氧化还原酶及其突变体在生物合成圆柚酮中的应用

本发明属于生物工程，特别涉及一种氧化还原酶及其突变体在生物合成圆柚酮中的应用。

背景技术：

1、圆柚酮(nootkatone，又称为诺卡酮)，是一种具有柚香气及略带苦味的倍半萜类化合物，在阿拉斯加雪松中首次被提取出来，并存在于葡萄柚和柑桔等植物中。纯的圆柚酮是白色至微黄色的晶体，被fda和epa批准用于调配圆柚、橙子、热带水果等食用香精和烟用香精。以喷雾形式存在的圆柚酮是一种有效的针对孤星蜱(lone star ticks)和鹿蜱(deerticks)的杀虫剂，此外对蚊子、臭虫、虱子等也具有很好的杀灭效果。因圆柚酮具有很好的挥发性，且对人类无毒，因而被认为是环境友好的杀虫剂。2014年，cdc正式批准两家公司可以生产圆柚酮类杀虫剂。此外，近年来研究发现圆柚酮具有抑制癌细胞增生和对神经炎症、阿尔茨海默病的潜在治疗作用，其研发引起了医药行业的浓厚兴趣，因而应用前景巨大。

2、圆柚酮作为倍半萜类化合物中的一种，化学结构复杂，使得其工业化大规模生产遭遇障碍。目前圆柚酮的生产方法主要有三种：物理提取法、化学合成法和生物催化转化法。以葡萄柚为原料通过蒸馏、萃取等工艺分离出来的圆柚酮，其有效浓度低、分离提纯等工序复杂、易受季节和气候变化的影响等问题的困扰，不能满足工业需求。目前，工业上最常用的方法是由相对廉价的前体物质瓦伦西亚烯(valencene)化学合成圆柚酮，但其氧化反应中使用的催化剂如三氧化铬、乙酰丙酮酸钴或其他一些重金属盐类，产生较多毒性废物，有悖于绿色发展理念。为了满足圆柚酮愈发增长的市场需求，利用生物催化转化方法不受原料的限制、可以避免在植物萃取过程中带来的高能耗、低产量及环境污染等问题，具有很大的优势。

3、近年来，微生物的代谢工程取得了重大进展。构建高效的微生物细胞工厂，提高其生理性能，有望将较为廉价的原料底物高效转化为高附加值的目标产品，大幅度降低微生物发酵的生产成本。在酵母和大肠杆菌等微生物中构建相关酶的异源表达来生产圆柚酮备受关注。研究人员从c.sinensis中分离出瓦伦西亚烯合成酶基因，在大肠杆菌中能有效进行地功能表达，也可用于后续生产圆柚酮(chappell j.et al.novel sesquiterpenesynthase gene and protein:us,us20120196340 a1[p].2006.)。进一步发现来源于p.sapidus的瓦伦西亚烯双加氧酶(valox)在大肠杆菌的细胞质中表达，通过中间体过氧化氢将瓦伦西亚烯转化为圆柚醇和圆柚酮(zelena k.et al.functional expression of avalencene dioxygenase from pleurotussapidus in e.coli[j].bio tec,2012,108:231-239.)。模式生物酵母是目前最常用的基因表达宿主之一，其培养条件简单，遗传背景清晰，易于进行基因改造，其中海洋酵母对醋酸、甲酸、糠醛、香草醛和盐等抑制性化合物的存在比陆地酵母明显更耐受，其中耐受度最高的海洋嗜杀酵母是wickerhamomycesanomalus m15，其耐盐性是酿酒酵母ncyc2592 1.6倍(greetham d.et al.exploring thetolerance of marine yeast to inhibitory compounds for improving bioethanolproduction[j].sustainable energy&fuels,2019,3(3).)。因此，利用基因工程手段，进一步获得高效且具有环境耐受特性的圆柚醇脱氢酶仍是本技术领域的当务之急。

4、ncbi收录了一种来源于海洋嗜杀酵母(wickerhamomyces anomalus nrrl y-366-8)的假定蛋白，原名为wicandraft_92107(ncbi登录号为xp_019039214.1)，共包含264个氨基酸；其编码基因(ncbi登录号为xm_019186339.1)的核苷酸序列共包含795个核苷酸。至今，未见有文献报道该蛋白任何实际的功能和应用。

技术实现思路

1、为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种氧化还原酶及其突变体在生物合成圆柚酮中的应用，旨在解决生物合成圆柚酮过程中现有醇脱氢酶所能耐受的底物浓度低、转化率低及耐盐性较差和在工业生产上不理想的问题。

2、本发明首次从海洋嗜杀酵母(wickerhamomyces anomalus m15)中获得对圆柚醇具有较高转化能力的氧化还原酶，通过定点突变获得了更高能力的氧化还原酶突变体。

3、本发明的目的通过下述技术方案实现：

4、本发明提供一种氧化还原酶和/或其突变体在生物合成圆柚酮中的应用。

5、本发明中，所述氧化还原酶来源于海洋嗜杀酵母(wickerhamomyces anomalusm15)的nrrl，其氨基酸序列如seq id no.2所示，共包含264个氨基酸。

6、本发明中，所述氧化还原酶nrrl编码基因的核苷酸序列如seq id no.1所示，共包含795个核苷酸。

7、进一步的，氧化还原酶nrrl编码基因经密码子优化后的核苷酸序列如seq idno.3所示。

8、本发明还涉及一种氧化还原酶突变体，其氨基酸序列为seq id no.2的第69位和第136位氨基酸中的一个或两个位点突变而得；进一步的，第69位氨基酸由赖氨酸k突变为苏氨酸t，第136位氨基酸由甘氨酸g突变为精氨酸r或丙氨酸a；

