一种基于CRISPR/Cas9构建TLR2基因敲除小鼠动物模型的方法及其应用与流程

一种基于crispr/cas9构建tlr2基因敲除小鼠动物模型的方法及其应用
技术领域
1.本发明属于转基因技术领域，具体地涉及一种基于crispr/cas9构建tlr2基因敲除小鼠动物模型的方法及其应用。


背景技术：

2.tlr2基因编码的toll样受体2，在小鼠和人类单核细胞表面表达的先天免疫系统分子，并且在炎症反应(调节炎症因子的释放、迁移和浸润)和宿主防御微生物感染中发挥关键作用。tlr2参与识别各种细菌细胞壁成分，作为细菌脂蛋白的信号转导受体，导致炎症转录因子nf-kappab的核转位，tlr2通过刺激nf-kappab介导宿主对革兰氏菌和酵母的反应。tlr2敲除小鼠可用于免疫反应以及宿主对细菌内毒素的反应，以及多种人类疾病相关的研究，如莱姆病(伯氏疏螺旋体引起的细菌性传染病)、艰难梭菌感染(cdi)、克罗恩病和溃疡性结肠炎(炎症性肠病-ibd)、包括自身免疫性疾病、皮炎、胃肠道系统癌、肺部疾病和鼻炎等。
3.tlr2(toll样受体2)，具有脂磷壁酸结合活性和肽结合活性。参与多种进程，包括细胞成分组织的负调控、细胞因子产生的正向调节、高分子生物合成过程的正调控。作用于多个过程的上游或内部，包括模式识别受体信号通路、细胞因子产生的调节、以及对细菌的反应。位于质膜的外侧，toll样受体2-toll样受体6蛋白复合体的一部分。toll样受体(tlr)家族信号通路通过衔接蛋白myd88和il-1r相关激酶(irak)激活nf-kappab。tlr家族基因在哺乳动物中的作用也被认为作为模式识别受体(prr)参与先天免疫识别，如分别被tlr4和tlr2识别的脂多糖(lps)和脂磷壁酸(lta)。脂多糖(lps)是革兰氏阴性菌外膜的主要成分-prr可识别的病原体相关分子模式(pamp)之一。tlr2/tlr4通路与nf-b、mapk、pi3 k-akt、mtor等相关通路相互作用，调节il-1β、il-6、tnf-α、ccl2等促炎因子参与多种生理活动。如何快速准确的构建tlr2基因敲除小鼠动物模型，以促进相关疾病的研究，是目前急需解决的问题。


