸或其组合物。在另一实施方案中，所述细胞培养物产生饱和ω-oh c10脂肪酸或其组合物。在一个实施方案中，所述细胞培养物产生不饱和ω-oh c8:1脂肪酸或其组合物。在另一实施方案中，所述细胞培养物产生饱和ω-oh c8脂肪酸或其组合物。在一个实施方案中，所述细胞培养物产生不饱和ω-oh c20:1脂肪酸或其组合物。在另一实施方案中，所述细胞培养物产生饱和ω-oh c20脂肪酸或其组合物。在另一实施方案中，由所述重组宿主细胞产生另外的饱和或不饱和ω-oh脂肪酸或其组合物。

47、本公开的另一方面提供一种产生效价增加的ω-oh脂肪酸的方法，所述方法包括用碳源培养所述宿主细胞(上文)；和收集ω-oh脂肪酸或其组合物。特别地，所述方法涵盖产生c6、c7、c8、c9、c10、c11、c12、c13、c14、c15、c16、c17、c18、c19、c20、c8:1、c9:1、c10:1、c11:1、c12:1、c13:1、c14:1、c15:1、c16:1、c17:1、c18:1、c19:1和/或c20:1脂肪酸或脂肪酸衍生物或其组合物。在一个实施方案中，所收集的ω-oh脂肪酸为不饱和ω-oh c16:1脂肪酸或其组合物。在另一实施方案中，所收集的ω-oh脂肪酸为饱和ω-oh c16脂肪酸或其组合物。在一个实施方案中，所收集的ω-oh脂肪酸为不饱和ω-oh c12:1脂肪酸或其组合物。在另一实施方案中，所收集的ω-oh脂肪酸为饱和ω-oh c12脂肪酸或其组合物。在一个实施方案中，所收集的ω-oh脂肪酸为不饱和ω-oh c14:1脂肪酸或其组合物。在另一实施方案中，所收集的ω-oh脂肪酸为饱和ω-oh c14脂肪酸或其组合物。在一个实施方案中，所收集的ω-oh脂肪酸为不饱和ω-ohc18:1脂肪酸或其组合物。在另一实施方案中，所收集的ω-oh脂肪酸为饱和ω-oh c18脂肪酸或其组合物。在一个实施方案中，所收集的ω-oh脂肪酸为不饱和ω-oh c10:1脂肪酸或其组合物。在另一实施方案中，所收集的ω-oh脂肪酸为饱和ω-oh c10脂肪酸或其组合物。在一个实施方案中，所收集的ω-oh脂肪酸为不饱和ω-oh c8:1脂肪酸或其组合物。在另一实施方案中，所收集的ω-oh脂肪酸为饱和ω-oh c8脂肪酸或其组合物。在一个实施方案中，所收集的ω-oh脂肪酸为不饱和ω-oh c20:1脂肪酸或其组合物。在另一实施方案中，所收集的ω-oh脂肪酸为饱和ω-oh c20脂肪酸或其组合物。在一个实施方案中，所收集的ω-oh脂肪酸为不饱和ω-oh c22:1脂肪酸或其组合物。在另一实施方案中，所收集的ω-oh脂肪酸为饱和ω-oh c22脂肪酸或其组合物。