9、更进一步的，所述的氧化还原酶突变体，氨基酸序列为seq id no.2的第69位氨基酸由赖氨酸k突变为苏氨酸t，第136位氨基酸由甘氨酸g突变为精氨酸r，具体氨基酸序列如seq id no.4所示。

10、优选的，所述的氧化还原酶突变体中，编码seq id no.2所示氨基酸序列的基因序列如seq id no.3所示。

11、在本发明另一方面，所述的氨基酸序列seq id no.2经修饰、缺失或添加一或几个氨基酸获得氨基酸序列，且保持只有90％的同源性的序列也在本发明的保护范围内。

12、本发明中，提供了一种含有所述的氧化还原酶及其突变体编码基因的重组表达载体；优选的，所述重组载体为所述的氧化还原酶及其突变体与2μ型高拷贝质粒yep352进行重组得到的重组表达载体。

13、本发明中，提供了一种包含本发明所述的氧化还原酶及其突变体编码基因的重组表达载体的重组表达细胞；优选的，所述重组表达细胞为含有所述具有氧化还原酶及其突变体与载体重组得到的重组表达载体再转化至宿主细胞得到的重组表达细胞。宿主细胞，本发明优选酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)，更优选酿酒酵母cen.pk2-1 ca菌株。

14、本发明中，还涉及用于制备圆柚酮的方法。

15、本发明中，提供了两种利用包含本发明所述氧化还原酶及其突变体编码基因的重组表达载体的重组表达细胞来实现圆柚酮的生物合成。

16、一种为全细胞体外催化方法，即通过外源添加前体物质圆柚醇并利用本发明所述的重组表达细胞进行体外转化以得到圆柚酮。所述反应底物为圆柚醇。

17、本发明所述的转化效率，表示为在一定时间内将前体物质圆柚醇转化为目标产物圆柚酮的比例。

18、另一种方法中，圆柚酮以生物发酵(即，通过在含有培养基的反应器中培养表达相关酶的重组表达细胞)制备。

19、在一个优选实施例中，宿主细胞是真核细胞，特别地选自酿酒酵母cen.pk2-1 ca菌株(saccharomyces cerevisiae cen.pk2-1 ca)。已经利用专利申请号201910271558.6所述技术，对该宿主细胞进行了基因组改造，包括敲除了甲羟戊酸途径的限制因子rox1，并下调了倍半萜类物质前体fpp的下游支路途径相关酶erg9的表达强度，来提高前体物质fpp的供应量。并利用国际专利申请号pct/nl2010/050848所述来源于黄扁柏(chamaecyparisnootkatensis)的瓦伦西亚烯合成酶valc将fpp转化为圆柚酮前体物质瓦伦西亚烯。随后利用专利wo 2006/079020所述的来源于纯天仙子(hyoscyamus muticus)的细胞色素p450单加氧酶(cytochrome p450 monooxygenase，cyp450)hpo和urban,pd等人在1997年文章中描述的来源于拟南芥(arabidopsis thaliana)的细胞色素还原酶atcpr(urban,p.,etal.cloning,yeastexpression,and characterization of the coupling of twodistantly relatedarabidopsis thaliana nadph-cytochrome p450 reductases withp450 cyp73a5.j.biol.chem.1997,272,19176–19186.)，将瓦伦西亚烯进一步氧化为圆柚醇。进而利用本发明所述的氧化还原酶或其突变体将圆柚醇转化为最终所需产物圆柚酮。

20、本发明还保护所述氧化还原酶及其突变体作为圆柚醇脱氢酶在生物合成圆柚酮中具有高耐盐性的用途。

21、本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

22、(1)本发明提供了一个海洋嗜杀酵母(wickerhamomyces anomalus m15)来源的氧化还原酶nrrl，该酶是首次发现的海洋嗜杀酵母来源的以圆柚醇作为底物的氧化还原酶。同时，本发明也在国内外首次公开了氧化还原酶nrrl及其突变体在催化圆柚醇合成圆柚酮中的应用。

23、(2)本发明为通过体外酶催化方式合成圆柚酮提供了条件，实现以绿色、高效的方式催化圆柚醇合成相应的圆柚酮。克服了通过物理提取法或者化学合成方法获得圆柚酮时，存在产量低、效率低、操作繁琐、环境污染严重、成本高的缺陷。

24、(3)与现有的能够催化圆柚醇的氧化还原酶相比，nrrl及其突变体具有良好的底物耐受度、转化率高及高耐盐性。相较已发现的来源于柑橘的aba2(ncbi登录号为hm036684.1)圆柚醇脱氢酶的效果明显更优。结果显示在相同条件下，利用本发明所述的氧化还原酶得到的底物目标转化率更高，分别为柑橘的aba2的近3.8倍之多。另外，本发明所提供的部分圆柚醇脱氢酶突变体，在同等条件下对圆柚醇转化效率可以是序列表seq idno.2所示的氧化还原酶近2.4倍之多，具有更好的对底物耐受性，且在不同浓度(6％、9％、12％、15％、18％(w/v))的nacl中的耐受性有所提高。

25、(4)本发明将为圆柚酮合成提供一种重要的工具酶，将为圆柚酮的合成工业带来巨大的经济效益。