技术实现要素：

4.为了解决上述技术问题，本发明公开了一种基于crispr/cas9构建tlr2基因敲除小鼠动物模型的方法及其应用。
5.本发明的技术方案如下：
6.一种基于crispr/cas9构建tlr2基因敲除小鼠动物模型的方法，包括以下步骤：使用crispr/cas9技术敲除小鼠的tlr2基因的exon 3序列。
7.本发明利用crispr/cas9技术快速在小鼠体内将tlr2基因敲除，构建敲除小鼠模型。crispr/cas9是一种由sgrna指导，利用cas9核酸酶对靶向基因进行编辑的技术，其工作原理是crrna(crispr-derived rna)通过碱基配对与tracrrna(trans-activating rna)结合形成tracrrna/crrna复合物，此复合物会引导cas9蛋白在与crrna配对的序列靶位点剪
切双链dna，通过人工设计crrna和tracrrna两种rna，改造成具有引导作用的sgrna，从而引导cas9蛋白对dna的定点切割，并产生一个平末端的双链dna缺口，进而启动dna损伤修复机制，主要通过非同源末端连接(non-homologous end joining，nhej)或同源重组(homologous recombination，hr)的方式将断裂上下游两端的序列连接起来。
8.进一步的，上述一种基于crispr/cas9构建tlr2基因敲除小鼠动物模型的方法，所述tlr2基因的转录本为tlr2-201，号码为ensmust00000029623。
9.该基因共有3个外显子,起始密码子atg位于exon 3，终止密码子tag位于exon 3。
10.进一步的，上述一种基于crispr/cas9构建tlr2基因敲除小鼠动物模型的方法，包括以下步骤：使用两条sgrna；sgrna1靶向切割exon 3的5’端，sgrna2靶向切割exon 3的3’端。
11.cas9蛋白若要发挥作用需要靶位点下游的一个5
’‑
ngg-3’基序，即pam序列，基因特异的sgrna模板序列为位于pam序列前，同时sgrna序列避免4个以上的t结尾，gc含量最佳为30％～70％。另外在选择sgrna时应考虑到其脱靶效应，全基因的脱靶效应需考虑脱靶位点的碱基错配数尽量不超过5个。基于上述考虑，我们共设计了2条针对tlr2基因的grna，分别靶向exon 3的5’端和exon 3的3’端，可以高效的进行基因敲除。
12.进一步的，上述一种基于crispr/cas9构建tlr2基因敲除小鼠动物模型的方法，
13.sgrna1的序列为seq id no.1＝5
’‑
ggaggttcgcacacgctcggagg-3’；
14.sgrna2的序列为seq id no.2＝5
’‑
agaacttcgtacggagcgagtgg-3’。
15.经过精心设计和筛选，发现上述两段sgrna能够高效的敲除tlr2基因，脱靶率低。
16.进一步的，上述一种基于crispr/cas9构建tlr2基因敲除小鼠动物模型的方法，包括以下步骤：
17.1)敲除方案设计：选择tlr2基因敲除区域exon 3共1936bp序列，包含tlr2基因整个编码区的82.2％；
18.2)grna序列设计：根据小鼠tlr2基因的序列，设计并合成了2条针对该基因的grna序列，序列信息如下：
19.sgrna1的序列为seq id no.1＝5
’‑
ggaggttcgcacacgctcggagg-3’；
20.sgrna2的序列为seq id no.2＝5
’‑
agaacttcgtacggagcgagtgg-3’；
21.3)cas9/sgrna的显微注射：获得f0小鼠；
22.4)tlr2基因敲除小鼠的pcr鉴定：将鉴定正确的阳性小鼠与野生型小鼠交配获得f1小鼠，筛选纯合子，即为tlr2基因敲除小鼠动物模型。
23.上述敲除方案相比传统的同源整合方法，成功率大为提高。
24.进一步的，上述一种基于crispr/cas9构建tlr2基因敲除小鼠动物模型的方法，所述步骤3)包括以下步骤：
25.选取4-6周龄spf级雌性小鼠作为卵子供体，小鼠腹腔注射pmsg48h后注射hcg，随即与生殖能力正常的种公鼠进行交配，采集小鼠受精卵，消化洗涤之后置于37℃培养箱中待用，将cas9 mrna与人工合成的sgrna1和sgrna2混匀后通过显微注射至小鼠受精卵细胞核中，然后移植到代孕母鼠输卵管壶腹部中，代孕鼠每隔一周进行体重称量，初步判断是否怀孕，手术后19-21天仔鼠分娩，待仔鼠5天后剪尾编号并进行pcr检测。
26.上述方法可以在一个月内构建f0代小鼠，构建效率高，能够满足科研需要。
27.进一步的，上述一种基于crispr/cas9构建tlr2基因敲除小鼠动物模型的方法，所述步骤4)包括以下步骤：
28.根据tlr2基因敲除区域，分别在exon 3的5’端及3’端设计一对引物f1r1；我们对出生的f0小鼠进行pcr引物扩增并送测序，该引物在基因敲除小鼠中扩增的产物为640bp，野生型小鼠扩增产物为2567bp，将鉴定正确的阳性小鼠与野生型小鼠交配获得f1小鼠，小鼠出生14天后进行pcr扩增鉴定小鼠纯杂合，鉴定引物对为f1r2，纯合小鼠扩增产物为640bp，杂合小鼠扩增产物为640bp/2567bp，野生型小鼠扩增产物为2567bp。
29.上述鉴定方法便捷，成本低，灵敏度高。
30.进一步的，上述一种基于crispr/cas9构建tlr2基因敲除小鼠动物模型的方法，所述引物序列分别为：
31.f1＝seq id no.3＝5
’‑
ctttggctcttctggatcttggtg-3’；
32.r1＝seq id no.4＝5
’‑
ctccagatgttctaagtgaacagg-3’；
33.r2＝seq id no.5＝5
’‑
atctccagcaggaaagcagactc-3’。
34.上述引物能够快捷的鉴定出阳性小鼠，假阳性率低。
35.进一步的，上述一种基于crispr/cas9构建tlr2基因敲除小鼠动物模型的方法，测序引物的序列为seq id no.6＝5
’‑
ctccagatgttctaagtgaacagg-3’。
36.上述基于crispr/cas9构建tlr2基因敲除小鼠动物模型的方法在研究免疫反应以及抵御细菌反应的相关疾病机理中的应用。
37.本发明具有以下有益效果：
38.本发明设计了特异性靶向tlr2基因的两条sgrna，利用cas9蛋白将tlr2基因的exon 3敲除，所敲区域序列为非3倍数，造成移码突变，且敲除区域包含该基因编码区的82.2％，从而达到将该基因敲除的目的。使用crispr/cas9系统构建tlr2基因敲除小鼠模型方法简单易行，周期短，拿到阳性小鼠的概率高，利用该小鼠模型可以用于研究多种疾病的致病机理，并为进一步开发此类疾病的治疗方式提供服务。
附图说明
39.附图1为本发明tlr2基因敲除小鼠的构建方案示意图；图中深色区域表示敲除区域，实心矩形代表基因的外显子，knockout region代表sgrna的剪切区域；
40.附图2为本发明tlr2基因敲除小鼠的鉴定策略；图中显示了用于鉴定小鼠的pcr引物的结合位点；f1，r1，r2代表用于小鼠鉴定的引物结合区域；
41.附图3为本发明tlr2基因敲除小鼠的鉴定结果：利用pcr引物pcr primers1进行pcr筛选，基因敲除后的扩增产物:640bp；野生型的扩增产物:2567bp；左图为dna分子量标记，右图为pcr的鉴定产物图；pcr反应在50μl体系中扩增33个循环，taq dna聚合酶使用p112-01，使用的阴性对照为：water(不加dna模板)和wt(400ng小鼠基因组dna)；
42.附图4为tlr2基因敲除小鼠的基因组测序结果：箭头指示处tlr2基因被删除1936bp；
43.测序引物序列＝seq id no.6＝5
’‑
ctccagatgttctaagtgaacagg-3’。
具体实施方式
44.下面结合实例对本发明的方法做进一步说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常可按常规条件，如j.萨姆布鲁克(sambrook)等编写的《分子克隆实验指南》中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件进行。本领域相关的技术人员可以借助实施例更好地理解和掌握本发明。但是，实现本发明的方法不应限于本发明实施例所记载的具体方法步骤。
45.所述crispr/cas9试剂购自商业试剂盒。
46.实施例1
47.敲除方案设计：
48.根据需求，查找tlr2基因详细信息，选择基因敲除的区域尽可能包括基因的功能域部分，根据实际情况选择敲除区域，我们选择tlr2基因敲除区域exon3共1936bp序列，包含tlr2基因整个编码区的82.2％，如附图1所示。
49.实施例2
50.grna序列设计
51.根据小鼠tlr2基因的序列，设计并合成了2条针对该基因的grna序列，序列信息如下：
52.grna1的序列为seq id no.1＝5
’‑
gacctctcagctgcacgtggtgg-3’；
53.grna2的序列为seq id no.2＝5
’‑
ctacccccaagaattgcagaagg-3’。
54.实施例3
55.cas9/sgrna的显微注射
56.选取4～6周龄spf级雌性小鼠(cyagen)作为卵子供体，小鼠腹腔注射pmsg(孕马血清促性腺素)，48h后注射hcg(人血绒膜促性腺素)，随即与生殖能力正常的种公鼠进行交配，采集小鼠受精卵，消化洗涤之后置于37℃培养箱中待用。将cas9 mrna(20～200ng/μl)与人工合成的grna1和grna2(20～50ng/μl)混匀后通过显微注射至小鼠受精卵细胞核中，然后移植到代孕母鼠输卵管壶腹部中，代孕鼠每隔一周进行体重称量，初步判断是否怀孕，手术后19～21天仔鼠分娩，待仔鼠5天后剪尾编号并进行pcr检测。
57.实施例4
58.4.tlr2基因敲除小鼠的pcr鉴定
59.鉴定策略如附图2所示。
60.根据tlr2基因敲除区域，分别在exon 3的5’端及3’端设计一对引物f1r1；我们对出生的f0小鼠进行pcr引物扩增并送测序，测序结果如附图4所示；该引物在基因敲除小鼠中扩增的产物为640bp，野生型小鼠扩增产物为2567bp，将鉴定正确的阳性小鼠与野生型小鼠交配获得f1小鼠，小鼠出生14天后进行pcr扩增鉴定小鼠纯杂合，鉴定引物对为f1r2，纯合小鼠扩增产物为640bp，杂合小鼠扩增产物为640bp/2567bp，野生型小鼠扩增产物为2567bp。
61.所述引物序列分别为：
62.f1＝seq id no.3＝5
’‑
ctttggctcttctggatcttggtg-3’；
63.r1＝seq id no.4＝5
’‑
ctccagatgttctaagtgaacagg-3’；
64.r2＝seq id no.5＝5
’‑
atctccagcaggaaagcagactc-3’；
65.测序引物的序列为seq id no.6＝5
’‑
ctccagatgttctaagtgaacagg-3’。
66.小鼠pcr鉴定部位为鼠尾，对于鼠尾鉴定选择粗裂解的方法提取dna；pcr反应体系如下表1：
67.表1 pcr反应体系
[0068][0069]
pcr反应程序如下表2：
[0070]
表2 pcr反应程序
[0071][0072]
将pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结果如附图3所示，
[0073]
由以上实施例可知：本发明设计了特异性靶向tlr2基因的两条sgrna，利用cas9蛋白将tlr2基因的exon 3敲除，所敲区域序列为非3倍数，造成移码突变，且敲除区域包含该基因编码区的82.2％，从而达到将该基因敲除的目的。使用crispr/cas9系统构建tlr2基因敲除小鼠模型方法简单易行，周期短，拿到阳性小鼠的概率高，利用该小鼠模型可以用于研究多种疾病的致病机理，并为进一步开发此类疾病的治疗方式提供服务。
[0074]
以上仅为本发明的较佳实施例而已，不能以此限定本发明的保护范围，即大凡依本发明权利要求书及

技术实现要素：
所做的简单的等效变化与修改，皆仍属于本发明专利申请的保护范围。